解钾细菌的筛选、鉴定以及高效培养

D0I:10.13374/i.issn1001-053x.2013.04.002 第35卷第4期 北京科技大学学报 Vol.35 No.4 2013年4月 Journal of University of Science and Technology Beijing Apr.2013 解钾细菌的筛选、鉴定以及高效培养 刘晓璐，刘永智)，郭涛》，吕乐)，许倩倩)，尹春华”，李慧梅，闫海) 1)北京科技大学化学与生物工程学院，北京1000832)山东省农业科学院水稻研究所，济南250100 通倍作者，E-mail:haiyans@ustb.edu.cn 摘要从烟草根际土壤中成功筛选出10株解钾细菌，并选择其中四种透明圈明显且生长量较大的菌种进行了解钾活 性测定，其中解钾细菌GJ07的发酵液中K+离子质量浓度高出空白对照组54.5%.对GJ07进行16 SrDNA的鉴定，确 定其为巨大芽孢杆菌.采用批量发酵培养，通过改变碳源、氮源、碳氮比、温度、pH值、装液量等研究了解钾细南GJ07 生长的优化控制条件.结果表明蔗糖和蛋白胨为GJ07生长的最佳碳源和氮源（碳氮质量比为10：1），最适宜生长温度为 35℃，最适宜初始pH值为7.00，最佳装液量为25mL. 关键词细菌：钾：培养；发酵：巨大芽孢杆菌 分类号Q815 Isolation,identification and high-efficiency cultivation of potassium- releasing bacteria LIU Xiao-Hu).LIU Yong-zhi),GUO Tao2),LU Le),XU Qian-gian),YIN Chun-hua),LI Hui-mei). YAN Hail) 1)School of Chemistry and Biological Engineering,University of Science and Technology Beijing,Beijing 100083,China 2)Shandong Rice Research Institute,Shandong Academy of Agriculture Sciences,Jinan 250100.China Corresponding author,E-mail:haiyan@ustb.edu.cn ABSTRACT Ten strains of potassium-releasing bacteria were isolated from the tobacco rhizosphere soil.Four strains with an obvious transparent zone and high efficiency proliferation were selected to investigate their potassium-releasing capacity.The K+mass concentration in the fermentation broth of the strain GJ07 is 54.5%higher than that of the blank control group.The strain GJ07 was identified as Bacillus megaterium by the identification of 16S rDNA analysis. The batch culture conditions of the strain GJ07 were optimized via adjusting carbon sources,nitrogen sources,carbon- to-nitrogen mass ratio,temperature,pH values and loading liquid.It is found that sucrose is the best carbon source. peptone is the optimal nitrogen source.the optimal carbon-to-nitrogen mass ratio is 10:1.the best temperature and initial pH value are 35 C and 7.00 respectively,and the optimal loading liquid is 25 mL. KEY WORDS bacteria;potassium;cultivation:fermentation:Bacillus megaterium 钾是农作物营养三要素之一，它以酶的活化剂 K2O计)，最高可达4.0%，但绝大多数是以硅酸盐 形式显著影响作物的生长代谢过程.随着农业种 矿物的形式存在于土壤中而不能被植物所吸收利 植技术的改进，作物产量以及复种指数不断提高， 用2 土壤中钾元素消耗量显著增加，缺钾地区日益增 目前，随着绿色农业的兴起和发展，微生物肥 多，土壤中钾元素含量的缺乏已成为制约我国农 料的研究与应用日益受到人们的重视.解钾细菌也 作物持续高产的因素之一叫.虽然我国土壤中可 称硅酸盐细菌，是从土壤中分离出的一种能够分解 被农作物直接利用的钾元素量不足，但土壤中总的 钾长石，磷灰石等不溶性岩石矿物，活化土壤中钾、 钾元素并不少，其质量分数一般为1.0%~2.5%（以 磷、镁、硅等一些矿物元素的细菌，可作为微生物 收稿日期：201201-15

