安徽农业大学学报，2011,38(5)：788-791 Journal of Anhui Agricultural University [D0CNK1:34-1162/S.20110829.1431.017网络出版时间：2011-08-2914：31：37 [URLIhttp:/www.cnki.net/kcms/detail/34.1162.S.20110829.1431.017.html 茶树上冰核活性细菌的分离、鉴定及防治 孙健，何天良，江昌俊 (安徽农业大学茶叶生物化学与生物技术教育部重点实验室，合肥230036) 摘要：霜冻发生时从茶树上分离到1株冰核活性细菌，该菌株在-5℃下在2min内冻滴率达到85%，一个 冰核产生需要的细胞数约为5.4×103个，该菌株具有明显冰核活性。对该菌株进行16 S rDNA序列对比分析，判断 该菌株为萎蔫短小杆菌(Cur1 obacterium flaccumfaciens)。在-S℃条件下，药剂防治效率顺序为：次氯酸钙>Tween 80>藏红>亚甲蓝，在同一生态条件下的土壤中分离出1株拮抗菌，经鉴定该菌株为黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium). 关键词：冰核活性细菌；鉴定；药剂防除；拮抗菌 中图分类号：S571.1 文献标识码：A 文章编号：1672-352X(2011)05-0788-04 Identification and control of one strain of ice nucleation active (INA) bacteria isolated from the tea plant SUN Jian,HE Tian-liang,JIANG Chang-jun (Key laboratory of Tea Biochemistry and Biotechnology,Education of Ministry,Anhui Agricultural University,Hefei 230036) Abstract:One of ice nucleation active INA)bacteria was isolated from the tea plant when frost occurred, and the freezing percentage of this strain was 85%at-5C in 2 min.The cells/ice nuclei were about 5.4x10,and the strain shows significant ice nucleation activity.After 16S rDNA sequences of the isolates in GenBank were analyzed,the strain was identified as Curtobacterium flaccumfaciens.The efficiency of chemical control order at -5C was calcium hypochlorite>Tween 80>saffron>methylene blue.Under the same ecological condition,an- tagonist bacterium was isolated from the soil,which was identified as Phanerochaete chrysosporium. Key words:INA bacteria;identification;medicament control;antagonistic bacterium 茶树(Camillia sinensis)冻害的发生受多种因子 品采集范围为整个茶园，每种茶树采集10片老叶。 的影响。多数研究者认为，茶树低温冻害与低温及 对照菌株为大肠杆菌(Escherichia coli)。药剂选择 其持续时间，茶树品种以及茶树上附生的微生物有 次氯酸钙、Tween80、藏红和亚甲蓝。 关。冰核活性细菌的存在使茶树在-2~-3℃下 1.2试验方法 细胞水结冰从而诱发冻害。本试验从茶树上分离的1.2.1冰核细菌的分离用灭菌小刀切取采集的植 1株冰核活性细菌，通过对其鉴定，使用药剂和拮 物组织，并切成碎片状后，再加入无菌水于摇床中 抗菌对冰核活性细菌的室内防除，以期为茶树抗冻 以200rmin室温下振荡浸洗1h,然后取100L 提供理论依据。 浸洗液经10倍梯度稀释后涂布KB平板，置24℃ 恒温箱中培养2d。挑取所生长的单菌落进行划线分 1材料与方法 离纯化，用于分离菌株的冰核活性测定和鉴定。 1.1材料 1.2.2冰核活性的测定测定冰核活性采用Vai山 用于分离冰核活性细菌的材料于秋冬季霜冻发 发明，后又由Lindow改进的小液滴冻结法。待移 生后采集于安徽农业大学大杨店实验基地茶园。样 植到试管斜面上的菌落长好后，用无菌水直接加入 收稿日期：2011-05-10 作者简介：孙健，男，硕士研究生。 *通讯作者：江昌俊，男，教授，博士生导师。E-mail:jiangcj(@ahau.cdu.cn
