第4期 刘晓璐等：解钾细菌的筛选、鉴定以及高效培养 ,553 为葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖、乙醇和甘油，备选 (Paenibacillus mucilaginosus,NR028675.1)作为外 氮源为牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉、硫酸铵和硝酸 群，使用ClustalX2.0、MEGA4.1等软件绘制系统 钠.通过设计组合的实验，确定培养该解钾细菌的 进化树，进行分子系统发育分析，进而可直观的观 最佳碳源、氨源及碳氮比，碳源按照总碳质量浓度 察几种菌之间的进化关系以及分类信息，如图2所 为4.2gL-1的量（以蔗糖质量浓度为10gL-1折 示.由图2可以看出，GJ07与巨大芽孢杆菌(Bacil. 算)分别加入，氮源按照总氮质量浓度为0.21gL1 s megaterium,AB738784.1)聚成一分支，二者序列 的初始量（初始碳氮质量比为20：1）分别加入可，每 相似性最高，表明GJ07与巨大芽孢杆菌的亲缘关 组均设三个平行实验 系最近.将测得的GJ07的16 S rDNA提交到NCBI 1.3.5批量培养控制条件优化 的GenBank,获得核酸序列登录号(accession num- 设计单因素实验，通过摇瓶培养，研究不同初 ber)为KC197742. 始pH值、装液量和培养温度等因素对解钾活性最 45 强的解钾细菌(GJ07)生长的影响.接种培养48h 后，.取样在722S型分光光度计上测定680nm处光 5 密度(OD68nm值)以示其生长状况. 25 2结果与讨论 10 2.1筛选结果 5 从四川省广元市长期种植烟草的土壤中筛选 0 空白组GJ05 GJ06 GJ07 GJ10 出十种解钾细菌，分别命名为GJ01GJ10.通过 菌种编号 计数发现，每克干土壤中可筛选到的解钾细菌数量 图1不同种群解钾细菌及空白溶液中K+离子的含量 集中在(711)×105之间，与崔俊峰等8在每克环 Fig.1 K+contents in the solutions of different strains of 神农架烟区烤烟根际土壤中筛选到约7×10个解 potassium-releasing bacteria and blank control 钾细菌接近.栾丽英等9从每克葡萄树根区土壤不 关于巨大芽孢杆菌作为微生态制剂的研究己 同土层中最多可筛选到约2.5×106个解钾细菌，低 有报道，通常认为巨大芽孢杆菌具有较强的解磷能 于本实验组由烟草种植区筛选到的解钾细菌数量. 力1-13).除此之外，陈阳4在田间接种试验中发 2.2解钾活性测定结果 现，所筛选的巨大芽孢杆菌可提高扬柴植株的平均 不同种群解钾细菌发酵液中K+离子的含量 株高和发芽率：陈德元等5发现他们从水稻根际土 如图1所示.由图1可以看出，四种细菌发酵液 壤中筛选到的巨大芽孢杆菌具有较强的固氮能力. (GJ05,GJ06,GJ07,GJ10)的处理液中K+离子 由此可见，巨大芽孢杆菌作为微生物肥料具有较高 的含量明显高于空白对照组，其中GJ07活性最强， 的研究价值.本实验组所筛选的巨大芽孢杆菌可使 处理液中K+离子质量浓度可达到37.47mgL-1, 发酵液中K+离子质量浓度高出空白组约54.5%， 较空白组(K+离子质量浓度为24.25mgL-1)高约 是较理想的微生物肥料备用菌株. 54.5%.另外，在培养过程中发现，GJ07可产芽孢 2.4不同碳源、氨源以及碳氮比对GJ07生长的 由于芽孢具有极强的抗逆性，且易保藏，复活率高， 影响 因此是制备微生态制剂较为理想的存在形式10].综 图3(a)为采用不同碳源培养下GJ07的生长情 合上述因素，本实验选取GJ07进行其分类地位和 况.由图可以看出，GJ07可利用的碳源非常广泛， 高密度培养的研究. 除乙醇以外，葡萄糖、蔗糖、甘油和可溶性淀粉均 2.316 S rDNA鉴定结果 可作为较良好的碳源被GJ07利用，其中以蔗糖为 使用NCBI的BLAST功能，将测序获得的 碳源的培养基中，GJ07生长量相对稍高(OD68Omm DNA序列与Genebank(核酸序列数据库)中已有序 值可达5.63)，因此把蔗糖作为GJ07的最优碳源 列进行比对，发现GJ07与巨大芽孢杆菌相似性高 通常情况下，葡萄糖较易被细菌利用，但由于其在 达99.8%以上.