第九章 生物技术育种 任何园艺作物新品种的培育都要有可利用的遗传变异，而育种工作中又常面临着具有优 良性状的种质材料少、群体大小有限、性状选择效率低、工作量大等困难。因此，培育一个 优良品种所需时间长，即使是一年生蔬菜作物，也要经过许多年才能育成一个新品种，多年 生果树就更长。育种工作者经常试图利用温室加代和南繁来缩短时间以加速育种进程：在群 体大小方面，常常需要在最大的理想群体和经济上许可的现实群体大小之间进行折中。如果 群体太小，将可能会由于遗传漂变等因素影响而丢失理想的基因型。 生物技术(Biotechnology),又称生物工程，是指以现代生命科学为基础，结合先进的工 程技术手段和其他基础学科的科学原理，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人 类生产出所需产品的技术体系。生物技术是一门新兴的、综合性的学科，涉及微生物学、生 物化学、细胞生物学、免疫学、育种技术等几乎所有与生命科学有关的学科，特别是现代分 子生物学的最新理论成就更是生物技术发展的基础。我国早在1986年初制定的《高技术研究 发展计划纲要》中就将生物技术列于航天技术、信息技术、激光技术、自动化技术等高技术 的首位。专家预计，生物技术将是21世纪高技术革命的核心内容，生物技术产业将是2！世 纪的支柱产业。广义上讲，生物技术包括传统生物技术和现代生物技术两部分。现代生物技 术是指上世纪70年代末80年代初发展起来的，以现代生物学研究成果为基础，以基因工程 为核心的新兴学科。目前所称的生物技术基本上都是指现代生物技术。 根据生物技术操作的对象及操作技术的不同，生物技术主要包括以下5项技术工程：基 因工程（也称DNA重组技术）入、细胞工程、酶工程、发酵工程和蛋白质工程（指在基因工程 的基础上，结合蛋白质结晶学、计算机辅助设计和蛋白质化学等多学科的基础知识，通过对 基因的人工定向改造等手段，从而达到对蛋白质进行修饰、改造、拼接以产生能满足人类需 要的新型蛋白质)等。在园艺作物遗传与新品种培育过程中，应用得最多的是细胞工程、基 因工程以及近年来发展的分子标记技术等。人们运用细胞工程进行繁殖新种质、新品种，创 造新种质：通过基因工程手段改进某一或多个重要园艺性状：利用分子标记技术进行品种登 记、纯度鉴定、重要性状位点标记，以提高育种中性状选择效率。本章将简要地介绍现代植 物生物技术基本原理以及在园艺作物育种上的应用。 第一节 细胞工程育种 植物细胞工程指以植物细胞为操纵对象，在体外进行培养、繁殖，或人为地使细胞某些 生物学特性按人们的意愿发生改变，从而达到改良生物品种和创造新品种，加速繁育动、植 物个体，以获得某种有用物质的过程。主要包括园艺植物离体培养以及以此为基础的细胞融 合技术（也称体细胞杂交技木）、细胞器移植技术、染色体工程、倍性育种等。 一、园艺植物离体培养 (一)植物离体培养的概念
1 第九章 生物技术育种 任何园艺作物新品种的培育都要有可利用的遗传变异，而育种工作中又常面临着具有优 良性状的种质材料少、群体大小有限、性状选择效率低、工作量大等困难。因此，培育一个 优良品种所需时间长，即使是一年生蔬菜作物，也要经过许多年才能育成一个新品种，多年 生果树就更长。育种工作者经常试图利用温室加代和南繁来缩短时间以加速育种进程；在群 体大小方面，常常需要在最大的理想群体和经济上许可的现实群体大小之间进行折中。如果 群体太小，将可能会由于遗传漂变等因素影响而丢失理想的基因型。 生物技术（Biotechnology），又称生物工程，是指以现代生命科学为基础，结合先进的工 程技术手段和其他基础学科的科学原理，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人 类生产出所需产品的技术体系。生物技术是一门新兴的、综合性的学科，涉及微生物学、生 物化学、细胞生物学、免疫学、育种技术等几乎所有与生命科学有关的学科，特别是现代分 子生物学的最新理论成就更是生物技术发展的基础。我国早在 1986 年初制定的《高技术研究 发展计划纲要》中就将生物技术列于航天技术、信息技术、激光技术、自动化技术等高技术 的首位。专家预计，生物技术将是 2l 世纪高技术革命的核心内容，生物技术产业将是 2l 世 纪的支柱产业。广义上讲，生物技术包括传统生物技术和现代生物技术两部分。现代生物技 术是指上世纪 70 年代末 80 年代初发展起来的，以现代生物学研究成果为基础，以基因工程 为核心的新兴学科。目前所称的生物技术基本上都是指现代生物技术。 根据生物技术操作的对象及操作技术的不同，生物技术主要包括以下 5 项技术工程：基 因工程（也称 DNA 重组技术）、细胞工程、酶工程、发酵工程和蛋白质工程（指在基因工程 的基础上，结合蛋白质结晶学、计算机辅助设计和蛋白质化学等多学科的基础知识，通过对 基因的人工定向改造等手段，从而达到对蛋白质进行修饰、改造、拼接以产生能满足人类需 要的新型蛋白质）等。在园艺作物遗传与新品种培育过程中，应用得最多的是细胞工程、基 因工程以及近年来发展的分子标记技术等。人们运用细胞工程进行繁殖新种质、新品种，创 造新种质；通过基因工程手段改进某一或多个重要园艺性状；利用分子标记技术进行品种登 记、纯度鉴定、重要性状位点标记，以提高育种中性状选择效率。本章将简要地介绍现代植 物生物技术基本原理以及在园艺作物育种上的应用。 第一节 细胞工程育种 植物细胞工程指以植物细胞为操纵对象，在体外进行培养、繁殖，或人为地使细胞某些 生物学特性按人们的意愿发生改变，从而达到改良生物品种和创造新品种，加速繁育动、植 物个体，以获得某种有用物质的过程。主要包括园艺植物离体培养以及以此为基础的细胞融 合技术（也称体细胞杂交技木）、细胞器移植技术、染色体工程、倍性育种等。 一、园艺植物离体培养 （一）植物离体培养的概念
