安徽农业大学学报，2015,42(5)：700-705 Journal of Anhui Agricultural University [D0010.13610j.cnki.1672-352x20150825.009网络出版时间：2015-8-259：55：08 [URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1162.S.20150825.0955.018.html α-环糊精戊酸包合物的制备及释放动力学研究 曹胜男，张扬，金姗姗，张舒，杨丽萍，周裔彬 (安徽农业大学茶与食品科技学院，合肥230036) 摘要：采用改进的共沉淀法制备α-环糊精戊酸包合物。正交试验表明，制备α-环糊精戊酸包合物的最佳参 数为：戊酸与a-环糊精的摩尔比为3：1，超声45min,超声温度50℃，可获最大包合率为52.79%；通过扫描电镜、 红外、XRD和CP-MAS13CNMR对包合物结构进行表征，环糊精表观形态改变，C=O双键吸收峰出现，XRD衍 射峰迁移和核磁碳谱戍酸化学位移出现，表明戊酸与a-环糊精包合物的形成：利用Avri方程对a-环糊特戊酸包 合物在不同条件下的释放情况进行分析，结果表明湿度越大，温度越高释放速度越快。 关键词：-环糊精；戊酸；包合物；表征；释放特性 中图分类号：TS201.2 文献标识码：A 文章编号：1672-352X(2015)05-0700-06 Preparation and release characterization of valeric acid-a-cyclodextrin inclusion complex CAO Shengnan,ZHANG Yang,JIN Shanshan,ZHANG Shu,YANG Liping,ZHOU Yibin (School of Tea and Food Science,Anhui Agricultural University,Hefei 230036) Abstract:The inclusion complex of valeric acid and a-cyclodextrin was prepared by a modified co-precipitation method.The results showed that the inclusion ratio of a-cyclodextrin complex could reach to 52.79%when the conditions were set to:valeric acid /a-cyclodextrin molecular ratio 3:1,ultrasound time 45 min, and ultrasound temperature 50C.The inclusion complex was analyzed using scanning electron microscope(SEM), infrared spectrometry(IR),X-ray diffraction (XRD)and solid-state nuclear magnetic resonance spectrometry (CP-MAS C NMR).The CD surface morphology change affected by the ligand,the major peak of C=O at ap- proximately 1.735 cm,new peaks in X-ray diffractograms,and CP-MAS C NMR spectra suggested the forma- tion of inclusion complex.The relationship between the retention rate of valeric acid and the time during release was described by a mathematical model of Avrami equation and the results showed that high relative humidity or high temperature increased the release of valeric acid. Key words:a-cyclodextrin;valeric acid;inclusion complexes;characterization;release character 戊酸是一种小分子风味成分，主要用以配制奶 性地包合一些非极性客体分子2-4。环糊精性质稳 油、干酪、奶油硬糖、草莓和朗姆酒等，但其强挥 定，耐热、耐酸及耐碱，无毒无害，且包合过程为 发性及低水溶性限制了它在食品工业中的的应用。 物理性变化，不会对芯材的化学性质产生影响，近 微胶囊技术是用材料包埋固体、液体或气体，保护 年来越来越多的人选择环糊精作为微胶囊壁材包合 芯材免受不利环境因素影响，以此提高产品的稳定 药物、脂类及各种挥发性风味物质41。本研究选择 性和货架期，并控制芯材释放的一种技术山。环糊 α-环糊精作为壁材，戊酸为芯材，探讨-环糊精与 精是一种由α-1,4糖苷键链接而成的环状低聚糖， 戊酸包合物制备的最佳参数，利用扫描电镜、红外 由于吡喃葡萄糖环C3,C;氢原子位于口腔内覆盖了 光谱、XRD、固体核磁共振对环糊精与戊酸间的包 配糖氧原子，使空腔成为疏水性空间，它们外亲水、 合关系进行解析，并对-环糊精戊酸包合物的释放 内疏水的特性，可以作为天然的微胶囊壁材，选择 学特性进行分析，为α-环糊精包合戊酸等类似风味 收稿日期：2015-03-03 基金项目：国家自然科学基金(31271960)”资助. 作者简介：曹胜男，硕士。E-mail:caoshengnanl990@163.com ◆通信作者：周裔彬，博士，教授。E-mail:zhouyibin@ahau.edu.cn
收稿日期: 2015-03-03 基金项目: 国家自然科学基金（31271960）”资助。 作者简介: 曹胜男，硕士。E-mail：caoshengnan1990@163.com * 通信作者: 周裔彬，博士，教授。E-mail：zhouyibin@ahau.edu.cn 安徽农业大学学报, 2015, 42(5): 700-705 Journal of Anhui Agricultural University [DOI] 10.13610/j.cnki.1672-352x.20150825.009 网络出版时间：2015-8-25 9:55:08 [URL] http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1162.S.20150825.0955.018.html α-环糊精戊酸包合物的制备及释放动力学研究 曹胜男，张 扬，金姗姗，张 舒，杨丽萍，周裔彬* (安徽农业大学茶与食品科技学院，合肥 230036) 摘 要：采用改进的共沉淀法制备 α-环糊精戊酸包合物。