第 卷 第 期 年 月 北 京 科 技 大 学 学 报 解钾细菌的筛选 、鉴定以及高效培养 刘晓璐 `, 刘永智 `, 郭 涛 , 吕 乐`, 许倩倩 `, 尹春华 `, 李慧梅 `, 闰 海 `只 北京科技 大学化学与生物工程学院, 北京 山东省农业科学院水稻研究所 , 济南 匕 通信作者 , 一 ￡ 摘 要 从烟草根际土壤中成功筛选出 株解钾细菌, 并选择其中四种透明圈明显且生长量较大的菌种进行了解钾活 性测定 , 其中解钾细菌 的发酵液中 十离子质量浓度高出空白对照组 对 进行 的鉴定, 确 定其为巨大芽抱杆菌 采用批量发酵培养, 通过改变碳源 、氮源 、碳氮比、温度 、 值 、装液量等研究了解钾细菌 生长的优化控制条件 结果表 明蔗糖和蛋 白陈为 生长的最佳碳源和氮源 碳氮质量比为 , 最适宜生长温度为 ℃, 最适宜初始 值为 , 最佳装液量为 关键词 细菌 钾 培养 发酵 巨大芽抱杆菌 分类号 , 一 五丁 瓜 一, “ 五 ` 为 。一人乞, , 几 , 石口乙。`, 百 一、` , `, , 万战 ,, 一人。 `, 石 战 一。 , , 乍且 , 升〕 、 , , , , , , 丁 飞 , , 三 〔 , 一 , 月 , ￡ 肠 一 、 一 〔 十 一飞 一 王 、 企 。 , 祝 ” 印 。八祝 、 , , 生。 一 , 一 ` , , 卜 一 、 , 一 , 祝 印 钾是农作物营养三要素之一 , 它以酶的活化剂 形式显 著影 响作物 的生长代谢过程 随着农业种 植技术 的改进, 作物产量 以及复种指数不断提高, 土壤 中钾 元素 消耗量显著增加 , 缺钾地区 日益增 多, 土壤 中钾元素含量的缺乏 己成为制约我 国农 作物持续高产 的因素之一 虽然我 国土壤 中可 被农作物直接利用 的钾元素量不足 , 但土壤中总的 钾元素并不少, 其质量分数一般为 。 以 计 , 最高可达 , 但绝大多数是以硅酸盐 矿物 的形式存在于土壤 中而不 能被植物所吸收利 用 目前, 随着绿色农业 的兴起和发展 , 微生物肥 料的研究与应用 日益受到人们的重视 解钾细菌也 称硅酸盐细菌, 是从土壤中分离 出的一种能够分解 钾长石 、磷灰石等不溶性岩石矿物 , 活化土壤中钾 、 磷 、镁 、硅等一些矿物元素的细菌, 可作为微生物 收稿 日期 一 一 DOI :10.13374/j .issn1001 -053x.2013.04.002

·552 北京科技大学学报 第35卷 肥料3-列.土壤中钾含量是影响烟草产量的重要因 源的选择性培养基上筛选解钾细菌.具体步骤为： 素，而烟草中含钾量又是烟叶品质的重要元素之一 将土壤样本梯度稀释，稀释液涂布到含有筛选培养 .因此，在产量和品质高的烟草种植区取得的土 基的平板上，置于恒温培养箱中，35℃下培养3d 样中，更易于获得高效的解钾细菌.同时，解钾细菌 后，选取生长量大、菌落周围有透明圈的菌种作为 的发酵水平普遍偏低，也制约了其作为生物肥料用 解钾细菌，挑取单菌落进行划线分离，得到纯种单 于工业生产，因此如何在发酵过程中降低成本、提 菌落后将菌种保藏 高效率对生物钾肥在农业生产中的推广应用有着积 1.3.2解钾细菌的活性测定 极意义 观察划线培养得到的单菌落，选取生长旺 本实验在成功从四川省广元市的烟草种植区 盛、透明圈大且明显的四个菌种(GJ05,GJ06, 筛选出10株解钾细菌的基础上，对其中四种透明 GJ07,GJ10)进行活性测定.挑取平板上获得的单 圈明显且生长量较大的菌种进行钾活性鉴定，选取 菌落接种到LB培养基中，30℃下摇瓶培养1d,作 其中活性最强的GJ07菌株进行16 SrDNA鉴定，并 为种子.在300mL锥形瓶中加入0mL筛选培养 采用批量发酵培养，通过改变碳源、氮源、碳氨比、 基（液体，不加琼脂）.于115℃下灭菌30min,冷却 温度、pH值和装液量等方法研究了解钾细菌GJ07 后在每个锥形瓶中接入0.5mL的种子培养液，每 生长的优化控制条件，以期进一步降低成本，提高 个菌种做三个平行样，同时制备出不接菌的空白对 效益，促进解钾细菌菌肥工业化生产进程 照样本，同时置于摇床上，在28℃下进行振荡培养 1 实验材料与方法 5d,振荡转速为200r-m-1.将获得的发酵液置于 水浴锅浓缩至10mL左右，加入6%（体积分数）的 1.1土壤与菌种 H2O2,继续蒸煮，同时不断搅拌，如此反复处理， 本实验组土壤样品取自四川省广元市的烟草 直到解钾细菌黏液消失为止.然后将处理后的液体 种植区，取样地点均为种植烟草时间在十年以上， 过滤，收集滤液，转移到50mL容量瓶中，定容， 且烟草质量、产量都较高的种植区 最后使用火焰分光光度法测定菌液中K+离子的质 实验所用的解钾细菌均是由上述烟草种植区 量浓度 的烟草根际土壤中分离纯化得到，分别命名为GJ01 1.3.3解钾细菌的16 S rDNA鉴定 GJ10. 将欲进行序列测定的菌种挑取单菌落至锥形 1.2培养基 瓶中进行培养，得到纯菌种发酵液后，以全基因 LB(Luria-Bertani)培养基：胰蛋白胨(Ig),酵 组DNA提取试剂盒（生工生物工程（上海）有 母浸粉(0.5g),NaC(1g),去离子水(100mL),调 限公司)提取DNA,以其作为模版进行聚合酶链 节初始pH值为7.00. 式反应(polymerase chain reaction,PCR),使用 筛选培养基：蔗糖(10g),酵母膏(0.5g), Taq DNA聚合酶扩增16 S rDNA,引物为27F (NH4)2S04(1g),Na2HPO4(2g),MgS047H2O(0.5 (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3).1492R(5'- g),CaCO3(1g),钾长石粉(1g,其中K20质量分 GGTTACCTTGTTACGACTT-3).循环参数为： 数为9.60%)，琼脂(15g),去离子水(1L),调节初 95℃下预变性5min:95℃下变性30s,58℃下 始pH值为7.00. 退火20s,72℃下延伸60s.往复循环30次：最 培养优化培养基：KH2PO4(1g),MgSO4(0.2后在72℃下延伸10min得到扩增后的DNA样 g),NaCl(5g),柠檬酸铁铵(0.02g),去离子水(1本.将聚合酶链式反应扩增产物经凝胶回收试剂 .以葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖、乙醇和甘油为盒（生工生物工程（上海）有限公司)纯化，送交测 备选碳源，牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉、硫酸铵和 序公司（北京三博远志生物技术有限责任公司）测 硝酸钠为备选氨源，通过批量培养试验确定最佳碳序.将测得的序列在NCBI(美国国立生物技术信息 源、氯源以及碳氮比.本实验中所有培养基使用前 中心，National Center for Biotechnology Information) 均在115℃下高压灭菌30min. 上用BLAST(basic local alignment search tool)进行 1.3研究方法 比对，并使用ClustalX、NEGA4.1等软件进行系统 1.3.1解钾细菌的筛选 发育分析，构建分子进化树，以获得菌种的分类信息. 将从四川省广元市取得的土壤样本在生理盐 1.3.4批量培养碳源和氮源的选择与优化 水中稀释，使用稀释涂板法在以钾长石粉为唯一钾 在250mL锥形瓶中进行摇瓶培养，备选碳源