植物离体培养(in vitro culture)即广义的组织培养，是现代生物技术的一个重要组成部 分，它是指运用无菌操作技术，将从植物体分离的符合需要的组织、器官或细胞（包括去壁 后的原生质体)等，接种在人工培养基上，置于人工控制的环境条件下进行培养，以获得再 生的完整植株或生产具有经济价值的其它生物产品的技术。在植物离体培养中，用于接种的 材料叫作外植体(explant)。按照外植体的不同，植物离体培养可以分为： I、胚胎培养(embryo culture)包括成熟胚、幼胚、胚珠、子房培养以及试管受精等。 2、器官培养(organ culture)包括根尖、茎尖、子叶、叶原基、花原基、未成熟的花器 官各部分以及未成熟的果实培养。 3、组织或愈伤组织培养(tissue or callus culture) 此处的组织培养为狭义的，即植物各 部分的组织，如维管形成层、贮藏薄壁组织、根的中柱鞘、叶肉、胚乳以及维管束原等组织 的一小片段，接种培养。 4、细胞培养(cell culture)利用能保持良好分散性的离体细胞或很小的细胞团进行液体 培养或悬浮培养(suspension culture)。 5、原生质体培养(protoplast culture)即对利用酶解法除去细胞壁后的活原生质体进行 培养。 按照所用培养基固化与否，组织培养又可以分为液体培养和固体培养两种方法。液体培 养又分为静置培养和振荡培养。外植体在固体培养基上的培养叫固体培养。固体培养基即在 液体培养基中加入0.51.2%的琼脂使液体培养基固化，一般pH调至5.4~5.8。固体培养的缺 点是外植体只有一部分接触培养基，不能全部浸没在培养基中，结果培养物上、下部因接受 养分不均匀而形成差异，不易使细胞群均一：液体培养的缺点主要是通气不良，应将盛有培 养物和液体培养基的器皿置于转床或摇床上进行振荡培养，以使培养材料在培养基中均匀地 接触到培养基，又保持良好的通气状况。 (二)植物离体培养的基本原理 1.植物细胞全能性及其表达 植物离体培养的理论基础是细胞的全能性(totipotence)学说。植物细胞全能性是指植物 的每个细跑都具有该物种的全部遗传信息，离体细胞在一定的培养条件下具有发育成完整植 株的潜在能力。自然情况下，雌雄配子经过受精作用结合成合子，再完成自然的脱分化过程， 成为具有全能性的分生细胞，合子经过一系列的有丝分裂分化形成具有一定形态、结构与机 能的植株。由于在个体发育过程中，细胞受到严格的发育周期调控，在特定的器官表现出 定的形态、行使一定的功能，但其遗传全能性并没有丧失，因此，一旦脱离原来的组织或器 官成为离体状态，在一定的培养条件下，就可以经脱分化而恢复其全能性，由单细胞或小细 胞团发育成愈伤组织或胚状体，进一步分化形成再生植株。 实现全能性，必须经历两个重要过程：(1)脱分化将植物体分化组织中已停止分化的 细胞在离体条件下，使其从分化状态转变为分生状态，恢复细胞的分裂活性。愈伤组织实际 上就是一种典型的脱分化组织。(2)再分化脱分化的细胞或组织在一定的培养条件下，产 生各种不同类型的分化细胞，这一过程称为再分化。在脱分化和再生过程个，细胞的全能性 得以表达。当然，不同植物、不同的组织器官、不同细胞间全能性表达的程度会有所不同， 这主要取决于细胞所处的发育状态和生理状态
2 植物离体培养（in vitro culture）即广义的组织培养，是现代生物技术的一个重要组成部 分，它是指运用无菌操作技术，将从植物体分离的符合需要的组织、器官或细胞（包括去壁 后的原生质体）等，接种在人工培养基上，置于人工控制的环境条件下进行培养，以获得再 生的完整植株或生产具有经济价值的其它生物产品的技术。在植物离体培养中，用于接种的 材料叫作外植体（explant）。按照外植体的不同，植物离体培养可以分为： 1、胚胎培养（embryo culture）包括成熟胚、幼胚、胚珠、子房培养以及试管受精等。 2、器官培养（organ culture）包括根尖、茎尖、子叶、叶原基、花原基、未成熟的花器 官各部分以及未成熟的果实培养。 3、组织或愈伤组织培养（tissue or callus culture） 此处的组织培养为狭义的，即植物各 部分的组织，如维管形成层、贮藏薄壁组织、根的中柱鞘、叶肉、胚乳以及维管束原等组织 的一小片段，接种培养。 4、细胞培养（cell culture）利用能保持良好分散性的离体细胞或很小的细胞团进行液体 培养或悬浮培养（suspension culture）。 5、原生质体培养（protoplast culture）即对利用酶解法除去细胞壁后的活原生质体进行 培养。 按照所用培养基固化与否，组织培养又可以分为液体培养和固体培养两种方法。液体培 养又分为静置培养和振荡培养。外植体在固体培养基上的培养叫固体培养。固体培养基即在 液体培养基中加入 0.5~1.2％的琼脂使液体培养基固化，一般 pH 调至 5.4~5.8。固体培养的缺 点是外植体只有一部分接触培养基，不能全部浸没在培养基中，结果培养物上、下部因接受 养分不均匀而形成差异，不易使细胞群均一；液体培养的缺点主要是通气不良，应将盛有培 养物和液体培养基的器皿置于转床或摇床上进行振荡培养，以使培养材料在培养基中均匀地 接触到培养基，又保持良好的通气状况。 （二）植物离体培养的基本原理 1．植物细胞全能性及其表达 植物离体培养的理论基础是细胞的全能性（totipotence）学说。植物细胞全能性是指植物 的每个细跑都具有该物种的全部遗传信息，离体细胞在一定的培养条件下具有发育成完整植 株的潜在能力。自然情况下，雌雄配子经过受精作用结合成合子，再完成自然的脱分化过程， 成为具有全能性的分生细胞，合子经过一系列的有丝分裂分化形成具有一定形态、结构与机 能的植株。由于在个体发育过程中，细胞受到严格的发育周期调控，在特定的器官表现出一 定的形态、行使一定的功能，但其遗传全能性并没有丧失，因此，一旦脱离原来的组织或器 官成为离体状态，在一定的培养条件下，就可以经脱分化而恢复其全能性，由单细胞或小细 胞团发育成愈伤组织或胚状体，进一步分化形成再生植株。 实现全能性，必须经历两个重要过程：（1）脱分化 将植物体分化组织中已停止分化的 细胞在离体条件下，使其从分化状态转变为分生状态，恢复细胞的分裂活性。愈伤组织实际 上就是一种典型的脱分化组织。（2）再分化 脱分化的细胞或组织在一定的培养条件下，产 生各种不同类型的分化细胞，这一过程称为再分化。在脱分化和再生过程个，细胞的全能性 得以表达。当然，不同植物、不同的组织器官、不同细胞间全能性表达的程度会有所不同， 这主要取决于细胞所处的发育状态和生理状态
2.愈伤组织的诱导、增殖和形态建成 在绝大多数情况下植物细胞全能性的表达都要经过一个从分化状态到脱分化的愈伤组织 (或悬浮细胞)的中间阶段，然后进行再分化，当然有时再分化可以直接发生在分化的细胞 当中，而不经历愈伤组织这一中间形式。 1)愈伤组织的诱导 愈伤组织(callus)是指植物细胞经过脱分化不断增殖形成的不定型薄壁细胞组织。在离 体培养条件下，从外植体到形成愈伤组织的过程可以分为三个时期： (1)诱导期 外植体细胞在特定的诱导条件下，改变了原来的发育途径，失去原有的生理功能和形态， 合成代谢旺盛，迅速进行蛋白质和核酸的合成，为细胞分裂淮备条件。诱导期的长短因植物 种类和外植体的生理状态以及外部因素而异，如刚收获的菊芋诱导期只要1天，而贮藏5个 月后，诱导期则要2天，胡萝卜需要好几天。 (2)分裂期 外植体外层细胞开始细胞分裂，由于细胞的迅速分裂使细胞体积变小逐渐回复到分生组 织状态。这一时期的特点是细胞分裂快，细胞体积小，细胞核大，细胞质稠密，液泡小而少， 随着培养组织的不断生长和细胞分裂，逐渐形成肉眼可见的呈球状颗粒的愈伤组织。外植体 脱分化的难易程度因外植体种类、器官及生理状态而有很大的差异。茎、叶等营养器官较难 脱分化，幼嫩组织较成熟的组织易脱分化。 (3)形成期 随着愈伤组织的进一步发育，外层细胞的分裂速度逐渐减慢，细胞分裂从愈伤组织的周 缘细胞转向内部细胞。形成期的愈伤组织外表呈现出瘤状结构，同时内部发生分化，产生呈 分散的节状和短束结构的维管组织，但不形成维管系统。 愈伤组织虽然从形态变化上可人为的划分为三个时期，但实际上各个时期的界限并不严 格，处于不同时期（尤其是分裂期和形成期）的细胞往往共存于同一块愈伤组织中。 2)愈伤组织的继代 新鲜的愈伤组织一般生长旺盛，有光泽，呈奶黄色或白色，也有显淡绿色的，经过一段 时间的生长后，由于培养基中水分、养分的耗失以及代谢产物积累的毒害作用，愈伤组织块 生长速度变慢、趋于老化，变为黄褐色。因此，愈伤组织经诱导形成后，大多需要进行继代 培养以保持愈伤组织旺盛的生长状态，同时增殖形成大量愈伤组织块。继代培养(subculture) 即将原来的愈伤组织分割为小块转移到新鲜培养基上。通常，用于继代的愈伤组织必须达到 一定的大小（直径5~10mm,重量约100mg),否则难以迅速恢复分裂和生长。在正常情况下， 继代后的愈伤组织在3~7天内即可恢复生长，在随后的2~3周处于旺盛生长时期。进行再次 继代培养的合适时期就是愈伤组织生长即将达到顶峰之前，这时继代较容易进入分裂生长。 3)愈伤组织的形态建成 所谓形态建成是指无定形的愈伤组织再分化，形成根和芽，最后获得完整再生植株的过 程。愈伤组织细胞分裂以无规则方式发生，此时虽然也发生了细胞的分化，形成不同的细胞 类型，如薄壁细胞、分生组织细胞、导管和管胞、纤维细胞、石细胞及色素细胞等，但并不 无器官发生，只有在适当的培养条件下，愈伤组织才可发生再分化，形成完整植株。愈伤组 2
3 2．愈伤组织的诱导、增殖和形态建成 在绝大多数情况下植物细胞全能性的表达都要经过一个从分化状态到脱分化的愈伤组织 （或悬浮细胞）的中间阶段，然后进行再分化，当然有时再分化可以直接发生在分化的细胞 当中，而不经历愈伤组织这一中间形式。 1）愈伤组织的诱导 愈伤组织（callus）是指植物细胞经过脱分化不断增殖形成的不定型薄壁细胞组织。在离 体培养条件下，从外植体到形成愈伤组织的过程可以分为三个时期： （1）诱导期 外植体细胞在特定的诱导条件下，改变了原来的发育途径，失去原有的生理功能和形态， 合成代谢旺盛，迅速进行蛋白质和核酸的合成，为细胞分裂淮备条件。诱导期的长短因植物 种类和外植体的生理状态以及外部因素而异，如刚收获的菊芋诱导期只要 1 天，而贮藏 5 个 月后，诱导期则要 2 天，胡萝卜需要好几天。 （2）分裂期 外植体外层细胞开始细胞分裂，由于细胞的迅速分裂使细胞体积变小逐渐回复到分生组 织状态。