收稿日期: 2011-05-10 作者简介: 孙 健，男，硕士研究生。 * 通讯作者: 江昌俊，男，教授，博士生导师。E-mail：jiangcj@ahau.edu.cn 安徽农业大学学报, 2011, 38(5): 788-791 Journal of Anhui Agricultural University [DOI]CNKI：34-1162/S.20110829.1431.017 网络出版时间：2011-08-29 14:31:37 [URL]http:// www.cnki.net/kcms/detail/34.1162.S.20110829.1431.017.html 茶树上冰核活性细菌的分离、鉴定及防治 孙 健，何天良，江昌俊 1* (安徽农业大学茶叶生物化学与生物技术教育部重点实验室，合肥 230036) 摘 要：霜冻发生时从茶树上分离到 1 株冰核活性细菌，该菌株在﹣5℃下在 2 min 内冻滴率达到 85%，一个 冰核产生需要的细胞数约为 5.4×103 个，该菌株具有明显冰核活性。对该菌株进行 16S rDNA 序列对比分析，判断 该菌株为萎蔫短小杆菌（Curtobacterium flaccumfaciens）。在 -5℃条件下，药剂防治效率顺序为：次氯酸钙＞Tween 80＞藏红＞亚甲蓝。在同一生态条件下的土壤中分离出 1 株拮抗菌，经鉴定该菌株为黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)。 关键词：冰核活性细菌；鉴定；药剂防除；拮抗菌 中图分类号：S571.1 文献标识码：A 文章编号：1672−352X (2011)05−0788−04 Identification and control of one strain of ice nucleation active (INA) bacteria isolated from the tea plant SUN Jian, HE Tian-liang, JIANG Chang-jun (Key laboratory of Tea Biochemistry and Biotechnology, Education of Ministry, Anhui Agricultural University, Hefei 230036) Abstract: One of ice nucleation active ( INA) bacteria was isolated from the tea plant when frost occurred， and the freezing percentage of this strain was 85% at -5℃ in 2 min. The cells/ice nuclei were about 5.4×103 , and the strain shows significant ice nucleation activity. After 16S rDNA sequences of the isolates in GenBank were analyzed, the strain was identified as Curtobacterium flaccumfaciens. The efficiency of chemical control order at ﹣5℃ was calcium hypochlorite> Tween 80> saffron> methylene blue. Under the same ecological condition, antagonist bacterium was isolated from the soil, which was identified as Phanerochaete chrysosporium. Key words: INA bacteria; identification; medicament control; antagonistic bacterium 茶树(Camillia sinensis)冻害的发生受多种因子 的影响。