38卷5期 孙健等：茶树上冰核活性细菌的分离、鉴定及防治 789 到斜面上，配制浓度大约为103 cfumL的细菌悬浮 个处理的药菌混合液0.1mL,放入培养皿l内平板培 液，无菌条件下吸取细菌悬浮液0.2mL,滴加到 养基上，均匀涂抹，每个处理3皿，设无药菌液作 一5℃的测试表面上，每滴10L,每个菌株滴10 对照，于25℃下培养48h,观测冰核活性细菌是否 滴，重复1次，排成2排，以未接种的无菌液体 生长以及生长差异，由此判定供试药剂对冰核细菌 培养基和无菌水作对照。如在30s内，每个重复 有无触杀效果及其强弱程度。 有2滴以上的小液滴冻结成冰，即可初步认为该菌 1.2.6拮抗菌的分离与鉴定拮抗菌的来源，从 株在一5℃时具有冰核活性。纯化后再重测1次确 分离出NA的植物附近的土壤中分离，取样范围地 认，记下冻滴数，换算成冻滴率，并保存纯化后的 表以下5cm。 菌株供进一步研究备用。 以冰核活性细菌作为指示菌，将新鲜的冰核菌 1.2.3总DNA制备、PCR反应扩增16 S rDNA与序列 苔用灭菌水配成浓度约为5×10个mL细菌悬浮 分析待测菌株的总DNA制备。16 S rDNA的 液，无菌条件下取0.5mL放入培养皿内，再将溶化 PCR采用引物对27F和1492R。设置梯度PCR摸 后冷却到50℃左右的KB培养基倒入培养皿内混合 索条件。PCR产物胶回收连接转化测序，将所测定 摇匀，制成含菌平板培养基，采用点接法，分别用 的序列从GenBank数据库中进行BLAST分析。 接种针蘸取菌苔，呈等边三角形点接在平板培养基 1.2.4冰核基因的扩增根据目前己发表的多个 上，于25℃下培养48h后，观测是否产生透明的 ip基因2-)，设计1对特定的PCR反应扩增引物 抑菌圈，并记载其抑菌半径大小(mm),以此判明抑 5-TGA ATT CCT GGC CGT CTG AGT ACT GC-3' 菌作用。 5-TAG ATC TCC GGA TAT GGC AGC ACG CA-3',采用梯度PCR反应扩增inp基因。 2结果与分析 1.2.5药剂的筛选1(1)抑菌圈测定。采用圆 2.1冰核细菌的分离与冰核活性的鉴定 形滤纸片法测定。用培养2d的NA细菌菌苔，配 从植物组织材料中初筛得到细菌菌株9株，经 制成5×103个mL细菌悬浮液，在无菌条件下取0.5 进一步划线分离后进行冰核活性测定，发现其中一 mL放入无菌培养皿内，倒入溶化后冷却至50℃左 株分离柱在一5℃条件下在30s试验时间内有2个 右的培养基，每皿约18L摇匀放平；然后用无菌的 以上液滴发生冻结，2min冻滴率85%，而对照大 滤纸片浸沾供试药剂，每皿呈等边三角形放置3 肠杆菌及其他8株菌株在30s内均未见冻结液滴发 片，每个处理3皿，放入25℃培养箱里内，培养 生。菌落表面湿润有光泽，黄色，光滑。 48h后，观测圆形滤纸片的周围是否出现透明圈和 透明圈的大小，以此判定药剂是否有抑菌作用及其 Curtobacterium sp.2384 16S ribosomal sj 强弱程度。 Curtobacterium sp.3426 16S ribosomal (2)破坏NA细菌冰核活性物质的测定。 Curtobacterium flaccumfaciens pv.fla(2) 将NA菌株接种在KB培养基上，于24℃培养48h Curtobacterium flaccumfaciens pv.fla. Curtobacterium sp.S20 16S ribosomal-. 后，在无菌条件下用灭菌水配成5×103 cfu'mL浓 Uncultured actinobacterium clone Cl-1.. Curtobacterium flaccumfaciens pv.fla(3) 度的细菌悬浮液，再用悬浮液将供试药剂稀释成实 Curtobacterium flaccumfaciens isolate. 验设计的倍数，配制药菌混合液。采用Vli小液滴 Curtobacterium flaccumfaciens partial.. 结冻法，吸取混合液，无菌条件下滴在平底船型锡 Bacterium WM06 B11A 16S ribosomal RN... 箔纸上，每滴10L,每个处理10滴，重复3次， 图1分离菌株的16 S rDNA序列聚类分析结果 并设灭菌水作对照。将锡箔纸漂浮在一5℃的低温酒 Figure 1 Cluster analysis of the isolated strain based on the 精液面上，处理2min后，记载各处理的冻滴数， 16S rDNA sequences 换算成冻滴率(%)，根据冻滴率的高低，判定各种处 2.216 S rDNA扩增、序列测定与聚类分析 理的供试药剂对NA细菌冰核活性的破坏有无及 其强弱程度差异，从而判断各种药剂对冰核细菌活 根据梯度PCR结果，设定退火温度为54℃。 性物质（冰核蛋白）的破坏作用。 PCR反应条件为：94℃30s,54℃1min,72℃1 (3)触杀作用测定方法。用浓度约为3×108 min,30个循环。