这一时期的特点是细胞分裂快，细胞体积小，细胞核大，细胞质稠密，液泡小而少， 随着培养组织的不断生长和细胞分裂，逐渐形成肉眼可见的呈球状颗粒的愈伤组织。外植体 脱分化的难易程度因外植体种类、器官及生理状态而有很大的差异。茎、叶等营养器官较难 脱分化，幼嫩组织较成熟的组织易脱分化。 （3）形成期 随着愈伤组织的进一步发育，外层细胞的分裂速度逐渐减慢，细胞分裂从愈伤组织的周 缘细胞转向内部细胞。形成期的愈伤组织外表呈现出瘤状结构，同时内部发生分化，产生呈 分散的节状和短束结构的维管组织，但不形成维管系统。 愈伤组织虽然从形态变化上可人为的划分为三个时期，但实际上各个时期的界限并不严 格，处于不同时期（尤其是分裂期和形成期）的细胞往往共存于同一块愈伤组织中。 2）愈伤组织的继代 新鲜的愈伤组织一般生长旺盛，有光泽，呈奶黄色或白色，也有显淡绿色的，经过一段 时间的生长后，由于培养基中水分、养分的耗失以及代谢产物积累的毒害作用，愈伤组织块 生长速度变慢、趋于老化，变为黄褐色。因此，愈伤组织经诱导形成后，大多需要进行继代 培养以保持愈伤组织旺盛的生长状态，同时增殖形成大量愈伤组织块。继代培养（subculture） 即将原来的愈伤组织分割为小块转移到新鲜培养基上。通常，用于继代的愈伤组织必须达到 一定的大小（直径 5~10mm，重量约 100mg），否则难以迅速恢复分裂和生长。在正常情况下， 继代后的愈伤组织在 3~7 天内即可恢复生长，在随后的 2~3 周处于旺盛生长时期。进行再次 继代培养的合适时期就是愈伤组织生长即将达到顶峰之前，这时继代较容易进入分裂生长。 3）愈伤组织的形态建成 所谓形态建成是指无定形的愈伤组织再分化，形成根和芽，最后获得完整再生植株的过 程。愈伤组织细胞分裂以无规则方式发生，此时虽然也发生了细胞的分化，形成不同的细胞 类型，如薄壁细胞、分生组织细胞、导管和管胞、纤维细胞、石细胞及色素细胞等，但并不 无器官发生，只有在适当的培养条件下，愈伤组织才可发生再分化，形成完整植株。愈伤组
织的再分化有两种发育途径：器官发生和体细胞胚胎发生途径。 (1)器官发生(organogenesis) 器官发生是指离体培养的组织、细胞在诱导条件下分裂和增殖再分化，形成根和芽的过 程。器官发生包括由茎尖、腋芽、原球茎、块茎、鳞茎等外植体直接分化成器官的直接发生， 以及外植体先脱分化形成愈伤组织后再分化形成器官的间接发生。器官发生是单极性的，器 官（根或芽）里面长出原形成层束，与原先存在于愈伤组织或外植体中的维管组织连接在一 起，成为器官发育的营养运输通道。愈伤组织的器官发生的顺序有4种类型：先形成芽，芽 伸长后在其基部长出根，再生成小植株，多数植物属这种类型：先形成根，再从根的基部分 化出芽形成小植株，在双子叶植物中较普遍：在愈伤组织的不同部位分别形成芽和根，二者 结合起来再生植株，但此时根和芽的维管束一定要相连，再生植株才能成活：仅有根或芽器 官的分别再生，形成无芽的根或无根的苗。 (2)体细胞胚发生(somatic embryogenesis) 体细胞胚发生是指体细胞在未经性细胞融合（受精）的情况下，类似有性合子胚胎发生 的各个阶段而发育成新个体的形态发生过程。由愈伤组织的类薄壁细胞不经过有性过程而直 接产生类似胚的结构，称之为胚状体(embyoid)。胚状体的最根本特征是具有双极性，即在 发育早期阶段从方向相反的两端分化出茎端和根端，胚根的顶端是封闭的，与母体愈伤组织 或外植体无维管束相连，其维管组织的分布是独立的“Y”字形。 胚状体的诱导和形成可以分为直接产生和间接产生两种方式。直接产生是指外植体中原 先就存在的胚性细胞在进入培养之后直接进入体细胞胚胎发生而形成胚状体，在培养前就存 在的胚性细胞被称为前决定的胚性细胞，如某些植物外植体（下胚轴、子叶或幼花序等）的 表皮细胞中的胚性细胞可以直接产生胚状体：间接发生是通过外植体中己分化细胞的发育方 向的重决定过程诱导出胚性细胞，然后由这些诱导的胚性细胞发育成胚状体。这两种形成方 式的最主要的区别在于后者要经历愈伤组织培养的中间阶段。 (三)影响离体培养的因素 外植体选择、培养基和培养条件是影响离体培养成功的三大重要因素。 1)外植体 理论上，任何外植体在合适的条件下均可脱分化形成愈伤组织，但在实践中外植体的再 生与供体的植物种类、基因型以及外植体本身的生理生化状态密切相关。一般来说带薄壁细 胞及分生细胞的组织较易诱导出愈伤组织。通常外植体幼嫩的、愈伤组织继代次数少，愈伤 组织的再生能力较强。 2)培养基 培养基(medium)为外植体生长提供营养物质。通常分为完全培养基与基本培养基两类。 基本培养基含有大量元素、微量元素、维生素、氨基酸、糖、水等，常见的种类有MS、White、 Nitsh、N6、B5等：完全培养基是在基本培养基上加一些生长调节物质，如BA、2,4-D、IAA、 ZT等，以及一些天然提取物，如椰乳、酵母提取物等。在试验前具体选择培养基时则要考虑 外植体本身的生理状态和试验目的，最佳配方往往要通过试验对比以及试验者的经验来确定。 植物生长调节物质在培养中起着重要的调控作用。诱导和保持愈伤组织生长所需的植物 生长调节物质、种类、激素配比与供体植物的种类、基因型等密切相关。植物生长调节物质