多数研究者认为，茶树低温冻害与低温及 其持续时间，茶树品种以及茶树上附生的微生物有 关。冰核活性细菌[1]的存在使茶树在﹣2 ~ ﹣3℃下 细胞水结冰从而诱发冻害。本试验从茶树上分离的 1 株冰核活性细菌，通过对其鉴定，使用药剂和拮 抗菌对冰核活性细菌的室内防除，以期为茶树抗冻 提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 材料 用于分离冰核活性细菌的材料于秋冬季霜冻发 生后采集于安徽农业大学大杨店实验基地茶园。样 品采集范围为整个茶园，每种茶树采集 10 片老叶。 对照菌株为大肠杆菌（Escherichia coli）。药剂选择 次氯酸钙、Tween 80、藏红和亚甲蓝。 1.2 试验方法 1.2.1 冰核细菌的分离 用灭菌小刀切取采集的植 物组织，并切成碎片状后，再加入无菌水于摇床中 以 200 r·min-1 室温下振荡浸洗 1 h ，然后取 100 μL 浸洗液经 10 倍梯度稀释后涂布 KB 平板，置 24℃ 恒温箱中培养 2 d。挑取所生长的单菌落进行划线分 离纯化，用于分离菌株的冰核活性测定和鉴定。 1.2.2 冰核活性的测定 测定冰核活性采用 Vali [1] 发明，后又由 Lindow 改进的小液滴冻结法。待移 植到试管斜面上的菌落长好后，用无菌水直接加入
38卷5期 孙健等：茶树上冰核活性细菌的分离、鉴定及防治 789 到斜面上，配制浓度大约为103 cfumL的细菌悬浮 个处理的药菌混合液0.1mL,放入培养皿l内平板培 液，无菌条件下吸取细菌悬浮液0.2mL,滴加到 养基上，均匀涂抹，每个处理3皿，设无药菌液作 一5℃的测试表面上，每滴10L,每个菌株滴10 对照，于25℃下培养48h,观测冰核活性细菌是否 滴，重复1次，排成2排，以未接种的无菌液体 生长以及生长差异，由此判定供试药剂对冰核细菌 培养基和无菌水作对照。如在30s内，每个重复 有无触杀效果及其强弱程度。 有2滴以上的小液滴冻结成冰，即可初步认为该菌 1.2.6拮抗菌的分离与鉴定拮抗菌的来源，从 株在一5℃时具有冰核活性。纯化后再重测1次确 分离出NA的植物附近的土壤中分离，取样范围地 认，记下冻滴数，换算成冻滴率，并保存纯化后的 表以下5cm。 菌株供进一步研究备用。 以冰核活性细菌作为指示菌，将新鲜的冰核菌 1.2.3总DNA制备、PCR反应扩增16 S rDNA与序列 苔用灭菌水配成浓度约为5×10个mL细菌悬浮 分析待测菌株的总DNA制备。16 S rDNA的 液，无菌条件下取0.5mL放入培养皿内，再将溶化 PCR采用引物对27F和1492R。设置梯度PCR摸 后冷却到50℃左右的KB培养基倒入培养皿内混合 索条件。PCR产物胶回收连接转化测序，将所测定 摇匀，制成含菌平板培养基，采用点接法，分别用 的序列从GenBank数据库中进行BLAST分析。 接种针蘸取菌苔，呈等边三角形点接在平板培养基 1.2.4冰核基因的扩增根据目前己发表的多个 上，于25℃下培养48h后，观测是否产生透明的 ip基因2-)，设计1对特定的PCR反应扩增引物 抑菌圈，并记载其抑菌半径大小(mm),以此判明抑 5-TGA ATT CCT GGC CGT CTG AGT ACT GC-3' 菌作用。 5-TAG ATC TCC GGA TAT GGC AGC ACG CA-3',采用梯度PCR反应扩增inp基因。 2结果与分析 1.2.5药剂的筛选1(1)抑菌圈测定。采用圆 2.1冰核细菌的分离与冰核活性的鉴定 形滤纸片法测定。用培养2d的NA细菌菌苔，配 从植物组织材料中初筛得到细菌菌株9株，经 制成5×103个mL细菌悬浮液，在无菌条件下取0.5 进一步划线分离后进行冰核活性测定，发现其中一 mL放入无菌培养皿内，倒入溶化后冷却至50℃左 株分离柱在一5℃条件下在30s试验时间内有2个 右的培养基，每皿约18L摇匀放平；然后用无菌的 以上液滴发生冻结，2min冻滴率85%，而对照大 滤纸片浸沾供试药剂，每皿呈等边三角形放置3 肠杆菌及其他8株菌株在30s内均未见冻结液滴发 片，每个处理3皿，放入25℃培养箱里内，培养 生。菌落表面湿润有光泽，黄色，光滑。 48h后，观测圆形滤纸片的周围是否出现透明圈和 透明圈的大小，以此判定药剂是否有抑菌作用及其 Curtobacterium sp.2384 16S ribosomal sj 强弱程度。 