正交试验表明，制备 α-环糊精戊酸包合物的最佳参 数为：戊酸与 α-环糊精的摩尔比为 3:1，超声 45 min，超声温度 50℃，可获最大包合率为 52.79%；通过扫描电镜、 红外、XRD 和 CP-MAS 13C NMR 对包合物结构进行表征，环糊精表观形态改变，C=O 双键吸收峰出现，XRD 衍 射峰迁移和核磁碳谱戊酸化学位移出现，表明戊酸与 α-环糊精包合物的形成；利用 Avrami 方程对 α-环糊精戊酸包 合物在不同条件下的释放情况进行分析，结果表明湿度越大，温度越高释放速度越快。 关键词：α-环糊精；戊酸；包合物；表征；释放特性 中图分类号：TS201.2 文献标识码：A 文章编号：1672−352X (2015)05−0700−06 Preparation and release characterization of valeric acid-α-cyclodextrin inclusion complex CAO Shengnan, ZHANG Yang, JIN Shanshan, ZHANG Shu, YANG Liping, ZHOU Yibin (School of Tea and Food Science, Anhui Agricultural University, Hefei 230036) Abstract: The inclusion complex of valeric acid and α-cyclodextrin was prepared by a modified co-precipitation method. The results showed that the inclusion ratio of α-cyclodextrin complex could reach to 52.79% when the conditions were set to: valeric acid /α-cyclodextrin molecular ratio 3:1, ultrasound time 45 min, and ultrasound temperature 50℃. The inclusion complex was analyzed using scanning electron microscope(SEM), infrared spectrometry(IR), X-ray diffraction（XRD）and solid-state nuclear magnetic resonance spectrometry (CP-MAS 13C NMR). The CD surface morphology change affected by the ligand, the major peak of C=O at approximately 1.735 cm-1, new peaks in X-ray diffractograms, and CP-MAS 13C NMR spectra suggested the formation of inclusion complex. The relationship between the retention rate of valeric acid and the time during release was described by a mathematical model of Avrami equation and the results showed that high relative humidity or high temperature increased the release of valeric acid. Key words: α-cyclodextrin; valeric acid; inclusion complexes; characterization; release character 戊酸是一种小分子风味成分，主要用以配制奶 油、干酪、奶油硬糖、草莓和朗姆酒等，但其强挥 发性及低水溶性限制了它在食品工业中的的应用。 微胶囊技术是用材料包埋固体、液体或气体，保护 芯材免受不利环境因素影响，以此提高产品的稳定 性和货架期，并控制芯材释放的一种技术[1]。环糊 精是一种由 α-1, 4 糖苷键链接而成的环状低聚糖， 由于吡喃葡萄糖环 C3，C5 氢原子位于口腔内覆盖了 配糖氧原子，使空腔成为疏水性空间，它们外亲水、 内疏水的特性，可以作为天然的微胶囊壁材，选择 性地包合一些非极性客体分子[2-4]。环糊精性质稳 定，耐热、耐酸及耐碱，无毒无害，且包合过程为 物理性变化，不会对芯材的化学性质产生影响，近 年来越来越多的人选择环糊精作为微胶囊壁材包合 药物、脂类及各种挥发性风味物质[4-5]。本研究选择 α-环糊精作为壁材，戊酸为芯材，探讨 α-环糊精与 戊酸包合物制备的最佳参数，利用扫描电镜、红外 光谱、XRD、固体核磁共振对环糊精与戊酸间的包 合关系进行解析，并对 α-环糊精戊酸包合物的释放 学特性进行分析，为 α-环糊精包合戊酸等类似风味
42卷5期 曹胜男等：α-环糊精戊酸包合物的制备及释放动力学研究 701 成分的应用提供参考。 器有限公司)，400MHz布鲁赫核磁共振波普仪（德 1材料与方法 国布鲁仪器有限公司)。 1.2方法 1.1材料 1.2.1戊酸包合物的制备包合物制备采用经过预 试剂：α-环糊精（含量99%，成都格雷西亚化 实验后改进的共沉淀法56。称取α-环糊精0.5g于 学技术有限公司)：戊酸（含量99%，西格玛奥德 磨口具塞试管中，加入5mL蒸馏水，配成10%的 里奇公司)：正己烷(AR,国药集团化学试剂有限 环糊精溶液，于100℃中沸水浴40min使其完全溶 公司)：无水乙醇(AR,国药集团化学试剂有限公 解。α-环糊精溶液冷却至40℃后，将戊酸的乙醇溶 司)。 液(1：1，VV)缓慢逐滴加入α-环糊精溶液中，加 仪器：BSA224S型电子天平（北京赛多利斯科 塞密封后充分震荡混匀，50~70℃温度下超声反应 学仪器有限公司)：QL-901 Vortex漩涡混合器（海 30~60min。反应结束后将试管置于4℃条件下过夜， 门市其林贝尔仪器制造有限公司)：KQ-250DE型数 冷冻干燥后即得到α-环糊精戊酸包合物的白色粉 控超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）： 末，于4℃环境密封保存。 JW-3021HR高速冷冻离心机（安徽嘉文仪器装备有 1.2.2戊酸包合物制备正交试验根据预实验结果 限公司)：DK-S26型电热恒温水浴锅（上海精宏实 选取主客比(1：2、1：1、21、3：1和4：1)，包合时间 验设备有限公司)：安徽嘉文仪器装备有限公司： (15、30、45、60和75min),包合温度(40、50 FD-1A-50型冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限 60、70及80℃)为因素进行单因素实验，结果显示 公司)：7890B气相色谱仪（美国安捷伦科技有限公 随着主客比(A),时间(B),温度(C)的增大环糊 司)：S-4800扫描电镜（日本日立公司）：i50傅立 精包合率均出现先增加后平稳或下降的趋势。采用 叶变换红外光谱仪（美国尼高力仪器公司）：D8 L(3实验方法进行正交试验。因素水平表详见表1 ADVANCE多晶X射线粉末衍射仪（德国布鲁克仪 所示。 