·552 北京科技大学学报 第35卷 肥料3-列.土壤中钾含量是影响烟草产量的重要因 源的选择性培养基上筛选解钾细菌.具体步骤为： 素，而烟草中含钾量又是烟叶品质的重要元素之一 将土壤样本梯度稀释，稀释液涂布到含有筛选培养 .因此，在产量和品质高的烟草种植区取得的土 基的平板上，置于恒温培养箱中，35℃下培养3d 样中，更易于获得高效的解钾细菌.同时，解钾细菌 后，选取生长量大、菌落周围有透明圈的菌种作为 的发酵水平普遍偏低，也制约了其作为生物肥料用 解钾细菌，挑取单菌落进行划线分离，得到纯种单 于工业生产，因此如何在发酵过程中降低成本、提 菌落后将菌种保藏 高效率对生物钾肥在农业生产中的推广应用有着积 1.3.2解钾细菌的活性测定 极意义 观察划线培养得到的单菌落，选取生长旺 本实验在成功从四川省广元市的烟草种植区 盛、透明圈大且明显的四个菌种(GJ05,GJ06, 筛选出10株解钾细菌的基础上，对其中四种透明 GJ07,GJ10)进行活性测定.挑取平板上获得的单 圈明显且生长量较大的菌种进行钾活性鉴定，选取 菌落接种到LB培养基中，30℃下摇瓶培养1d,作 其中活性最强的GJ07菌株进行16 SrDNA鉴定，并 为种子.在300mL锥形瓶中加入0mL筛选培养 采用批量发酵培养，通过改变碳源、氮源、碳氨比、 基（液体，不加琼脂）.于115℃下灭菌30min,冷却 温度、pH值和装液量等方法研究了解钾细菌GJ07 后在每个锥形瓶中接入0.5mL的种子培养液，每 生长的优化控制条件，以期进一步降低成本，提高 个菌种做三个平行样，同时制备出不接菌的空白对 效益，促进解钾细菌菌肥工业化生产进程 照样本，同时置于摇床上，在28℃下进行振荡培养 1 实验材料与方法 5d,振荡转速为200r-m-1.将获得的发酵液置于 水浴锅浓缩至10mL左右，加入6%（体积分数）的 1.1土壤与菌种 H2O2,继续蒸煮，同时不断搅拌，如此反复处理， 本实验组土壤样品取自四川省广元市的烟草 直到解钾细菌黏液消失为止.然后将处理后的液体 种植区，取样地点均为种植烟草时间在十年以上， 过滤，收集滤液，转移到50mL容量瓶中，定容， 且烟草质量、产量都较高的种植区 最后使用火焰分光光度法测定菌液中K+离子的质 实验所用的解钾细菌均是由上述烟草种植区 量浓度 的烟草根际土壤中分离纯化得到，分别命名为GJ01 1.3.3解钾细菌的16 S rDNA鉴定 GJ10. 将欲进行序列测定的菌种挑取单菌落至锥形 1.2培养基 瓶中进行培养，得到纯菌种发酵液后，以全基因 LB(Luria-Bertani)培养基：胰蛋白胨(Ig),酵 组DNA提取试剂盒（生工生物工程（上海）有 母浸粉(0.5g),NaC(1g),去离子水(100mL),调 限公司)提取DNA,以其作为模版进行聚合酶链 节初始pH值为7.00. 式反应(polymerase chain reaction,PCR),使用 筛选培养基：蔗糖(10g),酵母膏(0.5g), Taq DNA聚合酶扩增16 S rDNA,引物为27F (NH4)2S04(1g),Na2HPO4(2g),MgS047H2O(0.5 (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3).1492R(5'- g),CaCO3(1g),钾长石粉(1g,其中K20质量分 GGTTACCTTGTTACGACTT-3).循环参数为： 数为9.60%)，琼脂(15g),去离子水(1L),调节初 95℃下预变性5min:95℃下变性30s,58℃下 始pH值为7.00. 退火20s,72℃下延伸60s.往复循环30次：最 培养优化培养基：KH2PO4(1g),MgSO4(0.2后在72℃下延伸10min得到扩增后的DNA样 g),NaCl(5g),柠檬酸铁铵(0.02g),去离子水(1本.将聚合酶链式反应扩增产物经凝胶回收试剂 .以葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖、乙醇和甘油为盒（生工生物工程（上海）有限公司)纯化，送交测 备选碳源，牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉、硫酸铵和 序公司（北京三博远志生物技术有限责任公司）测 硝酸钠为备选氨源，通过批量培养试验确定最佳碳序.将测得的序列在NCBI(美国国立生物技术信息 源、氯源以及碳氮比.本实验中所有培养基使用前 中心，National Center for Biotechnology Information) 均在115℃下高压灭菌30min. 