Curtobacterium sp.3426 16S ribosomal (2)破坏NA细菌冰核活性物质的测定。 Curtobacterium flaccumfaciens pv.fla(2) 将NA菌株接种在KB培养基上，于24℃培养48h Curtobacterium flaccumfaciens pv.fla. Curtobacterium sp.S20 16S ribosomal-. 后，在无菌条件下用灭菌水配成5×103 cfu'mL浓 Uncultured actinobacterium clone Cl-1.. Curtobacterium flaccumfaciens pv.fla(3) 度的细菌悬浮液，再用悬浮液将供试药剂稀释成实 Curtobacterium flaccumfaciens isolate. 验设计的倍数，配制药菌混合液。采用Vli小液滴 Curtobacterium flaccumfaciens partial.. 结冻法，吸取混合液，无菌条件下滴在平底船型锡 Bacterium WM06 B11A 16S ribosomal RN... 箔纸上，每滴10L,每个处理10滴，重复3次， 图1分离菌株的16 S rDNA序列聚类分析结果 并设灭菌水作对照。将锡箔纸漂浮在一5℃的低温酒 Figure 1 Cluster analysis of the isolated strain based on the 精液面上，处理2min后，记载各处理的冻滴数， 16S rDNA sequences 换算成冻滴率(%)，根据冻滴率的高低，判定各种处 2.216 S rDNA扩增、序列测定与聚类分析 理的供试药剂对NA细菌冰核活性的破坏有无及 其强弱程度差异，从而判断各种药剂对冰核细菌活 根据梯度PCR结果，设定退火温度为54℃。 性物质（冰核蛋白）的破坏作用。 PCR反应条件为：94℃30s,54℃1min,72℃1 (3)触杀作用测定方法。用浓度约为3×108 min,30个循环。PCR产物1500bp左右，经胶回 个mL的冰核细菌悬浮液与供试每种药剂配成不 收连接转化，菌落PCR有条带。经对扩增产物测序， 同浓度的药菌混合液，放置5h、10h后分别取各 并将所测定的序列从GenBank数据库中进行
38 卷 5 期 孙 健等: 茶树上冰核活性细菌的分离、鉴定及防治 789 到斜面上，配制浓度大约为 108 cfu·mL-1 的细菌悬浮 液 ，无菌条件下吸取细菌悬浮液 0.2 mL，滴加到 －5℃的测试表面上，每滴 10 μL，每个菌株滴 10 滴，重复 1 次，排成 2 排，以未接种的无菌液体 培养基和无菌水作对照。如在 30 s 内，每个重复 有 2 滴以上的小液滴冻结成冰，即可初步认为该菌 株在－5℃ 时具有冰核活性。纯化后再重测 1 次确 认，记下冻滴数，换算成冻滴率，并保存纯化后的 菌株供进一步研究备用。 1.2.3 总 DNA 制备、PCR 反应扩增 16S rDNA 与序列 分析 待测菌株的总 DNA 制备。16S rDNA 的 PCR 采用引物对 27 F 和 1 492 R。设置梯度 PCR 摸 索条件。PCR 产物胶回收连接转化测序，将所测定 的序列从 GenBank 数据库中进行 BLAST 分析。 1.2.4 冰核基因的扩增 根据目前已发表的多个 inp 基因[2-3]，设计 1 对特定的 PCR 反应扩增引物 5′-TGA ATT CCT GGC CGT CTG AGT ACT GC-3′ 和 5′-TAG ATC TCC GGA TAT GGC AGC ACG CA-3′， 采用梯度 PCR 反应扩增 inp 基因。 1.2.5 药剂的筛选[4-5] （1）抑菌圈测定。采用圆 形滤纸片法测定。用培养 2 d 的 INA 细菌菌苔，配 制成 5×108个·mL-1细菌悬浮液，在无菌条件下取 0.5 mL 放入无菌培养皿内，倒入溶化后冷却至 50℃左 右的培养基，每皿约 18 mL 摇匀放平;然后用无菌的 滤纸片浸沾供试药剂，每皿呈等边三角形放置 3 片，每个处理 3 皿，放入 25℃ 培养箱里内，培养 48 h 后，观测圆形滤纸片的周围是否出现透明圈和 透明圈的大小，以此判定药剂是否有抑菌作用及其 强弱程度。 （2）破坏 INA 细菌冰核活性物质的测定。 将 INA 菌株接种在 KB 培养基上，于 24℃培养 48 h 后，在无菌条件下用灭菌水配成 5 ×108 cfu·mL-1 浓 度的细菌悬浮液，再用悬浮液将供试药剂稀释成实 验设计的倍数，配制药菌混合液。