表1L(3正交试验因素及水平 Table 1 Factors and levels of orthogonal design 水平 因素Factor Level A戊酸a-环糊精分子摩尔比 B超声时间/min C超声温度/℃ Molecular ratio of valeric acid /a-cyclodextrin Ultrasound time Ultrasound temperature 1 1:1 30 50 2 21 45 60 3 3:1 60 70 1.2.3戊酸包合率的测定(1)标准曲线的绘制。 处理30min,使得戊酸从a-环糊精的空腔中转移到 将戊酸分散于正己烷中，配制成不同体积浓度的戊 正己烷中问。然后4200rmin离心处理10min以获 酸正己烷溶液（体积浓度分别为0.25、0.5、1.0、1.5、 得澄清的上清液，过滤膜后对上清液进行GC分析 2.0、2.5和3.0LmL),使用气相色谱(GC)分 得出相应的峰面积，使用回归方程计算出包合物中 析得出相应峰面积，以峰面积为横坐标，戊酸体积 戊酸的含量。 浓度为纵坐标绘制出标准曲线。得相应回归方程为 (4)包合率的计算。包合率(%)=包合物中 Y=0.0031X-0.0435(R2=0.9987)。 戊酸的含量(mol)/初始投入的戊酸的量(mol) (2)气相色谱条件。色谱柱为极性毛细管柱 ×100% DB-WAX毛细管柱(30m×0.32nm×0.25m):载 1.2.4包合物的表征(1)扫描电镜。对环糊精原 气为氨气，流速为10 mL.min；分流比为50：1；检 样及包合物进行扫描电镜测试。用导电双面胶将样 测器为FID:进样口温度和检测器温度分别为250 品固定在样品台上，喷镀铂金后在3kV条件下观察 ℃、275℃：柱箱温度为60℃保持1min后，以 环糊精及其包合物表面形态，放大倍率为600倍。 10℃min升至240℃。在此条件下，戊酸出峰时间 (2)红外光谱分析。分别对环糊精、戊酸及包 在12.58min,对称性良好。 合物进行红外光谱测试。固体样品采用KBr压片法 (3)包合物中戊酸的提取。称取包合物0.1g 处理，即将100 mg KBr与1mg样品在干燥状态下 分散于5mL正己烷中，密封后混匀并于60℃超声 充分研磨、混合均匀，然后压成约1mm厚的薄片
42 卷 5 期 曹胜男等: α-环糊精戊酸包合物的制备及释放动力学研究 701 成分的应用提供参考。 1 材料与方法 1.1 材料 试剂：α-环糊精（含量 99%，成都格雷西亚化 学技术有限公司）；戊酸（含量 99%，西格玛奥德 里奇公司）；正己烷（AR，国药集团化学试剂有限 公司）；无水乙醇（AR，国药集团化学试剂有限公 司）。 仪器：BSA224S 型电子天平（北京赛多利斯科 学仪器有限公司）；QL-901 Vortex 漩涡混合器（海 门市其林贝尔仪器制造有限公司）；KQ-250DE 型数 控超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）； JW-3021HR 高速冷冻离心机（安徽嘉文仪器装备有 限公司）；DK-S26 型电热恒温水浴锅（上海精宏实 验设备有限公司）；安徽嘉文仪器装备有限公司； FD-1A-50 型冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限 公司）；7890B 气相色谱仪（美国安捷伦科技有限公 司）；S-4800 扫描电镜（日本日立公司）；iS50 傅立 叶变换红外光谱仪（美国尼高力仪器公司）；D8 ADVANCE 多晶 X 射线粉末衍射仪（德国布鲁克仪 器有限公司），400 MHz 布鲁赫核磁共振波普仪（德 国布鲁仪器有限公司）。 1.2 方法 1.2.1 戊酸包合物的制备 包合物制备采用经过预 实验后改进的共沉淀法[5-6]。称取 α-环糊精 0.5 g 于 磨口具塞试管中，加入 5 mL 蒸馏水，配成 10%的 环糊精溶液，于 100℃中沸水浴 40 min 使其完全溶 解。α-环糊精溶液冷却至 40℃后，将戊酸的乙醇溶 液（1:1，V/V）缓慢逐滴加入 α-环糊精溶液中，加 塞密封后充分震荡混匀，50~70℃温度下超声反应 30~60 min。反应结束后将试管置于 4℃条件下过夜， 冷冻干燥后即得到 α-环糊精戊酸包合物的白色粉 末，于 4℃环境密封保存。 1.2.2 戊酸包合物制备正交试验 根据预实验结果 选取主客比（1:2、1:1、2:1、3:1 和 4:1），包合时间 （15、 30、45、60 和 75 min），包合温度(40、50、 60、70 及 80℃)为因素进行单因素实验，结果显示 随着主客比（A），时间（B），温度(C)的增大环糊 精包合率均出现先增加后平稳或下降的趋势。采用 L9(34 )实验方法进行正交试验。因素水平表详见表 1 所示。 表 1 L9(34 )正交试验因素及水平 Table 1 Factors and levels of orthogonal design 因素 Factor 水平 Level A 戊酸/α-环糊精分子摩尔比 Molecular ratio of valeric acid /α-cyclodextrin B 超声时间/min Ultrasound time C 超声温度/℃ Ultrasound temperature 1 1:1 30 50 2 2:1 45 60 3 3:1 60 70 1.2.3 戊酸包合率的测定 （1）标准曲线的绘制。 将戊酸分散于正己烷中，配制成不同体积浓度的戊 酸正己烷溶液（体积浓度分别为 0.25、0.5、1.0、1.5、 2.0、2.5 和 3.0 μL·mL-1），使用气相色谱（GC）分 析得出相应峰面积，以峰面积为横坐标，戊酸体积 浓度为纵坐标绘制出标准曲线。得相应回归方程为 Y=0.0031 X-0.0435（R2 =0.9987）。 （2）气相色谱条件。色谱柱为极性毛细管柱 DB-WAX 毛细管柱（30 m ×0.32 nm×0.25 μm）；载 气为氮气，流速为 10 mL·min-1；分流比为 50:1；检 测器为 FID；进样口温度和检测器温度分别为 250 ℃、275℃；柱箱温度为 60℃保持 1 min 后，以 10℃·min-1 升至 240℃。在此条件下，戊酸出峰时间 在 12.58 min，对称性良好。 （3）包合物中戊酸的提取。称取包合物 0.1 g 分散于 5 mL 正己烷中，密封后混匀并于 60℃超声 处理 30 min，使得戊酸从 α-环糊精的空腔中转移到 正己烷中[5]。然后 4200 r·min-1 离心处理 10 min 以获 得澄清的上清液，过滤膜后对上清液进行 GC 分析 得出相应的峰面积，使用回归方程计算出包合物中 戊酸的含量。 （4）包合率的计算。包合率（%）=包合物中 戊酸的含量（mol）/初始投入的戊酸的量（mol） ×100% 1.2.4 包合物的表征 （1）扫描电镜。对环糊精原 样及包合物进行扫描电镜测试。用导电双面胶将样 品固定在样品台上，喷镀铂金后在 3 kV 条件下观察 环糊精及其包合物表面形态，放大倍率为 600 倍。 （2）红外光谱分析。分别对环糊精、戊酸及包 合物进行红外光谱测试。固体样品采用 KBr 压片法 处理，即将 100 mg KBr 与 1 mg 样品在干燥状态下 充分研磨、混合均匀，然后压成约 1 mm 厚的薄片