PCR产物1500bp左右，经胶回 个mL的冰核细菌悬浮液与供试每种药剂配成不 收连接转化，菌落PCR有条带。经对扩增产物测序， 同浓度的药菌混合液，放置5h、10h后分别取各 并将所测定的序列从GenBank数据库中进行38 卷 5 期 孙 健等: 茶树上冰核活性细菌的分离、鉴定及防治 789 到斜面上，配制浓度大约为 108 cfu·mL-1 的细菌悬浮 液 ，无菌条件下吸取细菌悬浮液 0.2 mL，滴加到 －5℃的测试表面上，每滴 10 μL，每个菌株滴 10 滴，重复 1 次，排成 2 排，以未接种的无菌液体 培养基和无菌水作对照。如在 30 s 内，每个重复 有 2 滴以上的小液滴冻结成冰，即可初步认为该菌 株在－5℃ 时具有冰核活性。纯化后再重测 1 次确 认，记下冻滴数，换算成冻滴率，并保存纯化后的 菌株供进一步研究备用。 1.2.3 总 DNA 制备、PCR 反应扩增 16S rDNA 与序列 分析 待测菌株的总 DNA 制备。16S rDNA 的 PCR 采用引物对 27 F 和 1 492 R。设置梯度 PCR 摸 索条件。PCR 产物胶回收连接转化测序，将所测定 的序列从 GenBank 数据库中进行 BLAST 分析。 1.2.4 冰核基因的扩增 根据目前已发表的多个 inp 基因[2-3]，设计 1 对特定的 PCR 反应扩增引物 5′-TGA ATT CCT GGC CGT CTG AGT ACT GC-3′ 和 5′-TAG ATC TCC GGA TAT GGC AGC ACG CA-3′， 采用梯度 PCR 反应扩增 inp 基因。 1.2.5 药剂的筛选[4-5] （1）抑菌圈测定。采用圆 形滤纸片法测定。用培养 2 d 的 INA 细菌菌苔，配 制成 5×108个·mL-1细菌悬浮液，在无菌条件下取 0.5 mL 放入无菌培养皿内，倒入溶化后冷却至 50℃左 右的培养基，每皿约 18 mL 摇匀放平;然后用无菌的 滤纸片浸沾供试药剂，每皿呈等边三角形放置 3 片，每个处理 3 皿，放入 25℃ 培养箱里内，培养 48 h 后，观测圆形滤纸片的周围是否出现透明圈和 透明圈的大小，以此判定药剂是否有抑菌作用及其 强弱程度。 （2）破坏 INA 细菌冰核活性物质的测定。 将 INA 菌株接种在 KB 培养基上，于 24℃培养 48 h 后，在无菌条件下用灭菌水配成 5 ×108 cfu·mL-1 浓 度的细菌悬浮液，再用悬浮液将供试药剂稀释成实 验设计的倍数，配制药菌混合液。采用 Vali 小液滴 结冻法，吸取混合液，无菌条件下滴在平底船型锡 箔纸上，每滴 10 μL，每个处理 10 滴，重复 3 次， 并设灭菌水作对照。将锡箔纸漂浮在－5℃的低温酒 精液面上，处理 2 min 后，记载各处理的冻滴数， 换算成冻滴率(%)，根据冻滴率的高低，判定各种处 理的供试药剂对 INA 细菌冰核活性的破坏有无及 其强弱程度差异，从而判断各种药剂对冰核细菌活 性物质(冰核蛋白)的破坏作用。 (3) 触杀作用测定方法。 用浓度约为 3×108 个·mL-1 的冰核细菌悬浮液与供试每种药剂配成不 同浓度的药菌混合液，放置 5 h、10 h 后分别取各 个处理的药菌混合液 0.1 mL，放入培养皿内平板培 养基上，均匀涂抹，每个处理 3 皿，设无药菌液作 对照，于 25℃下培养 48 h，观测冰核活性细菌是否 生长以及生长差异，由此判定供试药剂对冰核细菌 有无触杀效果及其强弱程度。 1.2.6 拮抗菌的分离与鉴定[6] 拮抗菌的来源，从 分离出 INA 的植物附近的土壤中分离，取样范围地 表以下 5 cm。 以冰核活性细菌作为指示菌，将新鲜的冰核菌 苔用灭菌水配成浓度约为 5×107 个·mL-1 细菌悬浮 液，无菌条件下取 0.5 mL 放入培养皿内，再将溶化 后冷却到 50℃左右的 KB 培养基倒入培养皿内混合 摇匀，制成含菌平板培养基，采用点接法，分别用 接种针蘸取菌苔，呈等边三角形点接在平板培养基 上，于 25℃下培养 48 h 后，观测是否产生透明的 抑菌圈，并记载其抑菌半径大小(mm)，以此判明抑 菌作用。 2 结果与分析 2.1 冰核细菌的分离与冰核活性的鉴定 从植物组织材料中初筛得到细菌菌株 9 株，经 进一步划线分离后进行冰核活性测定，发现其中一 株分离柱在－5℃条件下在 30 s 试验时间内有 2 个 以上液滴发生冻结，2 min 冻滴率 85%，而对照大 肠杆菌及其他 8 株菌株在 30 s 内均未见冻结液滴发 生。菌落表面湿润有光泽，黄色，光滑。 图 1 分离菌株的 16S rDNA 序列聚类分析结果 Figure 1 Cluster analysis of the isolated strain based on the 16S rDNA sequences 2.2 16S rDNA 扩增、序列测定与聚类分析 根据梯度 PCR 结果，设定退火温度为 54℃。 PCR 反应条件为：94℃ 30 s，54℃ 1 min，72℃ 1 min，30 个循环。PCR 产物 1 500 bp 左右，经胶回 收连接转化，菌落 PCR 有条带。经对扩增产物测序， 并将所测定的序列从 GenBank 数据库中进行