· · 北 京 科 技 大 学 学 报 第 卷 肥料 ”一 土壤中钾含量是影响烟草产量 的重要 因 素, 而烟草 中含钾量又是烟叶品质 的重要元素之一 因此 , 在产量和品质高的烟草种植区取得的土 样中, 更易于获得高效的解钾细菌 同时, 解钾细菌 的发酵水平普遍偏低, 也制约了其作为生物肥料用 于工业生产 , 因此如何在发酵过程 中降低成本 、提 高效率对生物钾肥在农业生产中的推广应用有着积 极意义 本实验在成 功从四川省广 元市的烟草 种植 区 筛选 出 株解钾细菌 的基础上 , 对其中四种透 明 圈明显且生长量较大的菌种进行钾活性鉴定, 选取 其 中活性最强的 菌株进行 鉴定, 并 采用批量发酵培养 , 通过改变碳源 、氮源 、碳氮比 、 温度 、 值和装液量等方法研究了解钾细菌 生长的优化控制条件 , 以期进一步 降低成本, 提高 效益 , 促进解钾细菌菌肥工业化生产进程 实验材料与方法 土壤与菌种 本 实验组土壤样品取 自四川省广元市的烟草 种植区, 取样地 点均为种植烟草时间在十年 以上 , 且烟草质量 、产量都较高的种植区 实验所用 的解钾细菌均是 由上述烟 草种植 区 的烟草根际土壤 中分离纯化得到, 分别命名为 培养基 培养基 胰蛋白陈 , 酵 母浸粉 , , 去离子水 , 调 节初始 值为 筛选培养基 蔗糖 , 酵母膏 , , , · , , 钾长石粉 , 其 中 质量分 数为 , 琼脂 , 去离子水 , 调节初 始 值为 培养优化培养 基 , , , 柠檬酸铁按 , 去离子水 以葡萄糖 、 可溶性淀粉 、 蔗糖 、 乙醇和甘油为 备选碳源 , 牛 肉膏 、蛋 白脉 、 酵母浸粉 、硫酸钱和 硝酸钠为备选氮源 , 通过批量培养试验确定最佳碳 源 、 氮源 以及碳氮 比 本实验中所有培养基使用前 均在 ℃下高压灭菌 研究方法 解钾细菌的筛选 将从 四川省广元 市取得的土壤样 本在生理盐 水中稀释, 使用稀释涂板法在 以钾长石粉为唯一钾 源的选择性培养基上筛选解钾细菌 具体步骤为 将土壤样本梯度稀释 , 稀释液涂布到含有筛选培养 基 的平板上 , 置于恒温培养箱中, ℃下培养 后 , 选取生长量大 、菌落周 围有透 明圈的菌种作为 解钾细菌 , 挑取单菌落进行划线分离 , 得到纯种单 菌落后将菌种保藏 解钾细菌 的活性测定 观察划 线培 养得 到的单 菌落 , 选取 生长 旺 盛 、 透 明圈大且 明显的四个菌种 , , , , 进行活性测定 挑取平板上获得的单 菌落接种到 培养基中, ℃下摇瓶培养 , 作 为种子 在 锥形瓶中加入 , 筛选培养 基 液体, 不加琼脂 , 于 ℃下灭菌 , 冷却 后在每个锥形瓶中接入 的种子培养液 , 每 个菌种做三个平行样 , 同时制备出不接菌的空 白对 照样本, 同时置于摇床上, 在 ℃下进行振荡培养 , 振荡转速为 二 一' 将获得的发酵液置 于 水浴锅浓缩 至 左右 , 加入 体积分数 的 , 继续蒸煮 , 同时不 断搅拌 , 如此反复处理 , 直到解钾细菌豁液消失为止 然后将处理后 的液体 过滤 , 收集滤液 , 转移到 , 容量瓶 中, 定容 , 最后使用火焰分光光度法测定菌液 中 离子的质 量浓度 解钾细菌的 鉴定 将欲进行序列测 定的菌种挑取 单菌落至锥形 瓶中进行培 养, 得到纯菌种发酵液后 , 以全基 因 组 提取试剂盒 生 工生物 工程 上海 有 限公司 提取 , 以其作为模版进 行聚合酶链 式反应 , , , 使用 聚 合酶扩 增 , 引物为 `一 一` 、 ` 一' 循环参数为 下预变性 下变性 、, 下 退火 , ℃下延伸 、 往复循环 次 最 后在 ℃下延伸 得到扩增 后的 样 本 将聚合酶链式 反应扩 增产物 经凝胶 回收试剂 盒 生工生物工程 上海 有 限公司 纯化, 送交测 序公司 北京三博远志生物技术有限责任 公司 测 序 将测得的序列在 美 国国立生物技术信息 中心, , 、 , 、 上用 , , 进行 比对 , 并使用 、 等软件进行系统 发育分析, 构建分子进化树, 以获得菌种的分类信息 批量培养碳源和氮源的选择与优化 在 锥形瓶 中进行摇瓶培养, 备选碳源

第4期 刘晓璐等：解钾细菌的筛选、鉴定以及高效培养 ,553 为葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖、乙醇和甘油，备选 (Paenibacillus mucilaginosus,NR028675.1)作为外 氮源为牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉、硫酸铵和硝酸 群，使用ClustalX2.0、MEGA4.1等软件绘制系统 钠.通过设计组合的实验，确定培养该解钾细菌的 进化树，进行分子系统发育分析，进而可直观的观 最佳碳源、氨源及碳氮比，碳源按照总碳质量浓度 察几种菌之间的进化关系以及分类信息，如图2所 为4.2gL-1的量（以蔗糖质量浓度为10gL-1折 示.由图2可以看出，GJ07与巨大芽孢杆菌(Bacil. 算)分别加入，氮源按照总氮质量浓度为0.21gL1 s megaterium,AB738784.1)聚成一分支，二者序列 的初始量（初始碳氮质量比为20：1）分别加入可，每 相似性最高，表明GJ07与巨大芽孢杆菌的亲缘关 组均设三个平行实验 系最近.将测得的GJ07的16 S rDNA提交到NCBI 1.3.5批量培养控制条件优化 的GenBank,获得核酸序列登录号(accession num- 设计单因素实验，通过摇瓶培养，研究不同初 ber)为KC197742. 始pH值、装液量和培养温度等因素对解钾活性最 45 强的解钾细菌(GJ07)生长的影响.接种培养48h 后，.取样在722S型分光光度计上测定680nm处光 5 密度(OD68nm值)以示其生长状况. 25 2结果与讨论 10 2.1筛选结果 5 从四川省广元市长期种植烟草的土壤中筛选 0 空白组GJ05 GJ06 GJ07 GJ10 出十种解钾细菌，分别命名为GJ01GJ10.