702 安徽农业大学学报 2015年 后进行光谱扫描。戊酸液体采用KB涂膜法处理， KNO3盐溶液放置在干燥器内，干燥器内相对湿度 即取少量戊酸液体滴加到两片KB窗片中，压成薄 分别控制在55%、75%和90%左右，准确称取(1.5000 膜后进行扫描，扫描波数范围为500~4000cm,每 ±0.002)g环糊精包物物并平铺于干燥皿中，放入 条曲线扫描32次。 千燥器内，在25和4℃条件下进行释放试验，每天 (3)X-衍射分析。分别对α-环糊精及包合物 取出一个干燥皿测量α-环糊精戊酸包合物中的戊酸 进行X-衍射测试。测定条件为CuKa射线、管电压 含量，并计算回收率，代入Avrami方程进行拟合。 40kV、管电流200mA、扫描范围3-60°、扫描速 本实验的ln(-lnR)对lnk的回归分析，在4℃环境下， 率8()min、步长0.02°。 相对湿度55%、75%和90%条件下环糊精包合物的 (4)13C-固体核磁共振分析。分别对环糊精原 直线回归分析得到的相关系数R2分别为0.9576、 样和戊酸包合物进行3C℃-固体核磁共振分析。将样 0.9843和0.9245,25℃环境下，分别为0.9605、0.9852 品置于7mm固体核磁管，上机测试，场300MHz, 和0.9232，这表明戊酸的释放速率规律和Avrami 探头温度为20℃。 方程有较好的拟合精度山。 1.2.5包合物的释放试验近年来Avrami方程常 2 结果与分析 被用于环糊精包合物的释放模型上，方程如下： R=exp[-(ka)"门 2.1正交试验结果 其中R表示戊酸在释放之后的保留值，1是时间(s), -环糊精与戊酸包合反应后由粉末变为蓬松的 n代表着释放机理，而k则是释放的速率常数。理 白色泡沫状物质，质地均匀，易分散，微带粘性。 论上来说，=0.54，则代表着释放属于扩散控制的 极差分析（表2）表明，各因素对戊酸包合率的影 过程，而=1，则说明释放属于一级反应过程，即 响程度依次为A>C>B,即戊酸与α-环糊精的摩尔 反应速度只与反应物浓度的一次方成正比反应山。 比>超声温度>超声时间。方差结果（表3）表明， 对公式两边取2次对数，得到公式： 戊酸与α-环糊精的摩尔比对包合率在所考察的范围 ln(-lnR)=nln+nlnk。 内影响显著，而超声时间和超声温度在所考察的范 根据实验保留率数据，以lnt为横坐标、ln(lnR) 围内影响不显著。最佳包合条件为AB2C1,即戊酸 为纵坐标作图，再根据所得的线性回归方程可以计 与a-环糊精的摩尔比为3：1、超声时间为45min、 算出n和k的值。 超声温度为50℃时可获得最大包合率，为52.79%。 释放实验主要考查-环糊精戊酸包合物在25 本实验与传统制备环糊精包合物的方法相比较，加 ℃和4℃2种常用食品贮藏温度，相对湿度为55%、 强了环糊精溶解步骤，对环糊精进行了彻底糊化， 75%和90%条件下的释放情况。采用饱和盐溶液法 而不是仅仅溶解，与传统制备环糊精包合物的方法 控制湿度，即将配置好的饱和MgNO3)2,NaCl, 相比较具有包合时间短，得率高等特点6-刃。 表2正交试验结果（α-环糊精戊酸包合物） Table 2 Results of orthogonal test on inclusion condition of a-cyclodextrin complex 试验号 A摩尔比 B超声时间 C超声温度 D空列 包合率% Test number Molar ratio Ultrasound time Ultrasound temperature Blank column Inclusion rate 1 1 1 1 3.4586 2 1 2 2 2 2.7523 3 1 3 3 3 13.637 4 2 1 2 3 5.7947 J 2 2 2 1 5.6772 6 2 3 1 2 3.852 7 3 3 2 21.659 8 3 2 1 2 52.791 9 3 3 2 1 15.633 KI 6.616 10.304 20.034 8.256 K2 5.108 20.407 8.060 9.421 K3 30.028 11.041 13.658 24.047 R 24.920 10.103 11.947 15.818
702 安 徽 农 业 大 学 学 报 2015 年 后进行光谱扫描。戊酸液体采用 KBr 涂膜法处理， 即取少量戊酸液体滴加到两片 KBr 窗片中，压成薄 膜后进行扫描，扫描波数范围为 500~4000 cm-1，每 条曲线扫描 32 次。 （3）X-衍射分析。分别对 α-环糊精及包合物 进行 X-衍射测试。测定条件为 Cu Kα 射线、管电压 40 kV、管电流 200 mA、扫描范围 3~60°、扫描速 率 8(°)·min-1、步长 0.02°。 （4）13C-固体核磁共振分析。分别对环糊精原 样和戊酸包合物进行 13C-固体核磁共振分析。将样 品置于 7 mm 固体核磁管，上机测试，场 300 MHz, 探头温度为 20℃。 1.2.5 包合物的释放试验 近年来 Avrami 方程常 被用于环糊精包合物的释放模型上，方程如下： R=exp[-(kt) n ] 其中 R 表示戊酸在释放之后的保留值，t 是时间（s）， n 代表着释放机理，而 k 则是释放的速率常数。理 论上来说，n=0.54，则代表着释放属于扩散控制的 过程，而 n=1，则说明释放属于一级反应过程，即 反应速度只与反应物浓度的一次方成正比反应[1]。 对公式两边取 2 次对数，得到公式： ln(-lnR)=nlnt+nlnk。 根据实验保留率数据，以 lnt 为横坐标、ln(-lnR) 为纵坐标作图，再根据所得的线性回归方程可以计 算出 n 和 k 的值。 释放实验主要考查 α-环糊精戊酸包合物在 25 ℃和 4℃ 2 种常用食品贮藏温度，相对湿度为 55%、 75%和 90%条件下的释放情况。采用饱和盐溶液法 控制湿度，即将配置好的饱和 Mg(NO3)2, NaCl, KNO3 盐溶液放置在干燥器内，干燥器内相对湿度 分别控制在55%、75%和90%左右，准确称取（1.5000 ±0.002）g 环糊精包物物并平铺于干燥皿中，放入 干燥器内，在 25 和 4℃条件下进行释放试验，每天 取出一个干燥皿测量 α-环糊精戊酸包合物中的戊酸 含量，并计算回收率，代入 Avrami 方程进行拟合。 本实验的 ln(-lnR)对 lnk 的回归分析，在 4℃环境下， 相对湿度 55%、75%和 90%条件下环糊精包合物的 直线回归分析得到的相关系数 R2 分别为 0.9576、 0.9843 和 0.9245，25℃环境下，分别为 0.9605、0.9852 和 0.9232，这表明戊酸的释放速率规律和 Avrami 方程有较好的拟合精度[1]。 2 结果与分析 2.1 正交试验结果 α-环糊精与戊酸包合反应后由粉末变为蓬松的 白色泡沫状物质，质地均匀，易分散，微带粘性。 极差分析（表 2）表明，各因素对戊酸包合率的影 响程度依次为 A＞C＞B，即戊酸与 α-环糊精的摩尔 比＞超声温度＞超声时间。方差结果（表 3）表明， 戊酸与 α-环糊精的摩尔比对包合率在所考察的范围 内影响显著，而超声时间和超声温度在所考察的范 围内影响不显著。