为进一步确定GJ07的分类学位置， 代谢过程中大量产酸，使培养基的pH值快速降 从Genebank中选取常见的芽孢杆菌属细菌的16S 低，此时就不适宜GJ07生长，最终难以获得最高 tDNA基因序列，并选取相近属的胶质假芽孢杆菌 的生长量，第 期 刘晓璐等 解钾细菌的筛选 、鉴定以及高效培养 · · 为葡萄糖 、可溶性淀粉 、蔗糖 、 乙醇和甘油, 备选 氮源为牛肉膏 、蛋 白陈 、酵母浸粉 、硫酸钱和硝酸 钠 通过设计组合 的实验, 确定培养该解钾细菌的 最佳碳源 、氮源及碳氮 比 碳源按照总碳质量浓度 为 ·一`的量 以蔗糖质量浓度为 ' 一`折 算 分别加入 , 氮源按照总氮质量浓度为 ·一` 的初始量 初始碳氮质量比为 分别加入 , 每 组均设三个平行实验 批量培养控制条件优化 设计单因素实验 , 通过摇瓶培养 , 研 究不同初 始 值 、装液量和培养温度等因素对解钾活性最 强的解钾细菌 生长的影响 接种培养 后, 取样在 型分光光度计上测定 处光 密度 值 以示其生长状况 乞乙 乞“ 乞 , 作为外 群 , 使用 、 等软件绘制系统 进化树 , 进行分子系统发育分析, 进而可直观 的观 察几种菌之 间的进化关系 以及分类信息, 如图 所 示 由图 可以看出, 与 巨大芽抱杆菌 兹 俪 俪 , 聚成一分支, 二者序列 相似性最高, 表 明 与 巨大芽饱杆菌 的亲缘关 系最近 将测得的 的 提交到 的 , , 获得核酸序列登录号 为 一 结果与讨论 筛选结果 从 四川省广元市长期种植烟草 的土壤 中筛选 出十种解钾细菌 , 分别命名为 、 通过 计数发现 , 每克干土壤中可筛选到的解钾细菌数量 集 中在 、 “之 间, 与崔俊峰等 在每克环 神农架烟区烤烟根际土壤 中筛选到约 个解 钾细菌接近 栗丽英等 从每克葡萄树根区土壤不 同土层中最多可筛选到约 “个解钾细菌 , 低 于本实验组由烟草种植区筛选到的解钾细菌数量 解钾活性测定结果 不 同种群解钾细菌发酵液 中 离子的含量 如图 所示 由图 可以看 出, 四种细菌发酵液 , , , 的处理液 中 离子 的含量明显高于空 白对照组, 其中 活性最强 , 处理液中 离 子质量浓度可达到 ' 一`, 较空 白组 离子质量浓度为 ·一` 高约 另外 , 在培养过程中发现 , 可产芽抱 由于芽抱具有极强的抗逆性, 且易保藏 , 复活率高 , 因此是制备微生态制剂较 为理想的存在形式 `。 综 合上述因素, 本实验选取 进行其分类地位和 高密度培养的研究 · 鉴定结果 使用 的 功能 , 将测序获得 的 序列与 核酸序列数据库 中已有序 列进行 比对, 发现 与巨大芽抱杆菌相似性高 达 以上 为进一步确定 的分类学位置, 从 中选取常见的芽抱杆菌属细菌的 基 因序列, 并选取相近属的胶质假芽抱杆菌 空 白组 菌种编号 鸽逛锐喇名斗褪于赵受昌︵︸︶十呼口 图 不同种群解钾细菌及空白溶液中 离子的含量 一 关于 巨大芽抱杆菌作为微生态制剂 的研究 己 有报道, 通常认为 巨大芽抱杆菌具有较强的解磷能 力 卜 ` 除此之外 , 陈阳 在 田间接种试验 中发 现 , 所筛选的巨大芽抱杆菌可提高扬柴植株的平均 株高和发芽率 陈德元等 发现他们从水稻根际土 壤中筛选到的 巨大芽抱杆菌具有较强 的固氮能力 由此可见 , 巨大芽抱杆菌作为微生物肥料具有较高 的研究价值 本实验组所筛选 的巨大芽抱杆菌可使 发酵液 中 离子质量浓度高出空白组约 , 是较理想 的微 生物肥料备用菌株 不同碳源 、氮源 以及碳氮 比对 生长的 影响 图 为采用不同碳源培养下 的生长情 况 由图可 以看 出, 可利用的碳源非常广泛 , 除乙醇以外 , 葡萄糖 、蔗糖 、甘油和可溶性淀粉均 可作为较 良好的碳源被 利用 , 其中以蔗糖 为 碳源的培养基 中, 生长量相对稍 高 。 值可达 , 因此把蔗糖作为 的最优碳源 通常情况下, 葡萄糖较易被细菌利用 , 但由于其在 代谢过程中大量产酸, 使培养基的 值快速 降 低 , 此时就不适宜 生长 , 最终难 以获得最高 的生长 量