通过 菌种编号 计数发现，每克干土壤中可筛选到的解钾细菌数量 图1不同种群解钾细菌及空白溶液中K+离子的含量 集中在(711)×105之间，与崔俊峰等8在每克环 Fig.1 K+contents in the solutions of different strains of 神农架烟区烤烟根际土壤中筛选到约7×10个解 potassium-releasing bacteria and blank control 钾细菌接近.栾丽英等9从每克葡萄树根区土壤不 关于巨大芽孢杆菌作为微生态制剂的研究己 同土层中最多可筛选到约2.5×106个解钾细菌，低 有报道，通常认为巨大芽孢杆菌具有较强的解磷能 于本实验组由烟草种植区筛选到的解钾细菌数量. 力1-13).除此之外，陈阳4在田间接种试验中发 2.2解钾活性测定结果 现，所筛选的巨大芽孢杆菌可提高扬柴植株的平均 不同种群解钾细菌发酵液中K+离子的含量 株高和发芽率：陈德元等5发现他们从水稻根际土 如图1所示.由图1可以看出，四种细菌发酵液 壤中筛选到的巨大芽孢杆菌具有较强的固氮能力. (GJ05,GJ06,GJ07,GJ10)的处理液中K+离子 由此可见，巨大芽孢杆菌作为微生物肥料具有较高 的含量明显高于空白对照组，其中GJ07活性最强， 的研究价值.本实验组所筛选的巨大芽孢杆菌可使 处理液中K+离子质量浓度可达到37.47mgL-1, 发酵液中K+离子质量浓度高出空白组约54.5%， 较空白组(K+离子质量浓度为24.25mgL-1)高约 是较理想的微生物肥料备用菌株. 54.5%.另外，在培养过程中发现，GJ07可产芽孢 2.4不同碳源、氨源以及碳氮比对GJ07生长的 由于芽孢具有极强的抗逆性，且易保藏，复活率高， 影响 因此是制备微生态制剂较为理想的存在形式10].综 图3(a)为采用不同碳源培养下GJ07的生长情 合上述因素，本实验选取GJ07进行其分类地位和 况.由图可以看出，GJ07可利用的碳源非常广泛， 高密度培养的研究. 除乙醇以外，葡萄糖、蔗糖、甘油和可溶性淀粉均 2.316 S rDNA鉴定结果 可作为较良好的碳源被GJ07利用，其中以蔗糖为 使用NCBI的BLAST功能，将测序获得的 碳源的培养基中，GJ07生长量相对稍高(OD68Omm DNA序列与Genebank(核酸序列数据库)中已有序 值可达5.63)，因此把蔗糖作为GJ07的最优碳源 列进行比对，发现GJ07与巨大芽孢杆菌相似性高 通常情况下，葡萄糖较易被细菌利用，但由于其在 达99.8%以上.为进一步确定GJ07的分类学位置， 代谢过程中大量产酸，使培养基的pH值快速降 从Genebank中选取常见的芽孢杆菌属细菌的16S 低，此时就不适宜GJ07生长，最终难以获得最高 tDNA基因序列，并选取相近属的胶质假芽孢杆菌 的生长量

第 期 刘晓璐等 解钾细菌的筛选 、鉴定以及高效培养 · · 为葡萄糖 、可溶性淀粉 、蔗糖 、 乙醇和甘油, 备选 氮源为牛肉膏 、蛋 白陈 、酵母浸粉 、硫酸钱和硝酸 钠 通过设计组合 的实验, 确定培养该解钾细菌的 最佳碳源 、氮源及碳氮 比 碳源按照总碳质量浓度 为 ·一`的量 以蔗糖质量浓度为 ' 一`折 算 分别加入 , 氮源按照总氮质量浓度为 ·一` 的初始量 初始碳氮质量比为 分别加入 , 每 组均设三个平行实验 批量培养控制条件优化 设计单因素实验 , 通过摇瓶培养 , 研 究不同初 始 值 、装液量和培养温度等因素对解钾活性最 强的解钾细菌 生长的影响 接种培养 后, 取样在 型分光光度计上测定 处光 密度 值 以示其生长状况 乞乙 乞“ 乞 , 作为外 群 , 使用 、 等软件绘制系统 进化树 , 进行分子系统发育分析, 进而可直观 的观 察几种菌之 间的进化关系 以及分类信息, 如图 所 示 由图 可以看出, 与 巨大芽抱杆菌 兹 俪 俪 , 聚成一分支, 二者序列 相似性最高, 表 明 与 巨大芽饱杆菌 的亲缘关 系最近 将测得的 的 提交到 的 , , 获得核酸序列登录号 为 一 结果与讨论 筛选结果 从 四川省广元市长期种植烟草 的土壤 中筛选 出十种解钾细菌 , 分别命名为 、 通过 计数发现 , 每克干土壤中可筛选到的解钾细菌数量 集 中在 、 “之 间, 与崔俊峰等 在每克环 神农架烟区烤烟根际土壤 中筛选到约 个解 钾细菌接近 栗丽英等 从每克葡萄树根区土壤不 同土层中最多可筛选到约 “个解钾细菌 , 低 于本实验组由烟草种植区筛选到的解钾细菌数量 解钾活性测定结果 不 同种群解钾细菌发酵液 中 离子的含量 如图 所示 由图 可以看 出, 四种细菌发酵液 , , , 的处理液 中 离子 的含量明显高于空 白对照组, 其中 活性最强 , 处理液中 离 子质量浓度可达到 ' 一`, 较空 白组 离子质量浓度为 ·一` 高约 另外 , 在培养过程中发现 , 可产芽抱 由于芽抱具有极强的抗逆性, 且易保藏 , 复活率高 , 因此是制备微生态制剂较 为理想的存在形式 `。 综 合上述因素, 本实验选取 进行其分类地位和 高密度培养的研究 · 鉴定结果 使用 的 功能 , 将测序获得 的 序列与 核酸序列数据库 中已有序 列进行 比对, 发现 与巨大芽抱杆菌相似性高 达 以上 为进一步确定 的分类学位置, 从 中选取常见的芽抱杆菌属细菌的 基 因序列, 并选取相近属的胶质假芽抱杆菌 空 白组 菌种编号 鸽逛锐喇名斗褪于赵受昌︵︸︶十呼口 图 不同种群解钾细菌及空白溶液中 离子的含量 一 关于 巨大芽抱杆菌作为微生态制剂 的研究 己 有报道, 通常认为 巨大芽抱杆菌具有较强的解磷能 力 卜 ` 除此之外 , 陈阳 在 田间接种试验 中发 现 , 所筛选的巨大芽抱杆菌可提高扬柴植株的平均 株高和发芽率 陈德元等 发现他们从水稻根际土 壤中筛选到的 巨大芽抱杆菌具有较强 的固氮能力 由此可见 , 巨大芽抱杆菌作为微生物肥料具有较高 的研究价值 本实验组所筛选 的巨大芽抱杆菌可使 发酵液 中 离子质量浓度高出空白组约 , 是较理想 的微 生物肥料备用菌株 不同碳源 、氮源 以及碳氮 比对 生长的 影响 图 为采用不同碳源培养下 的生长情 况 由图可 以看 出, 可利用的碳源非常广泛 , 除乙醇以外 , 葡萄糖 、蔗糖 、甘油和可溶性淀粉均 可作为较 良好的碳源被 利用 , 其中以蔗糖 为 碳源的培养基 中, 生长量相对稍 高 。 值可达 , 因此把蔗糖作为 的最优碳源 通常情况下, 葡萄糖较易被细菌利用 , 但由于其在 代谢过程中大量产酸, 使培养基的 值快速 降 低 , 此时就不适宜 生长 , 最终难 以获得最高 的生长 量