采用 Vali 小液滴 结冻法，吸取混合液，无菌条件下滴在平底船型锡 箔纸上，每滴 10 μL，每个处理 10 滴，重复 3 次， 并设灭菌水作对照。将锡箔纸漂浮在－5℃的低温酒 精液面上，处理 2 min 后，记载各处理的冻滴数， 换算成冻滴率(%)，根据冻滴率的高低，判定各种处 理的供试药剂对 INA 细菌冰核活性的破坏有无及 其强弱程度差异，从而判断各种药剂对冰核细菌活 性物质(冰核蛋白)的破坏作用。 (3) 触杀作用测定方法。 用浓度约为 3×108 个·mL-1 的冰核细菌悬浮液与供试每种药剂配成不 同浓度的药菌混合液，放置 5 h、10 h 后分别取各 个处理的药菌混合液 0.1 mL，放入培养皿内平板培 养基上，均匀涂抹，每个处理 3 皿，设无药菌液作 对照，于 25℃下培养 48 h，观测冰核活性细菌是否 生长以及生长差异，由此判定供试药剂对冰核细菌 有无触杀效果及其强弱程度。 1.2.6 拮抗菌的分离与鉴定[6] 拮抗菌的来源，从 分离出 INA 的植物附近的土壤中分离，取样范围地 表以下 5 cm。 以冰核活性细菌作为指示菌，将新鲜的冰核菌 苔用灭菌水配成浓度约为 5×107 个·mL-1 细菌悬浮 液，无菌条件下取 0.5 mL 放入培养皿内，再将溶化 后冷却到 50℃左右的 KB 培养基倒入培养皿内混合 摇匀，制成含菌平板培养基，采用点接法，分别用 接种针蘸取菌苔，呈等边三角形点接在平板培养基 上，于 25℃下培养 48 h 后，观测是否产生透明的 抑菌圈，并记载其抑菌半径大小(mm)，以此判明抑 菌作用。 2 结果与分析 2.1 冰核细菌的分离与冰核活性的鉴定 从植物组织材料中初筛得到细菌菌株 9 株，经 进一步划线分离后进行冰核活性测定，发现其中一 株分离柱在－5℃条件下在 30 s 试验时间内有 2 个 以上液滴发生冻结，2 min 冻滴率 85%，而对照大 肠杆菌及其他 8 株菌株在 30 s 内均未见冻结液滴发 生。菌落表面湿润有光泽，黄色，光滑。 图 1 分离菌株的 16S rDNA 序列聚类分析结果 Figure 1 Cluster analysis of the isolated strain based on the 16S rDNA sequences 2.2 16S rDNA 扩增、序列测定与聚类分析 根据梯度 PCR 结果，设定退火温度为 54℃。 PCR 反应条件为：94℃ 30 s，54℃ 1 min，72℃ 1 min，30 个循环。PCR 产物 1 500 bp 左右，经胶回 收连接转化，菌落 PCR 有条带。经对扩增产物测序， 并将所测定的序列从 GenBank 数据库中进行
790 安徽农业大学学报 2011年 BLAST分析（图1），鉴定出该菌株为萎蔫短小杆菌 示，对照冰核细菌NA菌液，除次氯酸钙冻滴率 (Curtobacterium flaccumfaciens). 为20%左右外3个处理的冻滴率与未药剂处理冻滴 2.3冰核基因的扩增 率相同（表1），说明次氯酸钙对冰核活性物质有明 用inp基因保守区序列设计的引物可从中扩增 显的破坏作用，另外3种药剂对冰核活性物质没有 得到约550bp的基因片段，经序列分析，证明与 破坏作用。 己发表的来自于丁香假单胞菌丁香亚种(P.syringae 2.4.3触杀作用测定从表1中可以看出次氯酸钙 subsp.syringae)inp基因具有较高同源性。 对冰核细菌触杀作用为100%，藏红的触杀效果为 2.4药剂对冰核细菌抑菌圈测定、活性物质破坏和 95%,亚甲蓝与Tween80对冰核细菌没有触杀作用。 触杀效果 2.5拮抗菌的分离及鉴定 2.4.1抑菌圈测定在25℃培养2d,4种试剂对冰 从土壤中分离出7种菌株，以冰核细菌做指示 核菌的抑菌圈大小排序为：次氯酸钙>Tween80> 菌，分离出一株拮抗菌。菌落表面细腻、白色、丝 亚甲蓝>藏红（表1），以次氯酸钙最佳。 状。经16SDNA扩增、序列测定与聚类分析，鉴 2.4.2破坏INA细菌冰核活性物质的测定采用 定菌株为黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chryso Vai小滴冻结法，对放置5h、10h的各处理的药 sporium) 菌混合液，于一5℃和一7℃测定冰核活性结果显 表1药剂对对冰核细菌抑菌圈测定、活性物质破坏和触杀效果 Table 1 Effect of pesticide on INA bacteria 药菌混合液冻滴率% 药剂名称与剂量 Freezing percent 触杀灭菌效果% 抑菌圈测定/mm Diameter of Name of drug and