上用BLAST(basic local alignment search tool)进行 1.3研究方法 比对，并使用ClustalX、NEGA4.1等软件进行系统 1.3.1解钾细菌的筛选 发育分析，构建分子进化树，以获得菌种的分类信息. 将从四川省广元市取得的土壤样本在生理盐 1.3.4批量培养碳源和氮源的选择与优化 水中稀释，使用稀释涂板法在以钾长石粉为唯一钾 在250mL锥形瓶中进行摇瓶培养，备选碳源· · 北 京 科 技 大 学 学 报 第 卷 肥料 ”一 土壤中钾含量是影响烟草产量 的重要 因 素, 而烟草 中含钾量又是烟叶品质 的重要元素之一 因此 , 在产量和品质高的烟草种植区取得的土 样中, 更易于获得高效的解钾细菌 同时, 解钾细菌 的发酵水平普遍偏低, 也制约了其作为生物肥料用 于工业生产 , 因此如何在发酵过程 中降低成本 、提 高效率对生物钾肥在农业生产中的推广应用有着积 极意义 本实验在成 功从四川省广 元市的烟草 种植 区 筛选 出 株解钾细菌 的基础上 , 对其中四种透 明 圈明显且生长量较大的菌种进行钾活性鉴定, 选取 其 中活性最强的 菌株进行 鉴定, 并 采用批量发酵培养 , 通过改变碳源 、氮源 、碳氮比 、 温度 、 值和装液量等方法研究了解钾细菌 生长的优化控制条件 , 以期进一步 降低成本, 提高 效益 , 促进解钾细菌菌肥工业化生产进程 实验材料与方法 土壤与菌种 本 实验组土壤样品取 自四川省广元市的烟草 种植区, 取样地 点均为种植烟草时间在十年 以上 , 且烟草质量 、产量都较高的种植区 实验所用 的解钾细菌均是 由上述烟 草种植 区 的烟草根际土壤 中分离纯化得到, 分别命名为 培养基 培养基 胰蛋白陈 , 酵 母浸粉 , , 去离子水 , 调 节初始 值为 筛选培养基 蔗糖 , 酵母膏 , , , · , , 钾长石粉 , 其 中 质量分 数为 , 琼脂 , 去离子水 , 调节初 始 值为 培养优化培养 基 , , , 柠檬酸铁按 , 去离子水 以葡萄糖 、 可溶性淀粉 、 蔗糖 、 乙醇和甘油为 备选碳源 , 牛 肉膏 、蛋 白脉 、 酵母浸粉 、硫酸钱和 硝酸钠为备选氮源 , 通过批量培养试验确定最佳碳 源 、 氮源 以及碳氮 比 本实验中所有培养基使用前 均在 ℃下高压灭菌 研究方法 解钾细菌的筛选 将从 四川省广元 市取得的土壤样 本在生理盐 水中稀释, 使用稀释涂板法在 以钾长石粉为唯一钾 源的选择性培养基上筛选解钾细菌 具体步骤为 将土壤样本梯度稀释 , 稀释液涂布到含有筛选培养 基 的平板上 , 置于恒温培养箱中, ℃下培养 后 , 选取生长量大 、菌落周 围有透 明圈的菌种作为 解钾细菌 , 挑取单菌落进行划线分离 , 得到纯种单 菌落后将菌种保藏 解钾细菌 的活性测定 观察划 线培 养得 到的单 菌落 , 选取 生长 旺 盛 、 透 明圈大且 明显的四个菌种 , , , , 进行活性测定 挑取平板上获得的单 菌落接种到 培养基中, ℃下摇瓶培养 , 作 为种子 在 锥形瓶中加入 , 筛选培养 基 液体, 不加琼脂 , 于 ℃下灭菌 , 冷却 后在每个锥形瓶中接入 的种子培养液 , 每 个菌种做三个平行样 , 同时制备出不接菌的空 白对 照样本, 同时置于摇床上, 在 ℃下进行振荡培养 , 振荡转速为 二 一' 将获得的发酵液置 于 水浴锅浓缩 至 左右 , 加入 体积分数 的 , 继续蒸煮 , 同时不 断搅拌 , 如此反复处理 , 直到解钾细菌豁液消失为止 然后将处理后 的液体 过滤 , 收集滤液 , 转移到 , 容量瓶 中, 定容 , 最后使用火焰分光光度法测定菌液 中 离子的质 量浓度 解钾细菌的 鉴定 将欲进行序列测 定的菌种挑取 单菌落至锥形 瓶中进行培 养, 得到纯菌种发酵液后 , 以全基 因 组 提取试剂盒 生 工生物 工程 上海 有 限公司 提取 , 以其作为模版进 行聚合酶链 式反应 , , , 使用 聚 合酶扩 增 , 引物为 `一 一` 、 ` 一' 循环参数为 下预变性 下变性 、, 下 退火 , ℃下延伸 、 往复循环 次 最 后在 ℃下延伸 得到扩增 后的 样 本 将聚合酶链式 反应扩 增产物 经凝胶 回收试剂 盒 生工生物工程 上海 有 限公司 纯化, 送交测 序公司 北京三博远志生物技术有限责任 公司 测 序 将测得的序列在 美 国国立生物技术信息 中心, , 、 , 、 上用 , , 进行 比对 , 并使用 、 等软件进行系统 发育分析, 构建分子进化树, 以获得菌种的分类信息 批量培养碳源和氮源的选择与优化 在 锥形瓶 中进行摇瓶培养, 备选碳源