554 北京科技大学学报 第35卷 99 100 -Bacillus megaterium (AB738784.1) Bacillus flerus (JX144709) Bacillus circulans(JX517212) Bacillus lentus (JX315559.1) 90 Bacillus firmus (JX144707.1) Bacillus mycoides (JX155767 100 Bacillus cereus (JX293338.1) 100 Bacillus thuringiensis (JN628977.1) Bacillus pumilus (JN628977.1) 89 Bacillus licheniformis (HE993550.1) 99 Bacillus subtilis(JX625998.1) 99 -Bacillus tequilensis (JN700167.1) Bacillus marinus (AB021190.1) Bacillus pasteurii (JN411415) 97 Bacillus insolitus (AM980508.1) Paenibacillus mucilaginosus (NR 028675.1) 人 0.01 入 节点处数字为1000次重复抽样检测的自展分析(bootstrap analysis)值，小于85的数值已被舍去 图2基于16 S rDNA基因序列的GJ07分子进化树 Fig.2 Molecular phylogenetic tree of GJ07 based on 16S rDNA sequences ·-葡萄糖 -蔗糖 :生肉 ·-可溶性淀粉 5 乙醉 酵母浸粉 6 硫酸铵 ·甘油 ·一硝酸钠 2 uIodo 3 1 时间/d 时间/d (a) (b) 8.0p 7.0f 4 6.0f : 5.0E 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0E 0 时间/d (c) 图3碳源(a)、氮源(b)以及碳氮质量比(c)对GJ07生长OD80mm值的影响 Fig.3 Effects of carbon sources (a),nitrogen sources (b)and carbon-to-nitrogen mass ratio(c)on the growth ODosonm values of GJ07

5 5 4 北 京 科 技 大 学 学 报 第 卷 厂 ` `,` 夕 , 。。, “ 刀 。、 , ￡ , — 乞“` 二。、 · 一 `,` 卢了二,`、 了 厂— `,` “ 。夕 , ``,, 、 , 。。 `,`, 。, 二夕, 。。 。 ,`、尹。。饭八` — 乞。, ` 、 一 一 `,`、 。` ` · 刀 、 。,`, `、,、 一 八`, 附 。,` — 该、`, 尹 、 “, 、 ,`、 ,, 。、 人 — 。, 吞。 , ` 。, 。` `乙夕,, ` 、,, 、 卜一— 州 。 节点处数字为 次重复抽样检测的自展分析 值, 小于 的数值已被舍去 图 基于 基因序列的 分子进化树 一 牛肉膏 蛋自陈 酵 母浸粉 硫酸按 硝酸钠 幽, 一 盛 一 盛 ` 一 一二一 一 一 二 。 葡 一 蔗 。一 可, 乙 萄糖 糖 溶性淀粉 醇 卜 一 甘油 一一一 恻口沈一二︹﹄︸﹃ 山, 了 厂 测自吞且二︸乙八, 卜﹂﹄ 时间 任峨工门︸八月片了 ` 件,一曰勺﹄反 一 ,一 一 , ,` ︸ 时间 划 任,门一︸ 目曰 自公工目︸`︻ 时间 图 碳源 、氮源 以及碳氮质量比 对 生长 值的影响 , , 一 一 。, ,, 一

第4期 刘晓璐等：解钾细菌的筛选、鉴定以及高效培养 555· 图3(b)为采用不同氮源培养下GJ07的生长 一般情况下，pH值为6.50~7.50时最适宜细菌的 情况，图中显示，培养2d后，与牛肉膏、硝酸 生长[16.图4(a)给出了初始pH值对GJ07生长 钠、硫酸铵和酵母浸粉相比，蛋白胨为氮源的培养 OD6s0mm值的影响.由图4(a)可以看出，GJ07生长 基中，GJ07生长量较高(OD680nm值可达6.80)，可 OD值随初始pH值的增加先增加然后降低，当初 视为培养GJ07的最佳氮源.因为蛋白胨不仅含有 始pH值为7.00时，GJ07的OD680mm值最大，为 丰富的氨基酸，特别是含硫氨基酸较多，而且含有更 6.77.因此可知GJ07生长效应最佳的初始pH值为 多的细菌生长所需维生素和其他生长因子)，这可能 7.00.陈凯等13)在对筛选出的一株巨大芽孢杆菌培 是其作为GJ07最优氮源的主要原因.作为无机氮源 养时，发现其最适初始pH值为7.50，与本研究得 的硫酸铵和硝酸钠虽也可以支持GJ07的生长，但其 到的结果相近 生长效应明显不佳（两者OD680am值都仅有1.30左 锥形瓶中装液量是影响培养基中溶氧量的重 右)，可能是由于这一类无机氮源中不含GJ07生长所 要因素.一般情况下，装液量越多溶氧量就越少，不 需的各种生长因子，限制了GJ07的生长 利于好氧菌的生长.通常装液量一般不少于锥形瓶 根据上述实验结果，采用蔗糖和蛋白胨作为 体积的1/10，本实验选用锥形瓶体积为250mL,因 GJ07生长的最优碳源和氮源，固定碳源中碳元素 此实验分别装取25、50、75、100和125mL液体， 用量为4.20gL-1,通过改变加入氮源的量研究碳 考察不同装液量对培养基中溶氧量的影响.图4(b) 氨质量比对解钾细菌生长的效应 显示装液量对GJ07生长OD680nm值的影响.从图 图3(c)为采用不同碳氮质量比培养下GJ07的 中可以看出，随装液量的增加，OD68Omm值逐渐降 生长情况.GJ07在碳氮质量比为10：1的条件下生 低，装液量为25mL时，GJ07的OD68oam值最高， 长最好(OD680mm值可达7.00以上)，过高的碳氮质 可达到8.00左右.