its dosage 5h 10h Tag sterilization inhibitation zone -5℃ -7℃ -5℃ -7℃ 次氯酸钙O.4%Calcium hypochlorite 20 25 20 20 100 3 藏红0.4%Saffron 85 95 85 95 95 0 亚甲蓝0.4%Methylene blue 85 100 85 95 0 1.8 Tween 800.4% 85 100 85 100 0 1.9 无菌水对照CK 85 100 85 95 0 0 INA 85 100 85 100 钙能有效抑制此株冰核细菌，能够很好的触杀冰核 3讨论 细菌并且破坏冰核活性物质。在同一生态条件下， 一般认为-山，在没有冰核存在的情况下，纯 筛选出的一株对冰核细菌有拮抗作用的拮抗菌鉴定 水可以过冷却到一40℃仍不结冰。冰核作为晶核凝 为黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)。 结水分子整齐排列可以催化结冰过程的发生。在各 通过药剂和拮抗菌防除冰核活性细菌试验，可以为 种冰核中，由冰核细菌形成的生物冰核是活性最强 其他种类冰核活性细菌的防除和利用提供理论依 的冰核之一，因而引起人们的广泛关注。大量研究 据。 证明，在自然界广泛存在着冰核活性细菌(ice nucleation active bacteria,简称NA细菌)它可在 参考文献： 一2~一3℃下诱发植物细胞水结冰而发生霜冻，但 [1]Vali G.Quantitative evaluation of experimental results on 如果没有冰核细菌存在的植物，可耐一6~一7℃的 the heterogenous freezing of super cooled liquids[J]. Journal Atmospheric Science,1971,28:402-409. 低温而不发生冻害。这证明了冰核细菌是诱发和加 [2]赵廷昌，孙福在，姜大志，等.冰核微生物中冰核基因 重植物霜冻的重要因素。使用药剂活拮抗菌防除冰 重复序列PCR分析U.微生物学通报，2001,28(3)： 核活性细菌，可以减轻或控制霜冻。 40-45. 本试验针对1株从茶树上分离的冰核细菌，对 [3)刘静，陈庆森.冰核活性细菌基因的研究进展及其应 其进行鉴定，药剂和拮抗菌防除。分离的菌株鉴定 用U).生物技术，2006,16(2)少：82-85. [4孙福在，赵廷昌，牟丰盛，等.生防菌和药剂除冰核细 结果为菱蔫短小杆菌(Curtobacterium flaccumfa- 菌防御玉米霜冻研究).自然灾害学报，2003,12(4)： ciens)。试验药剂中次氯酸钙的效果最好，次氯酸 115-119
790 安 徽 农 业 大 学 学 报 2011 年 BLAST 分析(图 1)，鉴定出该菌株为萎蔫短小杆菌 （Curtobacterium flaccumfaciens）。 2.3 冰核基因的扩增 用 inp 基因保守区序列设计的引物可从中扩增 得到约 550 bp 的基因片段， 经序列分析，证明与 已发表的来自于丁香假单胞菌丁香亚种( P. syringae subsp. syringae) inp 基因具有较高同源性。 2.4 药剂对冰核细菌抑菌圈测定、活性物质破坏和 触杀效果 2.4.1 抑菌圈测定 在 25℃培养 2 d，4 种试剂对冰 核菌的抑菌圈大小排序为：次氯酸钙＞Tween 80＞ 亚甲蓝＞藏红（表 1），以次氯酸钙最佳。 2.4.2 破坏 INA 细菌冰核活性物质的测定 采用 Vali 小滴冻结法，对放置 5 h、10 h 的各处理的药 菌混合液，于－5℃和－7℃ 测定冰核活性结果显 示，对照冰核细菌 INA 菌液，除次氯酸钙冻滴率 为 20%左右外 3 个处理的冻滴率与未药剂处理冻滴 率相同（表 1），说明次氯酸钙对冰核活性物质有明 显的破坏作用，另外 3 种药剂对冰核活性物质没有 破坏作用。 2.4.3 触杀作用测定 从表 1 中可以看出次氯酸钙 对冰核细菌触杀作用为 100%，藏红的触杀效果为 95%，亚甲蓝与 Tween80 对冰核细菌没有触杀作用。 2.5 拮抗菌的分离及鉴定 从土壤中分离出 7 种菌株，以冰核细菌做指示 菌，分离出一株拮抗菌。菌落表面细腻、白色、丝 状。经 16S rDNA 扩增、序列测定与聚类分析，鉴 定菌株为黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)。 