最佳包合条件为 A3B2C1，即戊酸 与 α-环糊精的摩尔比为 3:1、超声时间为 45 min、 超声温度为 50℃时可获得最大包合率，为 52.79%。 本实验与传统制备环糊精包合物的方法相比较，加 强了环糊精溶解步骤，对环糊精进行了彻底糊化， 而不是仅仅溶解，与传统制备环糊精包合物的方法 相比较具有包合时间短，得率高等特点[6-7]。 表 2 正交试验结果（α-环糊精戊酸包合物） Table 2 Results of orthogonal test on inclusion condition of α-cyclodextrin complex 试验号 Test number A 摩尔比 Molar ratio B 超声时间 Ultrasound time C 超声温度 Ultrasound temperature D 空列 Blank column 包合率/% Inclusion rate 1 1 1 1 1 3.4586 2 1 2 2 2 2.7523 3 1 3 3 3 13.637 4 2 1 2 3 5.7947 5 2 2 3 1 5.6772 6 2 3 1 2 3.852 7 3 1 3 2 21.659 8 3 2 1 3 52.791 9 3 3 2 1 15.633 K1 6.616 10.304 20.034 8.256 K2 5.108 20.407 8.060 9.421 K3 30.028 11.041 13.658 24.047 R 24.920 10.103 11.947 15.818
42卷5期 曹胜男等：α-环糊精戊酸包合物的制备及释放动力学研究 703 表3方差分析（α-环糊精戊酸包合物） Table 3 Results of variance analysis of a-cyclodextrin complex 方差来源 离差平方和 自由度 F比 F临界值 显著性 Variance SS DF Fratio critical value Significance A 1171.37 2 4.030 3.640 P0.1 c 215.36 2 0.74 3.640 P>0.1 总和Total 871.98 6 A:a-环糊精：B:a-环糊精戊酸包合物 A a-cyclodextrin B:inclusion complexes of a-cyclodextrin and valeric acid 图1环糊精及其包合物扫描电镜图 20 Figure 1 SEM micrographs of a-cyclodextrin and its inclu- 2Theta() sion complex A:a-环糊精：B:a-环糊精戊酸包合物 A:a-cyclodextrin:B:inclusion complexes 图3环糊精及戊酸包合物XRD谱图 Figure 3 X-ray diffraction patterns of a-cyclodextrin and its inclusion complex 人N 20002300200 1800 100000 Wavenumber(cm' A:a-环糊精：B:戊酸：C:Q-环糊精戊酸包合物 A:a-cyclodextrin:B:valeric acid;C:inclusion complexes of a-cyclodextrin and valeric acid 300 460 100 图2戊酸、环糊精及其包合物红外光谱图 ppm Figure 2 IR spectra of valeric acid,a-cyclodextrin and their inclusion complex A:-环糊精：B:d-环糊精戊酸包合物 A a-cyclodextrin;B:inclusion complexes of 2.2扫描电镜结果分析 a-cyclodextrin and valeric acid 通过扫描电镜观察环糊精与包合物表面形态的 图4环糊精及戊酸包合物XRD谱图 Figure 4 The CP-MAS C NMR spectra of a-cyclodextrin 差异，判断包合物是否形成新的物相。图1为-环 and its inclusion complex 糊精及其戊酸包合物的扫描电镜结果，放大倍率为 600倍。图中（图1A、图1B)显示a环糊精原样 图。从a-环糊精的红外光谱图（图2A)可以看出， 为大小不均一的块状结构，且表面凹凸不平，质地 a-环糊精主要在3404cm'处有缔合O-H的伸缩振 较松散，而包合之后的α-环糊精呈表面光滑的片层 动吸收峰：C-H的伸缩振动吸收峰在2927cm'处： 结构，质地也变得紧密，这些变化都说明了包合物 在1641cm左右有H-0-H吸收峰：在1156、1077 的形成8。 cm处有C-0的伸缩振动吸收峰：在1031cm处 2.3红外光谱分析 有C-C伸缩振动吸收峰9。戊酸在2962、2875cm 图2为戊酸、α-环糊精及其包合物的红外光谱 处有C-H的伸缩振动吸收峰：在1713cm处有C=O
42 卷 5 期 曹胜男等: α-环糊精戊酸包合物的制备及释放动力学研究 703 表 3 方差分析（α-环糊精戊酸包合物） Table 3 Results of variance analysis of α-cyclodextrin complex 方差来源 Variance 离差平方和 SS 自由度 DF F 比 F ratio F 临界值 critical value 显著性 Significance A 1171.37 2 4.030 3.640 P＜0.1 B 190.33 2 0.655 3.640 P＞0.1 C 215.36 2 0.74 3.640 P＞0.1 总和 Total 871.98 6 A：α-环糊精；B：α-环糊精戊酸包合物 A ： α-cyclodextrin ； B ： inclusion complexes of α-cyclodextrin and valeric acid 图 1 环糊精及其包合物扫描电镜图 Figure 1 SEM micrographs of α- cyclodextrin and its inclusion complex A：α-环糊精；B： 戊酸； C：α-环糊精戊酸包合物 A：α-cyclodextrin；B：valeric acid; C: inclusion complexes of α-cyclodextrin and valeric acid 图 2 戊酸、环糊精及其包合物红外光谱图 Figure 2 IR spectra of valeric acid, α- cyclodextrin and their inclusion complex 2.2 扫描电镜结果分析 通过扫描电镜观察环糊精与包合物表面形态的 差异，判断包合物是否形成新的物相。图 1 为 α-环 糊精及其戊酸包合物的扫描电镜结果，放大倍率为 600 倍。图中（图 1A、图 1B）显示 α 环糊精原样 为大小不均一的块状结构，且表面凹凸不平，质地 较松散，而包合之后的 α-环糊精呈表面光滑的片层 结构，质地也变得紧密，这些变化都说明了包合物 的形成[8]。 