由此可知GJ07是较为典型的好 量比条件下其生长量明显较低，可见GJ07对氮源 氧生长，对氧的需求量较大，在低装液量(25mL) 的需求量相对较高，但过低的碳氮质量比（⑤：1）会 的条件下表现出明显的生长优势，且随着装液量的 抑制GJ07的快速生长.此结果说明蔗糖和蛋白胨 升高，发酵液中菌体密度逐渐下降.梁锦锋)在摇 为培养GJ07生长的最佳碳源和氨源，最佳碳氮质 瓶实验中也发现较高的装液量会明显限制巨大芽孢 量比为10：1. 杆菌的生长 2.5培养基初始pH值、装液量和培养温度对 GJ07生长的影响 每种微生物都有自己的酶反应体系，因此也都 环境pH值对微生物的生命活动也有较大影响。有各自生长的最适温度7.图4（©）显示的是采用单 10 5 2 5.506.006.507.007.50 8.00 5 50 75 100 125 初始pH值 装液量/mL (a) (b) 10r 25 30 35 温度/℃ (c) 图4初始pH值、装液量和温度对GJ07生长OD6s0mm值的影响 Fig.4 Effects of initial pH values,liquid medium volume and temperature on the growth ODesonm values of GJ07

第 期 刘晓璐等 解钾细菌的筛选 、鉴定以及高效培养 · · 图 为采用不 同氮源培养下 的生长 情 况 图中显示 , 培养 后, 与牛 肉膏 、 硝酸 钠 、硫酸钱和酵母浸粉相 比, 蛋白陈 为氮源 的培养 基 中, 生长量较高 。飞 值可达 , 可 视为培养 的最佳氮源 因为蛋 白陈不仅含有 丰富的氨基酸, 特别是含硫氨基酸较多, 而且含有更 多的细菌生长所需维生素和其他生长因子 , 这可能 是其作为 最优氮源的主要原因 作为无机氮源 的硫酸钱和硝酸钠虽也可以支持 的生长, 但其 生长效应明显不佳 两者 、 值都仅有 左 右 , 可能是由于这一类无机氮源中不含 生长所 需的各种生长因子, 限制了 的生长 根据 上述实验结果 , 采用蔗糖和蛋 白陈 作为 生长 的最优碳源和氮源, 固定碳源 中碳元素 用量为 ·一`, 通过改变加入氮源的量研究碳 氮质量比对解钾细菌生长 的效应 图 为采用不同碳氮质量比培养下 的 生长情况 在碳氮质量 比为 的条件下生 长最好 , 值可达 以上 , 过高的碳氮质 量 比条件下其生长量 明显较低 , 可见 对氮源 的需求量相对较高 , 但过低的碳氮质量 比 会 抑制 的快速 生长 此结果说明蔗糖和蛋白陈 为培养 生长 的最佳碳源和氮源, 最佳碳氮质 量比为 · 培 养 基初 始 值 、装液 量和 培 养温 度 对 生长的影响 环境 值对微生物的生命活动也有较大影响 一般情况下 , 值为 时最适宜细菌的 生长 邢 图 给 出了初始 值对 生长 值的影响 由图 《 可 以看 出, 生长 值随初始 值 的增加先增加然后 降低, 当初 始 值为 时 , 的 ,、值最大, 为 因此可知 生长效应最佳的初始 值为 陈凯等 在对筛选出的一株 巨大芽抱杆菌培 养 时, 发现其最适初始 值为 , 与本研究得 到的结果相近 锥形瓶 中装液量是影 响培养基 中溶氧 量的重 要因素一 般情况下 , 装液量越多溶氧量就越少 , 不 利于好氧菌的生长 通常装液量一般不少于锥形瓶 体积的 , 本实验选用锥形瓶体积为 , 因 此实验分别装取 、 、 、 和 液体, 考察不同装液量对培养基 中溶氧量的影响 图 显示装液量对 生长 值 的影响 从图 中可 以看出, 随装液量 的增加, 值逐渐 降 低, 装液量为 时, 的 值最高, 可达到 左右 由此可知 是较为典型的好 氧生长 , 对氧的需求量较大 , 在低装液量 的条件下表现出明显 的生长优势, 且随着装液量的 升高, 发酵液中菌体密度逐渐下降 梁锦锋 在摇 瓶实验中也发现较高的装液量会明显限制 巨大芽抱 杆菌 的生长 每种微生物都有 自己的酶反应体系, 因此也都 有各 自生长 的最适温度日 图 显示 的是采用单 划。工产` 迥 石 ` 石 刀 石 口乏︸﹄ 初始 值 装液量 二 目。艺日户工︸﹃︵ 温度 下 图 初始 值 、装液量和温度对 生长 , 值的影响

556 北京科技大学学报 第35卷 因素实验方法，培养温度在2540℃范围内GJ07 (周毅蜂，罗云霞，刘华中，解钾菌的筛选.湖北民族学院学 的生长情况.从图中可以看出，随培养温度的升 报：自然科学版)，2009,27(3)：285) 高，OD680nm值先升高后降低，35℃下GJ07生长的 [5]Wang P Y,Zhang S H.Study on the isolation of sillicate 0D680nm值最高，为7.75.由此可知，35℃是培养 bacteria and it's identification of biochemical characteris- GJ07的最佳温度，这与陈敏等18对巨大芽孢杆菌 tics.J Nanchang Inst Aeronaut Technol,2001.15(2):78 培养得出的结果一致.较低的温度(25℃)下，GJ07 (王平宇，张树华.硅酸盐细菌的分离及生理生化特性的鉴 菌液浓度较低，可能是由于菌体新陈代谢较慢，导 定.南昌航空工业学院学报，2001,15(2)：78) 致细菌生长和分裂速度受影响；同样，在过高的生 [6]Hu J,Qiu HZ,He X C,et al.Effects of potassium fer- tiliser on potassium content in flue-cured tobacco leaves 长温度(40℃)下，菌液浓度也较低，可能是由于 and the economic benefits in Gansu province.Acta Prat- 该温度超过了菌体内酶的最适温度，降低其催化效 acult Sin,2010,19(5):156 率，从而影响细菌生长 (胡娟，邱慧珍，何秀成，等。施钾水平对甘肃烤烟钾含量及 3结论 经济效益的影响.草业学报，2010,19(5)：156) 7)Lu L,Zhang K Y,Zhao P.et al.High-density cultiva- (1)从四川省广元市长期种植烟草的土壤中 tion of Lactobacillus sp.USTB-08 and production of lactic 筛选出十种解钾细菌，并找到其中解钾活性最强 acid.J Univ Sci Technol Beijing,2012,34(5):602 的GJ07(发酵液中K+离子质量浓度高出空白组 (吕乐，张可毅，赵鹏，等.