4 织的再分化有两种发育途径：器官发生和体细胞胚胎发生途径。 （1）器官发生（organogenesis） 器官发生是指离体培养的组织、细胞在诱导条件下分裂和增殖再分化，形成根和芽的过 程。器官发生包括由茎尖、腋芽、原球茎、块茎、鳞茎等外植体直接分化成器官的直接发生， 以及外植体先脱分化形成愈伤组织后再分化形成器官的间接发生。器官发生是单极性的，器 官（根或芽）里面长出原形成层束，与原先存在于愈伤组织或外植体中的维管组织连接在一 起，成为器官发育的营养运输通道。愈伤组织的器官发生的顺序有 4 种类型：先形成芽，芽 伸长后在其基部长出根，再生成小植株，多数植物属这种类型；先形成根，再从根的基部分 化出芽形成小植株，在双子叶植物中较普遍；在愈伤组织的不同部位分别形成芽和根，二者 结合起来再生植株，但此时根和芽的维管束一定要相连，再生植株才能成活；仅有根或芽器 官的分别再生，形成无芽的根或无根的苗。 （2）体细胞胚发生（somatic embryogenesis） 体细胞胚发生是指体细胞在未经性细胞融合（受精）的情况下，类似有性合子胚胎发生 的各个阶段而发育成新个体的形态发生过程。由愈伤组织的类薄壁细胞不经过有性过程而直 接产生类似胚的结构，称之为胚状体（embyoid）。胚状体的最根本特征是具有双极性，即在 发育早期阶段从方向相反的两端分化出茎端和根端，胚根的顶端是封闭的，与母体愈伤组织 或外植体无维管束相连，其维管组织的分布是独立的“Y”字形。 胚状体的诱导和形成可以分为直接产生和间接产生两种方式。直接产生是指外植体中原 先就存在的胚性细胞在进入培养之后直接进入体细胞胚胎发生而形成胚状体，在培养前就存 在的胚性细胞被称为前决定的胚性细胞，如某些植物外植体（下胚轴、子叶或幼花序等）的 表皮细胞中的胚性细胞可以直接产生胚状体；间接发生是通过外植体中已分化细胞的发育方 向的重决定过程诱导出胚性细胞，然后由这些诱导的胚性细胞发育成胚状体。这两种形成方 式的最主要的区别在于后者要经历愈伤组织培养的中间阶段。 （三）影响离体培养的因素 外植体选择、培养基和培养条件是影响离体培养成功的三大重要因素。 1）外植体 理论上，任何外植体在合适的条件下均可脱分化形成愈伤组织，但在实践中外植体的再 生与供体的植物种类、基因型以及外植体本身的生理生化状态密切相关。一般来说带薄壁细 胞及分生细胞的组织较易诱导出愈伤组织。通常外植体幼嫩的、愈伤组织继代次数少，愈伤 组织的再生能力较强。 2）培养基 培养基（medium）为外植体生长提供营养物质。通常分为完全培养基与基本培养基两类。 基本培养基含有大量元素、微量元素、维生素、氨基酸、糖、水等，常见的种类有 MS、White、 Nitsh、N6、B5 等；完全培养基是在基本培养基上加一些生长调节物质，如 BA、2,4-D、IAA、 ZT 等，以及一些天然提取物，如椰乳、酵母提取物等。在试验前具体选择培养基时则要考虑 外植体本身的生理状态和试验目的，最佳配方往往要通过试验对比以及试验者的经验来确定。 植物生长调节物质在培养中起着重要的调控作用。诱导和保持愈伤组织生长所需的植物 生长调节物质、种类、激素配比与供体植物的种类、基因型等密切相关。植物生长调节物质
对愈伤组织的形态建成起着重要作用。大多数植物，特别是双子叶植物的组织或器官再生符 合经典器官分化模式，即在一定浓度范围内，当生长素细胞分裂素的比例高时易形成根，反 之促进芽的分化，两种激素比例适中时则可促进愈伤组织的生长。对胚状体分化的研究发现， 2,4-D可有效诱导外植体形成愈伤组织并促进愈伤组织内分化出胚性细胞团，但如果愈伤组 织持续地培养在含有高浓度的2,4-D的培养基个，胚性细胞团的进一步发育就会受到抑制， 不能形成正常的胚状体。因此，为了促进愈伤组织的分化，要继代培养时，应降低或去掉2,4-D。 另外，培养基的渗透压是影响愈伤组织形成和分化的一个重要因素，通常以糖类、无机 盐、甘露醇或较高分子量PEG等来维持培养基的渗透压。一般来说，高的渗透压对愈伤组织 的增殖不利。在培养基中加入一些惰性物质，如活性炭等，对愈伤组织的分化有时起促进作 用，有利于愈伤组织的器官发生和体细胞胚胎的发生。 3)培养条件 (1)温度用于愈伤组织诱导及其增殖的温度一般在25±2℃，但其最适温度却有差异， 例如甜菜叶片外植体在31℃培养比25℃时产生的愈伤组织要多，但其形态建成以25℃为最 适，热带园艺植物可控制在30℃左右，形成的体细胞胚和芽较多。低温处理有时可促进分化， 如天竺葵植株10C℃处理可明显提高茎尖培养的诱导率与增殖率。形成愈伤组织的最适温度 还因光照的有无而变化，例如在暗培养条件下，胡萝卜愈伤组织培养的最适温度是26℃，但 在光培养条件下是33℃。一般适合愈伤组织分化的温度为2428℃，温度高低对器官发生的 数量和质量有影响，但不同物种之间最适温度有些差异。 (2)光照光照对愈伤组织的生长有促进作用，有时也有抑制作用。光的作用反映在光 照时间、照光方式、光照强度和光质上，光的作用还受其它培养条件的影响，如培养温度、 培养基中生长调节剂的种类和浓度等。在愈伤组织形态建成阶段，各种植物组织培养的器官 分化对光的要求也各不同，如荷兰芹的器官发生不需要光，天竺葵的愈伤组织以15~16h光 照时产生芽最多，百合原球茎在黑暗条件下长出小球茎，在光照条件下长出叶片。一般植物 组织培养控制在1000-5000Lx的条件下培养。 (四）离体培养技术在园艺作物育种上的应用 1、进行种质创新 1)克服远缘杂交障碍获得远缘杂种 种质资源的利用范围，将一些作物野生种的有用基因转移到栽培作物上来，或把其他属、 种上的有用基因或性状转移到另一个属、种的作物上来，远缘杂交己是植物育种的一项重要 技术。远缘杂种的获得有许多困难，如杂交不亲和性(cross-imcompatibility)、杂种不育性 (hybrid invability)、杂种不稔性(hybrid infertility)等。利用胚珠和子房培养，进行试管授 粉和受精，可以克服由于柱头或花柱等障碍所造成的杂交不亲和性。另外，许多远缘杂交的 失败，往往是由于幼胚的早期败育所致。如在无菌条件下进行幼胚剥离和胚拯救(embyo resure),使其继续发育，即可获得真正的远缘杂种。 2)获得体细胞杂种(somatic hybrid) 近年来，有许多通过原生质体融合来产生体细胞超远缘杂种的报道。体细胞杂交除了获 得通过有性杂交不能获得的属间或种间杂种外，还可作为转移胞质遗传性状（如雄性不育性） 以及非豆科作物转移固氮基因，或高光合效率的基因转移