2.3 红外光谱分析 图 2 为戊酸、α-环糊精及其包合物的红外光谱 A：α-环糊精；B：α-环糊精戊酸包合物 A：α-cyclodextrin；B：inclusion complexes 图 3 环糊精及戊酸包合物 XRD 谱图 Figure 3 X-ray diffraction patterns of α- cyclodextrin and its inclusion complex A：α-环糊精；B：α-环糊精戊酸包合物 A ： α-cyclodextrin ； B ： inclusion complexes of α-cyclodextrin and valeric acid 图 4 环糊精及戊酸包合物 XRD 谱图 Figure 4 The CP–MAS 13C NMR spectra of α- cyclodextrin and its inclusion complex 图。从 α-环糊精的红外光谱图（图 2A）可以看出， α-环糊精主要在 3404 cm-1 处有缔合 O-H 的伸缩振 动吸收峰；C-H 的伸缩振动吸收峰在 2927 cm-1 处； 在 1641 cm-1 左右有 H-O-H 吸收峰；在 1156、1077 cm -1 处有 C-O 的伸缩振动吸收峰；在 1031 cm-1处 有 C-C 伸缩振动吸收峰[9]。戊酸在 2962、2875 cm-1 处有 C-H 的伸缩振动吸收峰；在 1713 cm-1处有 C=O
704 安徽农业大学学报 2015年 的伸缩振动吸收峰：在1457、1381cm处有C-H 低，环糊精由晶体结构向无序状态转变山。 的弯曲振动吸收峰：在1215cm处有C-O-C的伸 2.5CP-MAS13CNMR核磁共振分析 缩振动吸收峰：在1109cm处有C-C的伸缩振动 图4为-环糊精和环糊精戊酸包合物的13℃固 吸收峰。由于环糊精包合物中戊酸的含量较低（质 体核磁共振图谱。从环糊精（图4A)的核磁共 量分数为10.5%)且环糊精的峰几乎覆盖了整个扫 振图谱中可以看出，C1的化学位移为102.01和97.23 描区域，环糊精戊酸包合物的红外光谱与环糊精原 ppm的分裂峰，这是因为a-环糊精只由5个葡萄糖 样区别不大。但是环糊精不含双键，因此戊酸在 残基组成，它的一个吡喃葡萄糖单元处于扭曲状态， 1713cm处的C=0伸缩振动吸收峰未被遮蔽，能 C2、C3、C4、C5和C6的化学位移分别在71.97,71.97 够明显的说明环糊精与戊酸形成了包合物。且环糊 81.55,71.97和60.78ppm。-环糊精戊酸包合物（图 精包合物相对于环糊精原样峰的位置并没有发生迁 4B)的核磁共振图谱与环糊精环原样相比，环糊精 移，说明在包合过程中没有新的化学键产生，α-环 骨架有部分化学位移，C1、C2、C、C4、C5和C6 糊精包合戊酸为物理性结合而非化学性结合1)。 的化学位移迁移至100.88、72.24、72.24、81.12、 2.4XRD衍射峰分析 72.24和60.48ppm:与原样相比环糊精戊酸包合物 从图3中可以看出，环糊精的衍射峰在包合前 还出现了一些新的化学位移，180ppm处的峰为戊 后发生了改变。α-环糊精（图3A)的衍射峰集中在 酸羧基碳的化学位移，60ppm以下为戊酸的4个甲 20=10.36~40.94°左右，最强峰出现在11.86、12.1 基和亚甲基碳，这些峰的位移证明了环糊精与戊酸 和14.26°等处。而a-环糊精戊酸（图3B)包合物的 发生了反应，生成了新的包合物。同时与环糊精 XRD衍射峰与环糊精原样相比衍射峰明显减少，在 原样相比，环糊精戊酸包合物的核磁共振图谱曲线 20大于19.6°范围内基本无衍射峰，且它的最强峰 平滑，C1的双头峰消失，这是因为戊酸进入环糊精 出现在2020.04、11.38和12.16°等处，说明戊酸与 空腔后，与环糊精形成线性包合物，空腔被扩张， 环糊精形成包合物后晶体形态发生了变化，同时衍 形成空间结构更加对称的包合物) 射峰的减少和变宽也说明了环糊精包合后结晶度降 表4不同温度下的释放参数 Table 4 Release character under different conditions RH* 4℃ 25℃ % Avrami quation R2 n K(d") Avrami quation R n K(d") 55±3 J=0.4395x-0.7697 0.9576 0.4395 2.01×106 =0.4759x-0.8631 0.9852 0.4759 1.887×106 75±3 =0.343x-0.4549 0.9843 0.3430 3.07×106 1=0.6058x-0.5445 0.9605 0.6058 4.711×106 90±3 1=0.2596x-0.062 0.9245 0.2596 9.11×106 1=0.4305x+0.1297 0.9232 0.4305 1.564×105 2.6 释放实验结果 要大于温度。我们认为出现这种现象的原因可能是 从表4中可以看出戊酸在4℃相对湿度55%、 戊酸包合物的壁材α-环糊精吸收水分，水分子的渗 75%和90%条件下的释放参数分别为0.4395、0.343 透使得环糊精的干燥颗粒缓慢浸润，导致环糊精的 和0.2596,25℃条件下为0.4759、0.6058和0.4305， 活化从而释放出戊酸，4。 均与0.54接近，说明-环糊精包合物中的戊酸的释 3结论 放为扩散限制动力学反应。通过表4还可以看出相 对湿度55%、75%和90%条件下的释放速率常数k 3.1包合物的制备 为2.009×106、3.073×106和9.115×106，说明在4 根据正交试验结果，确定制备α-环糊精包合物 ℃条件下湿度越大，戊酸的释放速率越快，25℃相 的最佳参数为：戊酸与-环糊精的摩尔比为3：1， 对湿度55%、75%和90%条件下的释放速率常数k 超声45min,超声温度为50℃，最大包合率为 分别为1.887×106、4.711×106和1.564×103，与4℃ 52.79%,说明本制备α-环糊精戊酸包合物的方法包 情况下类似，释放速率随着湿度的增大而增大，且 合率高。 比较相同湿度不同温度下的释放速率常数k可知， 3.2包合物的表征 25℃的释放速率大于4℃下的释放速率。同时也能 对所制备的包合物进行SEM、红外、XRD, 看出，温度对α-环糊精戊酸包合物释放速度的影响 CP-MASI3CNMR分析环糊精在包合前后表面形态