乳酸菌USTB08的高效培养和 54.5%). 生产乳酸.北京科技大学学报，2012,34(5小：602) (2)对GJ07进行16 S rDNA鉴定，确定其为 [8 Cui J F,Jiang D H,Liu M,et al.Status of silicate bac- 巨大芽孢杆菌，通过测定发现其具有较强的解钾活 teria in soils taken from continuous eucalyptus plantation areas.Guangri Agric Sci,2010,41(5):456 性 (崔俊峰，蒋代华，刘敏，等.连栽桉树人工林土襄硅酸盐细 (3)对GJ07进行批量优化培养，发现蔗糖和蛋 菌研究.广西农业科学，2010,41(5)：456) 白胨是可以支持其快速生长的碳源和氮源（碳氮质 [9]Luan L Y,Fang YL,Song S R,et al.Soil microbe in vine- 量比为10：1)，培养温度35℃、初始pH值为7.00 yards with different tree ages and different soil depths.J 和较低的装液量(25mL)是解钾细菌GJ07的优化 Northwest For Univ,2009,24(2):37 培养控制条件 (栾丽英，房玉林，宋士任，等。不同树龄酿酒葡萄不同土 壤深度根际和根区徽生物数量的研究.西北林学院学报， 2009,24(2):37) 参考文献 10]Chen Q H,Sun M,Shi J Y,et al.Culture conditions for Bacillus megaterium.Anim Husbandry Feed Sci,2011, [1]Hong X J,Li X,Zhao G Y.The research of culture char- 32(2):3 acteristic and ability of silicon and potassium dissolving of (陈秋红，孙梅，史济筠，等.巨大芽胞杆菌培养条件的研究 two silicate bacteria.Anhui Agric Sci Bull,2012,18(11): 畜牧与饲料科学，2011,32(2)：3) 51 [11]Zhang C J,Huang L,Gong M.A study on the capacity (洪秀杰，李雪，赵冠羽.硅酸盐细菌培养及解钾解硅能力 of Bacillus megaterium in dissolving P compounds.Acta 的研究.安徽农学通报，2012,18(11)：51) Agric Univ Jiangriensis,2002,24(2):190 2]Zhao C X,Liu Q G,Zhang Z Y.Study on the ability of (郑传进，黄林，龚明.巨大芽孢杆菌解磷能力的研究.江西 phosphoric bacteria and potassic bacteria in decomposing 农业大学学报：自然科学版，2002,24(2)：190) of phosphate and silicate.J Hunan Agric Univ Nat Sci, [12]Liu W H,Deng X Y,Xiang Y C,et al.Bacillus Mega- 2004,30(6):519 terium,an efficient biodegrader to methamidophos:iso- (赵晨曦，刘前刚，张志元.磷钾细菌解磷解钾能力的研究 lation and molecular identification.Oceanol Limnol Sin, 湖南农亚大学学报：自然科学版，2004,30(6)：519) 2009,40(2):170 [3]LiC Y.Studying on fermentative condition of silicate bac- (刘文海，邓先余，向言词，等.一株甲胺磷高效降解菌-巨 terium.J Liaoning Agric Coll,2009,11(4):9 大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的分离及其分子鉴定. (李春艳.硅酸盐细菌发酵条件研究.辽宁农业职业技术学 海洋与湖沼，2009,40(2)：170) 院学报，2009,11(4)：9) [13]Chen K,Li J S,Yang H T,et al.Phosphate solubilizing [4]Zhou Y F,Luo Y X,Liu HZ.Separation and purification abilities of Bacillus megaterium strain PI and its fermen- of the potassium-releasing bacteria.J Hubei Univ Nation tation conditions.Soil Fert Sci China,2010(4):73 alities Nat Sci Ed,2009,27(3):285 (陈凯，李纪顺，杨合同，等.巨大芽孢杆菌P1的解磷效果