表 1 药剂对对冰核细菌抑菌圈测定、活性物质破坏和触杀效果 Table 1 Effect of pesticide on INA bacteria 药菌混合液冻滴率/% Freezing percent 5 h 10 h 药剂名称与剂量 Name of drug and its dosage -5℃ -7℃ -5℃ -7℃ 触杀灭菌效果/% Tag sterilization 抑菌圈测定/mm Diameter of inhibitation zone 次氯酸钙 0.4% Calcium hypochlorite 20 25 20 20 100 3 藏红 0.4% Saffron 85 95 85 95 95 0 亚甲蓝 0.4% Methylene blue 85 100 85 95 0 1.8 Tween 80 0.4% 85 100 85 100 0 1.9 无菌水对照 CK 85 100 85 95 0 0 INA 85 100 85 100 3 讨论 一般认为[7-11]，在没有冰核存在的情况下，纯 水可以过冷却到－40℃仍不结冰。冰核作为晶核凝 结水分子整齐排列可以催化结冰过程的发生。在各 种冰核中，由冰核细菌形成的生物冰核是活性最强 的冰核之一，因而引起人们的广泛关注。大量研究 证明，在自然界广泛存在着冰核活性细菌（ice nucleation active bacteria，简称 INA 细菌）它可在 －2～－3℃下诱发植物细胞水结冰而发生霜冻，但 如果没有冰核细菌存在的植物，可耐－6～－7℃的 低温而不发生冻害。这证明了冰核细菌是诱发和加 重植物霜冻的重要因素。使用药剂活拮抗菌防除冰 核活性细菌，可以减轻或控制霜冻。 本试验针对 1 株从茶树上分离的冰核细菌，对 其进行鉴定，药剂和拮抗菌防除。分离的菌株鉴定 结果为萎蔫短小杆菌（Curtobacterium flaccumfaciens）。试验药剂中次氯酸钙的效果最好，次氯酸 钙能有效抑制此株冰核细菌，能够很好的触杀冰核 细菌并且破坏冰核活性物质。在同一生态条件下， 筛选出的一株对冰核细菌有拮抗作用的拮抗菌鉴定 为黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)。 通过药剂和拮抗菌防除冰核活性细菌试验，可以为 其他种类冰核活性细菌的防除和利用提供理论依 据。 参考文献： [1] Vali G. Quantitative evaluation of experimental results on the heterogenous freezing of super cooled liquids[J]. Journal Atmospheric Science, 1971, 28: 402-409. [2] 赵廷昌, 孙福在, 姜大志, 等. 冰核微生物中冰核基因 重复序列 PCR 分析[J]. 微生物学通报, 2001, 28(3): 40-45. [3] 刘静, 陈庆森. 冰核活性细菌基因的研究进展及其应 用[J]. 生物技术, 2006, 16(2): 82-85. [4] 孙福在, 赵廷昌, 牟丰盛, 等. 生防菌和药剂除冰核细 菌防御玉米霜冻研究[J]. 自然灾害学报, 2003, 12(4): 115-119
38卷5期 孙健等：茶树上冰核活性细菌的分离、鉴定及防治 791 []崔汝强，姬广海，张世珖。冰核活性细菌拮抗菌株的筛 [9]SCHNELL R C,VALI G World-wide source of leaf-der 选.云南农业大学学报，2004,195)528-531. freezing nuclei [J].Nature,1973,212-213. [6]刘涛，雷思勤，王跃进.含氯消毒剂抗冻剂的研究 [10]Lindow SE.Erwinia herbicola:a bacterial ice nucleus ac- 中国消毒学杂志，2008,25(4)：377-378. tive inincreasing frost injury to comn[J.Phytopathology, [7)]孙福在，赵廷昌.冰核细菌生物学特性及其诱发植物 1978(3:523-527. [11]高玳珍.茶树冻害及防冻技术的研究进展).湖南农 霜冻机理与防霜应用U.生态学报，2003,232)： 学院学报，1995,14(2)：129-133. 336-345. [8]胡芸，李茜茜，蔡皓，等.1株高冰核活性细菌的分离及 鉴定[).华中农业大学学报，2008,27(2)：243-247. 