704 安 徽 农 业 大 学 学 报 2015 年 的伸缩振动吸收峰；在 1457、1381 cm-1 处有 C-H 的弯曲振动吸收峰；在 1215 cm-1 处有 C-O-C 的伸 缩振动吸收峰；在 1109 cm-1 处有 C-C 的伸缩振动 吸收峰。由于环糊精包合物中戊酸的含量较低（质 量分数为 10.5%）且环糊精的峰几乎覆盖了整个扫 描区域，环糊精戊酸包合物的红外光谱与环糊精原 样区别不大[10]。但是环糊精不含双键，因此戊酸在 1713 cm-1 处的 C=O 伸缩振动吸收峰未被遮蔽，能 够明显的说明环糊精与戊酸形成了包合物。且环糊 精包合物相对于环糊精原样峰的位置并没有发生迁 移，说明在包合过程中没有新的化学键产生，α-环 糊精包合戊酸为物理性结合而非化学性结合[10]。 2.4 XRD 衍射峰分析 从图 3 中可以看出，环糊精的衍射峰在包合前 后发生了改变。α-环糊精（图 3A）的衍射峰集中在 2θ =10.36 ~ 40.94o 左右，最强峰出现在 11.86、12.1 和 14.26o 等处。而 α-环糊精戊酸（图 3B）包合物的 XRD 衍射峰与环糊精原样相比衍射峰明显减少，在 2θ 大于 19.6°范围内基本无衍射峰，且它的最强峰 出现在 2θ=20.04、11.38 和 12.16o 等处，说明戊酸与 环糊精形成包合物后晶体形态发生了变化，同时衍 射峰的减少和变宽也说明了环糊精包合后结晶度降 低，环糊精由晶体结构向无序状态转变[11]。 2.5 CP-MAS 13C NMR 核磁共振分析 图 4 为 α-环糊精和环糊精戊酸包合物的 13C 固 体核磁共振图谱。从 α-环糊精（图 4A）的核磁共 振图谱中可以看出，C1的化学位移为102.01和97.23 ppm 的分裂峰，这是因为 α-环糊精只由 5 个葡萄糖 残基组成，它的一个吡喃葡萄糖单元处于扭曲状态， C2、C3、C4、C5 和 C6 的化学位移分别在 71.97, 71.97, 81.55，71.97 和 60.78 ppm。α-环糊精戊酸包合物（图 4B）的核磁共振图谱与环糊精环原样相比，环糊精 骨架有部分化学位移，C1、C2、C3、C4、C5 和 C6 的化学位移迁移至 100.88、 72.24、72.24、 81.12、 72.24 和 60.48 ppm；与原样相比环糊精戊酸包合物 还出现了一些新的化学位移，180 ppm 处的峰为戊 酸羧基碳的化学位移，60 ppm 以下为戊酸的 4 个甲 基和亚甲基碳，这些峰的位移证明了环糊精与戊酸 发生了反应，生成了新的包合物[12]。同时与环糊精 原样相比，环糊精戊酸包合物的核磁共振图谱曲线 平滑，C1 的双头峰消失，这是因为戊酸进入环糊精 空腔后，与环糊精形成线性包合物，空腔被扩张， 形成空间结构更加对称的包合物[13]。 表 4 不同温度下的释放参数 Table 4 Release character under different conditions RH* 4℃ 25℃ /% Avrami quation R2 n K(d-n) Avrami quation R2 n K(d-n) 55±3 y=0.4395x-0.7697 0.9576 0.4395 2.01×10-6 y=0.4759x-0.8631 0.9852 0.4759 1.887×10-6 75±3 y=0.343x-0.4549 0.9843 0.3430 3.07×10-6 y=0.6058x-0.5445 0.9605 0.6058 4.711×10-6 90±3 y=0.2596x-0.062 0.9245 0.2596 9.11×10-6 y=0.4305x+0.1297 0.9232 0.4305 1.564×10-5 2.6 释放实验结果 从表 4 中可以看出戊酸在 4℃相对湿度 55%、 75%和 90%条件下的释放参数分别为 0.4395、0.343 和 0.2596，25℃条件下为 0.4759、0.6058 和 0.4305， 均与 0.54 接近，说明 α-环糊精包合物中的戊酸的释 放为扩散限制动力学反应。通过表 4 还可以看出相 对湿度 55%、75%和 90%条件下的释放速率常数 k 为 2.009×10-6、3.073×10-6 和 9.115×10-6，说明在 4 ℃条件下湿度越大，戊酸的释放速率越快，25℃相 对湿度 55%、75%和 90%条件下的释放速率常数 k 分别为 1.887×10-6、4.711×10-6 和 1.564×10-5，与 4℃ 情况下类似，释放速率随着湿度的增大而增大，且 比较相同湿度不同温度下的释放速率常数 k 可知， 25℃的释放速率大于 4℃下的释放速率。同时也能 看出，温度对 α-环糊精戊酸包合物释放速度的影响 要大于温度。我们认为出现这种现象的原因可能是 戊酸包合物的壁材 α-环糊精吸收水分，水分子的渗 透使得环糊精的干燥颗粒缓慢浸润，导致环糊精的 活化从而释放出戊酸[1,14]。 3 结论 3.1 包合物的制备 根据正交试验结果，确定制备 α-环糊精包合物 的最佳参数为：戊酸与 α-环糊精的摩尔比为 3:1， 超声 45 min，超声温度为 50℃，最大包合率为 52.79%，说明本制备 α-环糊精戊酸包合物的方法包 合率高。 3.2 包合物的表征 对所制备的包合物进行 SEM、红外、XRD, CP-MAS 13C NMR 分析环糊精在包合前后表面形态
42卷5期 曹胜男等：α-环糊精戊酸包合物的制备及释放动力学研究 705 由块状变为片状：包合物出现戊酸的特征峰且无新 [刀冯江涛，延卫，徐浩，等.1甲基环丙烯与-环糊精包 的吸收峰出现，表明丁酸乙酯与环糊精发生包合但 合物的合成).应用化学，2010,27(1)少82-86. 没有发生化学反应：XRD衍射峰的改变证明环糊精 [8]Kiruba K,Valetie O,Thangavel K.Synthesis and charac- terization of nano-encapsulated catechin by molecular in- 由晶体向无序状态变化：核磁共振波普显示α-环糊 clusion with beta-cyclodextrin[J].Journal of Food Engi- 精在包合戊酸后空间结构更加对称。 neering.2012.111:255-264. 33环糊精包合物的释放特性 [9]Wang J.Cao Y.Sun B,et al.Physicochemical and release characterization of garlic oil-B-cyclodextrin inclusion 湿度越大，戊酸释放越快：温度越高，释放速 complexes[J].Food Chemistry,2011,127:1680-1685. 率越快，说明α-环糊精戊酸包合物的贮藏应选取低 [10]金征宇，徐学明，陈寒青，等.环糊精化学一制备与 温干燥的条件。 应用M.北京：化学工业出版社，2009：3-8 [11]Onanong N,Somsak S,Issara S,et al.Physicochemical 参考文献： investigation and molecular modeling of cyclodextrin complexation mechanism with eugenol[J].Food Research [1]马云标，周惠明宰，朱科学.VE微胶囊的制备及性质研 International,2009,42:1178-1185. 究.