· · 北 京 科 技 大 学 学 报 第 卷 因素实验方法, 培养温度在 、 ℃范围内 的生长情况 从 图中可 以看出, 随培养温度的升 高, 值先升高后降低 , ℃下 生长的 值最高 , 为 由此可知 , ℃是培养 的最佳温度 , 这与陈敏等口” 对巨大芽抱杆菌 培养得出的结果一致 较低的温度 ℃ 下, 菌液浓度较低 , 可能是由于菌体新陈代谢较慢, 导 致细菌生长和分裂速度受影响 同样 , 在过高的生 长温度 ℃ 下 , 菌液浓度也较低 , 可能是 由于 该温度超过 了菌体 内酶的最适温度 , 降低其催化效 率, 从而影响细菌生长 结论 从 四川省广元市长 期种植烟草 的土 壤中 筛选 出十种解 钾细菌, 并找到其 中解钾 活性 最强 的 发酵液 中 十 离子质量浓度高 出空 白组 对 进行 鉴定 , 确定其为 巨大芽抱杆菌 , 通过测定发现其具有较强的解钾活 性 对 进行批量优化培养, 发现蔗糖和蛋 白膝是可以支持其快速生长的碳源和氮源 碳氮质 量 比为 , 培养温度 ℃、 初始 值为 和较低 的装液量 是解钾细菌 的优化 培养控制条件 参 考 文 献 」 , , 夕 坛 , , 一 洪秀杰, 李雪 , 赵冠羽 硅酸盐细菌培养及解钾解硅能力 的研究 安徽农学通报, , 一 【 动 , , 右” 几 夕汽 流 乞衫 `, , 赵晨曦, 刘前刚, 张志元 磷钾细菌解磷解钾能力的研究 湖南农业大学学报 自然科学版, , 。 乞 。￡夕 夕八 , , 李春艳 硅酸盐细菌发酵条件研究 辽宁农业职业技术学 院学报, , 」 , , 一 趾乙 呱 几 亡 坛 , , 周毅峰, 罗云霞, 刘华 中 解钾菌的筛选 湖北 民族学院学 报 自然科学版 , , 【」、、叭 , , ' 就 叼 、 武 , 王平宇, 张树华 硅酸盐细菌的分离及生理生化特性的鉴 定 南昌航空工业学院学报, , 」 , , , 一 艺 ” 老从”, , 胡娟, 邱慧珍, 何秀成, 等 施钾水平对甘肃烤烟钾含量及 经济效益的影响 草业学报, , 巧 , , , 卜 即 牡 , 一 一 战 落。 二 。咖匆, , 吕乐, 张可毅, 赵鹏, 等 乳酸菌 一 的高效培养和 生产乳酸 北京科技大学学报, , , , , , · ” ”夕, 。。 , , 崔俊峰, 蒋代华, 刘敏, 等 连栽按树人工林土壤硅酸盐细 菌研究 广西农业科学 , 」 , , , 飞 瓜 亡二。 流 , , 奕丽英, 房玉林, 宋士任, 等 不 同树龄酿酒葡萄不 同土 壤深度根际和根区微 生物数量的研究 西北林学院学报, , 」 , , , , 乞 牡 已汽 七 几 几 叨 , , 陈秋红, 孙梅, 史济绮, 等 巨大芽胞杆菌培养条件的研究 畜牧与饲料科学, 一, 【 , , 坛 牡 饥 几灿 夕 坛。几 劣` , , 郑传进, 黄林, 龚明 巨大芽抱杆菌解磷能力的研究 江西 农业大学学报 自然科学版, , 【 」 , , , 召 落、、 印 八 , 几 , , 刘文海, 邓先余, 向言词, 等一 株甲胺磷高效降解菌 一巨 大芽抱杆菌 砚 。 、二 的分离及其分子鉴定 海洋与湖沼, , 【 」 , , , 魁。爪 印 代仪仇 乞 乞 , 陈凯, 李纪顺, 杨合同, 等 巨大芽抱杆菌 的解磷效果

第4期 刘晓璐等：解钾细菌的筛选、鉴定以及高效培养 557: 与发酵条件研究.中国土壤与肥料，2010(4)：73) 集.成都，1999：148) 14 Chen Y.Screening,Identification and Application of [16]Shen P,Chen X D.Microbiology.Beijing:Higher Educa- Phosphate-Solubilizing and Potassium-Solubilizing Bacil- tion Press,2008 lus Isolated from Rhizosphere of Some Plants in the Erdos (沈萍，陈向东.微生物学.北京：高等教育出版社，2008) 17]Liang J F.The Culture Conditions and the Mechanism of Desert Dissertation.Ya'an:Sichuan Agricultural Uni- Phosphorus-Solubilization of the Phosphate-Solubilizing versity,2008 Bacteria,Bacillus megaterium var.Phosphaticum Dis- (陈阳.鄂尔多斯解磷、解钾芽孢杆菌的筛选、鉴定及其接 sertation].Hangzhou:Zhejiang University,2001 种效应的研究学位论文].雅安：四川农业大学，2008) (梁锦锋.解磷细菌(Bacillus megaterium var,Phos- j15 Chen D Y.Xie G H.Research and development of a phaticum)生长条件及解磷机理的研究[学位论文！.杭州： new fertilizer resource in ecological agriculture-biological 浙江大学，2001) vigour agent /Colloquium of the Fourth National Con- [18]Chen M,Xu L J,Wu B J,et al.Identification and op- ference on Agrochemical Service and Development and timum culture of cucumber entophytic strain HE-1.Bull Use of New Fertilizer.Chengdu,1999:148 Sci Technol,2008,24(4):489 (陈德元，谢光辉，生态农业新肥源活力素的研究与开 (陈敏，许丽君吴斌娟，等.黄瓜背枯病内生拮抗菌株HE1 发/全国第四届农化服务暨新型肥料开发应用交流会论文 的初步鉴定及培养优化条件.科技通报，2008,24(4)：489)

第 期 刘晓璐等 解钾细菌的筛选 、鉴定以及高效培养 · · 与发酵条件研究 中国土壤与肥料, , 访 亡 尹 亡一 乙 ` 几夕 , ` 艺 、 , 一 名,九 二 介 介。 。, , ` 。 【 」 , , 陈阳 鄂尔多斯解磷 、解钾芽抱杆菌的筛选 、鉴定及其接 种效应的研究 学位论文 雅安 四川农业大学 , 一 一 二二 。 艺 二 介 夕, 。、 。 二 ,洁 。 , 陈德元, 谢光辉 生态农业新肥源活力素 的研究与开 发 全国第四届农化服务暨新型肥料开发应用交流会论文 【 集 成都, , 对 阳 四夕 含 , 沈萍, 陈向东 微生物学 北京 高等教育出版社, 伪 亡、二 亡, 二 亡 二 一 二 亡 亡一 二 , 。、 夕 二二二 。 艺 【 梁锦锋 , 解磷细菌 二。爪印 。二 灿 。间 生长条件及解磷机理的研究 【学位论文 浙江大学, 尸 杭州 , , , 场 一 二 二 , , 陈敏 许丽君, 吴斌娟, 等 黄瓜青枯病内生拮抗菌株 一 的初步鉴定及培养优化条件 科技通报,