5 对愈伤组织的形态建成起着重要作用。大多数植物，特别是双子叶植物的组织或器官再生符 合经典器官分化模式，即在一定浓度范围内，当生长素/细胞分裂素的比例高时易形成根，反 之促进芽的分化，两种激素比例适中时则可促进愈伤组织的生长。对胚状体分化的研究发现， 2,4-D 可有效诱导外植体形成愈伤组织并促进愈伤组织内分化出胚性细胞团，但如果愈伤组 织持续地培养在含有高浓度的 2,4-D 的培养基个，胚性细胞团的进一步发育就会受到抑制， 不能形成正常的胚状体。因此，为了促进愈伤组织的分化，要继代培养时，应降低或去掉 2,4-D。 另外，培养基的渗透压是影响愈伤组织形成和分化的一个重要因素，通常以糖类、无机 盐、甘露醇或较高分子量 PEG 等来维持培养基的渗透压。一般来说，高的渗透压对愈伤组织 的增殖不利。在培养基中加入一些惰性物质，如活性炭等，对愈伤组织的分化有时起促进作 用，有利于愈伤组织的器官发生和体细胞胚胎的发生。 3）培养条件 （1）温度 用于愈伤组织诱导及其增殖的温度一般在 25±2℃，但其最适温度却有差异， 例如甜菜叶片外植体在 31℃培养比 25℃时产生的愈伤组织要多，但其形态建成以 25℃为最 适，热带园艺植物可控制在 30℃左右，形成的体细胞胚和芽较多。低温处理有时可促进分化， 如天竺葵植株 10C℃处理可明显提高茎尖培养的诱导率与增殖率。形成愈伤组织的最适温度 还因光照的有无而变化，例如在暗培养条件下，胡萝卜愈伤组织培养的最适温度是 26℃，但 在光培养条件下是 33℃。一般适合愈伤组织分化的温度为 24~28℃，温度高低对器官发生的 数量和质量有影响，但不同物种之间最适温度有些差异。 （2）光照 光照对愈伤组织的生长有促进作用，有时也有抑制作用。光的作用反映在光 照时间、照光方式、光照强度和光质上，光的作用还受其它培养条件的影响，如培养温度、 培养基中生长调节剂的种类和浓度等。在愈伤组织形态建成阶段，各种植物组织培养的器官 分化对光的要求也各不同，如荷兰芹的器官发生不需要光，天竺葵的愈伤组织以 15~16h 光 照时产生芽最多，百合原球茎在黑暗条件下长出小球茎，在光照条件下长出叶片。一般植物 组织培养控制在 1000~5000 Lx 的条件下培养。 （四）离体培养技术在园艺作物育种上的应用 1、进行种质创新 1）克服远缘杂交障碍获得远缘杂种 种质资源的利用范围，将一些作物野生种的有用基因转移到栽培作物上来，或把其他属、 种上的有用基因或性状转移到另一个属、种的作物上来，远缘杂交已是植物育种的一项重要 技术。远缘杂种的获得有许多困难，如杂交不亲和性（cross-imcompatibility）、杂种不育性 （hybrid invability）、杂种不稔性（hybrid infertility）等。利用胚珠和子房培养，进行试管授 粉和受精，可以克服由于柱头或花柱等障碍所造成的杂交不亲和性。另外，许多远缘杂交的 失败，往往是由于幼胚的早期败育所致。如在无菌条件下进行幼胚剥离和胚拯救（embyo resure），使其继续发育，即可获得真正的远缘杂种。 2）获得体细胞杂种（somatic hybrid） 近年来，有许多通过原生质体融合来产生体细胞超远缘杂种的报道。体细胞杂交除了获 得通过有性杂交不能获得的属间或种间杂种外，还可作为转移胞质遗传性状（如雄性不育性） 以及非豆科作物转移固氮基因，或高光合效率的基因转移
3)突变诱发与体细胞无性系筛选 在突变育种中，常常由于产生的突变缺乏专化性而降低其效率，需要在大量的植株中筛 选有利变异，如果在细胞培养过程中，特别是利用单倍体细胞进行诱变，则隐性突变也不会 被其相应的显性基因所遮掩，在一个试管内便可进行大量的细胞筛选，由单个变异了的细胞 再生成完整植株也就不会产生嵌合体。 近年来，体细胞无性系变异(somaclonal variation)己成为选择有用变异的一个新的重要 来源。为了筛选出特殊的突变类型，可以把某种选择因素结合到培养基或环境个进行筛选。 通过这一途径，业已分离出广谱的变异细胞系，如抗药物、抗除草剂、抗病、抗不良环境条 件细胞系，从而成功进行离体选择。 4)遗传转化受体系统 进行高效遗传转化的前提是建立良好的离体再生系统。以原生质体或愈伤组织作为受体 进行遗传转化，培养出转基因植株，在作物改良上具有巨大的潜力，可以提高作物产量，改 良品质，增强作物抗性以及对环境胁迫的耐性。 2、促进倍性育种 利用花药及花粉培养进行单倍体育种，将优良的单倍体进行染色体加倍，便可迅速地获 得纯合的二倍体，从而加速亲本材料的纯化。三倍体植物也可通过胚乳培养再生植株的途径 获得。 3、优良亲本的快繁与资源保存 1)快速繁殖对于优良单株、自交不亲和系、雄性不育系以及常规无性繁殖困难的作物 均可通过组织培养快速形成无性繁殖系。