食品科学，201031(2)：1-4. [12]Jiang H M,Sun H J,Zhang S B.NMR investigations of [2]Okumura H,Kawaguchi Y and Harada A.Preparation and inclusion complexes between beta-cyclodextrin and characterization of the inclusion complexes of poly (di- naphthalene/anthraquinone derivatives[J].Journal of In- methylsilane)s with cyclodextrins[J.Macromolecules, clusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry,2007, 2003,36:6422-6429 58(1/2):133-138. [3]Szejtli J.Selectivity/structure correlation in cyclodextrin [13]Ge X,He J,Qi F,et al.Inclusion complexation of chloro- chemistry[J].Supramolecular Chemistry,1995(6):217-223. propham with B-cyclodextrins:Preparation,characteriza- [4)]周春晖，黄惠华.环糊精性质及其在食品工业中应用 tion and molecular modeling[J.Spectrochimica Acta Part J.粮食与油脂，2000(5)：30-32. A:Molecular and Biomolecular Sptctroscopy,2011,81: [S]张扬，周裔彬，曹胜男，等.B和Y-环糊精与丁酸乙酯包 397-403. 合物的制备及结构表征).食品与发酵工业，2014(9)： [14]Seo E J,Min S G and Choi M J.Release characteristics of freeze-dried eugenol encapsulated with B-cyclodextrin by 34-38 molecular inclusion method []Journal of Microencapsu- [6]邓靖，谭兴和，刘婷婷，等.肉桂精油-阝环糊精微胶囊 lation,2010:27(6:496-505. 的制备).中国粮油学报，2011,26(2)：89-91,97
42 卷 5 期 曹胜男等: α-环糊精戊酸包合物的制备及释放动力学研究 705 由块状变为片状；包合物出现戊酸的特征峰且无新 的吸收峰出现，表明丁酸乙酯与环糊精发生包合但 没有发生化学反应；XRD 衍射峰的改变证明环糊精 由晶体向无序状态变化；核磁共振波普显示 α-环糊 精在包合戊酸后空间结构更加对称。 3.3 环糊精包合物的释放特性 湿度越大，戊酸释放越快；温度越高，释放速 率越快，说明 α-环糊精戊酸包合物的贮藏应选取低 温干燥的条件。 参考文献： [1] 马云标, 周惠明宰, 朱科学. VE 微胶囊的制备及性质研 究[J]. 食品科学, 2010, 31(2): 1-4. [2] Okumura H, Kawaguchi Y and Harada A. Preparation and characterization of the inclusion complexes of poly (dimethylsilane)s with cyclodextrins[J]. Macromolecules, 2003, 36: 6422-6429. [3] Szejtli J. Selectivity/structure correlation in cyclodextrin chemistry[J]. Supramolecular Chemistry, 1995(6): 217- 223. [4] 周春晖, 黄惠华. 环糊精性质及其在食品工业中应用 [J]. 粮食与油脂, 2000(5): 30-32. [5] 张扬, 周裔彬, 曹胜男, 等. β-和γ-环糊精与丁酸乙酯包 合物的制备及结构表征[J]. 食品与发酵工业, 2014(9): 34-38. [6] 邓靖, 谭兴和, 刘婷婷, 等. 肉桂精油-β-环糊精微胶囊 的制备[J]. 中国粮油学报, 2011, 26(2): 89-91; 97. [7] 冯江涛, 延卫, 徐浩, 等. 1-甲基环丙烯与 α-环糊精包 合物的合成[J]. 应用化学, 2010, 27(1): 82-86. [8] Kiruba K, Valetie O, Thangavel K. Synthesis and characterization of nano-encapsulated catechin by molecular inclusion with beta-cyclodextrin[J]. Journal of Food Engineering, 2012, 111: 255-264. [9] Wang J, Cao Y, Sun B, et al. Physicochemical and release characterization of garlic oil-β-cyclodextrin inclusion complexes[J].Food Chemistry, 2011, 127: 1680-1685. [10] 金征宇, 徐学明, 陈寒青, 等. 环糊精化学——制备与 应用[M]. 北京: 化学工业出版社, 2009: 3-8. [11] Onanong N, Somsak S, Issara S, et al. Physicochemical investigation and molecular modeling of cyclodextrin complexation mechanism with eugenol[J]. Food Research International, 2009, 42: 1178-1185. [12] Jiang H M, Sun H J, Zhang S B. NMR investigations of inclusion complexes between beta-cyclodextrin and naphthalene/anthraquinone derivatives[J]. Journal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry, 2007, 58(1/2): 133-138. [13] Ge X, He J, Qi F, et al. Inclusion complexation of chloropropham with β-cyclodextrins: Preparation, characterization and molecular modeling[J]. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Sptctroscopy, 2011, 81: 397-403. [14] Seo E J, Min S G and Choi M J. Release characteristics of freeze-dried eugenol encapsulated with β-cyclodextrin by molecular inclusion method [J].Journal of Microencapsulation, 2010; 27(6): 496-505