本刊外聘编委黎志康研究员 中国农业科学院农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程首席科学家、国际水稻研究所驻中国代表科 学家和全球水稻分子育种协作网协调科学家。 专业特长：植物分子遗传学（基因定位、数量性状遗传作图、植物分子标记辅助育种、功能等位基因发掘 和复杂农艺性状的功能基因组研究)及其在水稻育种、遗传和进化中的应用。国际动植物基因组年会植物分子 育种分会的主持人，国际遗传学大会nvited Speaker。.是美国科学促进协会会员，美国遗传学学会会员，美国作 物科学学会会员。 1974年10月-1977年9月就读于安徽农业大学，1980年9月-1983年8月在中国农业科学院学习，获硕 士学位，1985年1月-1989年7月在美国加州大学戴雏斯校区学习，获博士学位。1997年11月-2003年7月 在国际水稻研究所遗传育种系任高级研究员，2003至今在中国农业科学院作物科学研究所工作，任水稻分子遗 传和育种研究员。 在国外曾主持过8个项目的研究，总研究经费额达300多万美元。曾设计、策划并主持了有11个国家和31 个研究院所参加的“全球水稻分子育种计划”，取得了重大的进展。目前主持的在研项目包括来自美国洛克菲勒 基金的项目2项、国际农业研究中心挑战计划1项，总研究经费额达170多万美元。此外还主持或承担国家科 技部973、863和农业部948项目3项，总研究经贵额达700万人民币
38 卷 5 期 孙 健等: 茶树上冰核活性细菌的分离、鉴定及防治 791 [5] 崔汝强, 姬广海, 张世珖. 冰核活性细菌拮抗菌株的筛 选[J]. 云南农业大学学报, 2004, 19(5): 528-531. [6] 刘涛, 雷思勤, 王跃进. 含氯消毒剂抗冻剂的研究[J]. 中国消毒学杂志, 2008, 25(4): 377-378. [7] 孙福在, 赵廷昌. 冰核细菌生物学特性及其诱发植物 霜冻机理与防霜应用 [J]. 生态学报 , 2003, 23(2): 336-345. [8] 胡芸, 李茜茜, 蔡皓, 等. 1 株高冰核活性细菌的分离及 鉴定[J]. 华中农业大学学报, 2008, 27(2): 243-247. [9] SCHNELL R C, VALI G. World-wide source of leaf-der freezing nuclei [J] . Nature, 1973, 212 – 213. [10] Lindow SE.Erwinia herbicola:a bacterial ice nucleus active inincreasing frost injury to corn[J]. Phytopathology, 1978(3): 523-527. [11] 高玳珍. 茶树冻害及防冻技术的研究进展[J]. 湖南农 学院学报, 1995, 14(2): 129-133. ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ 本刊外聘编委 黎志康研究员 中国农业科学院农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程首席科学家、国际水稻研究所驻中国代表科 学家和全球水稻分子育种协作网协调科学家。 专业特长：植物分子遗传学（基因定位、数量性状遗传作图、植物分子标记辅助育种、功能等位基因发掘 和复杂农艺性状的功能基因组研究）及其在水稻育种、遗传和进化中的应用。国际动植物基因组年会植物分子 育种分会的主持人，国际遗传学大会 Invited Speaker。是美国科学促进协会会员，美国遗传学学会会员，美国作 物科学学会会员。 1974 年 10 月－1977 年 9 月就读于安徽农业大学，1980 年 9 月－1983 年 8 月在中国农业科学院学习，获硕 士学位，1985 年 1 月－1989 年 7 月在美国加州大学戴维斯校区学习，获博士学位。1997 年 11 月－2003 年 7 月 在国际水稻研究所遗传育种系任高级研究员，2003 至今在中国农业科学院作物科学研究所工作，任水稻分子遗 传和育种研究员。 在国外曾主持过 8 个项目的研究，总研究经费额达 300 多万美元。曾设计、策划并主持了有 11 个国家和 31 个研究院所参加的“全球水稻分子育种计划”，取得了重大的进展。目前主持的在研项目包括来自美国洛克菲勒 基金的项目 2 项、国际农业研究中心挑战计划 1 项，总研究经费额达 170 多万美元。此外还主持或承担国家科 技部 973、863 和农业部 948 项目 3 项，总研究经费额达 700 万人民币