我国已成功建立多种作物的试管苗繁殖技术，其个 主要园艺作物有草莓、石刁柏、马铃薯、大蒜、花椰菜、黄花菜、甘蓝、油菜、黄瓜、胡萝 卜、不结球白菜、大白菜、樱桃等。这种繁殖的特点是不受季节和气候的限制，周年均可进 行，繁殖系数可远远超过常规的有性或无性繁殖。 2)获得脱毒苗对于无性繁殖作物感染病毒引起退化的品种可以通过分生组织培养或再 结合其它处理，有效地进行脱毒，从而获得了脱毒苗。这在马铃薯、大蒜、草莓、甘薯等蔬 菜作物上均有成功的报道。为了防止脱毒种苗（薯）二次感染，建立了种苗圃、二级种苗圃、 生产圃的工厂化生产模式。 3)种质资源试管保存利用茎尖培养结合低温或超低温冷冻贮藏来保存种质资源，特别 是对一些无性繁殖作物的种质资源保存更有价值。它不仅节约空间，又可减少病虫为害，也 便于运输利种质资源的交换。 二、组织和器官培养 组织和器官培养是植物离体培养中研究最早而且应用较广泛。 (一)组织培养基本过程 组织培养的全过程可划分为四个阶段。 第一阶段：无菌培养体系的建立。其目的是建立供试植物的无菌培养。选取适当外植体 与合适的培养基，培养的结果是获得增大了的新梢，生了根的新梢尖或愈伤组织等。只要培 养无明显的污染，接种的外植体中有适当比率的存活并继续较快地生长，就算达到了目的。 6
6 3）突变诱发与体细胞无性系筛选 在突变育种中，常常由于产生的突变缺乏专化性而降低其效率，需要在大量的植株中筛 选有利变异，如果在细胞培养过程中，特别是利用单倍体细胞进行诱变，则隐性突变也不会 被其相应的显性基因所遮掩，在一个试管内便可进行大量的细胞筛选，由单个变异了的细胞 再生成完整植株也就不会产生嵌合体。 近年来，体细胞无性系变异（somaclonal variation）已成为选择有用变异的一个新的重要 来源。为了筛选出特殊的突变类型，可以把某种选择因素结合到培养基或环境个进行筛选。 通过这一途径，业已分离出广谱的变异细胞系，如抗药物、抗除草剂、抗病、抗不良环境条 件细胞系，从而成功进行离体选择。 4）遗传转化受体系统 进行高效遗传转化的前提是建立良好的离体再生系统。以原生质体或愈伤组织作为受体 进行遗传转化，培养出转基因植株，在作物改良上具有巨大的潜力，可以提高作物产量，改 良品质，增强作物抗性以及对环境胁迫的耐性。 2、促进倍性育种 利用花药及花粉培养进行单倍体育种，将优良的单倍体进行染色体加倍，便可迅速地获 得纯合的二倍体，从而加速亲本材料的纯化。三倍体植物也可通过胚乳培养再生植株的途径 获得。 3、优良亲本的快繁与资源保存 1）快速繁殖 对于优良单株、自交不亲和系、雄性不育系以及常规无性繁殖困难的作物 均可通过组织培养快速形成无性繁殖系。我国已成功建立多种作物的试管苗繁殖技术，其个 主要园艺作物有草莓、石刁柏、马铃薯、大蒜、花椰菜、黄花菜、甘蓝、油菜、黄瓜、胡萝 卜、不结球白菜、大白菜、樱桃等。这种繁殖的特点是不受季节和气候的限制，周年均可进 行，繁殖系数可远远超过常规的有性或无性繁殖。 2）获得脱毒苗 对于无性繁殖作物感染病毒引起退化的品种可以通过分生组织培养或再 结合其它处理，有效地进行脱毒，从而获得了脱毒苗。这在马铃薯、大蒜、草莓、甘薯等蔬 菜作物上均有成功的报道。为了防止脱毒种苗（薯）二次感染，建立了种苗圃、二级种苗圃、 生产圃的工厂化生产模式。 3）种质资源试管保存 利用茎尖培养结合低温或超低温冷冻贮藏来保存种质资源，特别 是对一些无性繁殖作物的种质资源保存更有价值。它不仅节约空间，又可减少病虫为害，也 便于运输利种质资源的交换。 二、组织和器官培养 组织和器官培养是植物离体培养中研究最早而且应用较广泛。 （一）组织培养基本过程 组织培养的全过程可划分为四个阶段。 第一阶段：无菌培养体系的建立。其目的是建立供试植物的无菌培养。选取适当外植体 与合适的培养基，培养的结果是获得增大了的新梢，生了根的新梢尖或愈伤组织等。只要培 养无明显的污染，接种的外植体中有适当比率的存活并继续较快地生长，就算达到了目的
第二阶段：营养繁殖体(propagule)的增殖。本阶段主要通过诱导腋芽和顶芽的发生、 或诱导产生不定新梢或诱导体细胞胚胎发生来产生最大量的繁殖体单位。 第三阶段：生根。将第二阶段获得的繁殖体接种在生根培养基上促使其生根。可通过在 培养基中增加一些促进生根的激素类物质，或将新梢接种在基本培养基上或者扦插在人工介 质自然生根，同时进行驯化。 第四阶段：植株定植入土。本阶段主要是保证最大的存活率，以便再生植株投入利用。 在定植入土的开始阶段，必须尽量注意保湿以提高成活率。 (二)茎尖及分生组织培养 茎尖培养(shoot tip culture)与分生组织培养(meristem culture)都需要无菌操作，切取 带有生长点的茎尖进行培养。两种类型的差别，主要在于接种外植体的大小，分生组织培养 的外植体一般仅限于分生组织或带有1~2个叶原基的分生组织，常小于0.5mm,而茎尖培养 的外植体则往往在0.5~5mm,还有切取1~3cm长的茎尖进行培养的。外植体愈大愈易切取， 存活率也更高一些，但太大难以进行脱毒。 茎尖培养和分生组织培养是两种重要的组织培养技术，广泛应用于一些具有较高经济价 值、且繁殖较为困难的园艺植物的快速无性繁殖，如兰花(Cymbium)的快速繁殖，据估计， 利用组培技术，从一个外植体一年便可繁殖出400万株兰花：石刁柏(Asparagus)是成功地 进行组培的另一个实例，从一个茎尖无性培养，一年内可以获得30万株能移栽的植株，比传 统的繁殖方式大大提高了繁殖系数。优良自交不亲和系、雄性不育系也可进行快速无性繁殖， 其它无性繁殖作物如马铃薯、芋、大蒜的脱毒苗己在生产上广泛应用。 另外可以利用茎尖培养进行保存种质资源，特别是对那些不能产生种子的无性繁殖作物 种质资源进行保存，占用空间极少，而且便于运输和交换。 (三)胚胎培养和试管授精 1、胚胎培养 胚胎培养技术相对比较简单，在无菌条件下进行胚的剥离，再将其转移到适当的培养基 上进行培养。对于幼胚的剥离，有时需要在解剖显微镜下进行。一般地，非常幼嫩的胚对于 生长和操作是相当困难的。胚胎培养是克服远缘杂交杂种不育性的有效方法，当然剥胚时应 尽量使幼胚越大越好。胚胎培养亦可用以克服种子的休眠和那些天然种子不育而传统地进行 无性繁殖的作物，例如芋(Colocasia antiquorum)和野芋等，通过胚培有可能使其产生有性 苗。 2、试管受精 在远缘杂交和自交不亲和性植物自交中，常因遗传上的不亲和或花粉柱头不协调，造成 不能自然授粉、受精，克服这种障碍的办法之一，便是进行试管内授粉受精。试管内授粉受 精还可以诱导孤雌生殖，是获得单倍体的途径之一。 试管受精的第一种方法是培养未授粉的雌蕾群(gynoecia)(即指整个雌性生殖系统，包 括柱头、花柱和子房)于试管中，然后把花粉授在柱头上：另一方法是培养整个雌蕾群于琼 脂培养基上，用解剖刀使胎座及胚珠裸露，然后直接将花粉授在上面，此法又称为子房内授 粉(introvarian pollination)或胎座授粉(placental pollination)。还有一种方法是先进行胚珠 培养(ovule culture),然后直接授粉于胚珠上，继续进行培养直至种子成熟
7 第二阶段：营养繁殖体（propagule）的增殖。本阶段主要通过诱导腋芽和顶芽的发生、 或诱导产生不定新梢或诱导体细胞胚胎发生来产生最大量的繁殖体单位。 第三阶段：生根。将第二阶段获得的繁殖体接种在生根培养基上促使其生根。可通过在 培养基中增加一些促进生根的激素类物质，或将新梢接种在基本培养基上或者扦插在人工介 质自然生根，同时进行驯化。 第四阶段：植株定植入土。本阶段主要是保证最大的存活率，以便再生植株投入利用。 在定植入土的开始阶段，必须尽量注意保湿以提高成活率。 （二）茎尖及分生组织培养 茎尖培养（shoot tip culture）与分生组织培养（meristem culture）都需要无菌操作，切取 带有生长点的茎尖进行培养。两种类型的差别，主要在于接种外植体的大小，分生组织培养 的外植体一般仅限于分生组织或带有 1~2 个叶原基的分生组织，常小于 0.5mm，而茎尖培养 的外植体则往往在 0.5~5mm，还有切取 1~3cm 长的茎尖进行培养的。外植体愈大愈易切取， 存活率也更高一些，但太大难以进行脱毒。 茎尖培养和分生组织培养是两种重要的组织培养技术，广泛应用于一些具有较高经济价 值、且繁殖较为困难的园艺植物的快速无性繁殖，如兰花（Cymbium）的快速繁殖，据估计， 利用组培技术，从一个外植体一年便可繁殖出 400 万株兰花；石刁柏（Asparagus）是成功地 进行组培的另一个实例，从一个茎尖无性培养，一年内可以获得 30 万株能移栽的植株，比传 统的繁殖方式大大提高了繁殖系数。优良自交不亲和系、雄性不育系也可进行快速无性繁殖， 其它无性繁殖作物如马铃薯、芋、大蒜的脱毒苗已在生产上广泛应用。 另外可以利用茎尖培养进行保存种质资源，特别是对那些不能产生种子的无性繁殖作物 种质资源进行保存，占用空间极少，而且便于运输和交换。 （三）胚胎培养和试管授精 1、胚胎培养 胚胎培养技术相对比较简单，在无菌条件下进行胚的剥离，再将其转移到适当的培养基 上进行培养。对于幼胚的剥离，有时需要在解剖显微镜下进行。一般地，非常幼嫩的胚对于 生长和操作是相当困难的。胚胎培养是克服远缘杂交杂种不育性的有效方法，当然剥胚时应 尽量使幼胚越大越好。胚胎培养亦可用以克服种子的休眠和那些天然种子不育而传统地进行 无性繁殖的作物，例如芋（Colocasia antiquorum）和野芋等，通过胚培有可能使其产生有性 苗。 2、试管受精 在远缘杂交和自交不亲和性植物自交中，常因遗传上的不亲和或花粉-柱头不协调，造成 不能自然授粉、受精，克服这种障碍的办法之一，便是进行试管内授粉受精。试管内授粉受 精还可以诱导孤雌生殖，是获得单倍体的途径之一。 试管受精的第一种方法是培养未授粉的雌蕾群（gynoecia）（即指整个雌性生殖系统，包 括柱头、花柱和子房）于试管中，然后把花粉授在柱头上；另一方法是培养整个雌蕾群于琼 脂培养基上，用解剖刀使胎座及胚珠裸露，然后直接将花粉授在上面，此法又称为子房内授 粉（introvarian pollination）或胎座授粉（placental pollination）。还有一种方法是先进行胚珠 培养（ovule culture），然后直接授粉于胚珠上，继续进行培养直至种子成熟
(四)花药和花粉培养与单倍体育种 具有配子染色体数目的植物叫做单倍体植物(haploid)。值得一提的是，对于正常的二倍 体植物而言，其单倍体就只含有一个染色体组。如果原始亲本是一个多倍体，那么由此而形 成的单倍体就不只含有一个染色体组，而是孢子体染色体数的一半。目前获得单倍体的途径 主要有花药与花粉培养。 单倍体在育种上的重要性主要表现在以下几个方面。首先，可以加速优良材料的纯合。 从单倍体的染色体加倍可以获得纯合的二倍体，可以省去多代自交，快速地获得自交系，从 而缩短育种周期，减少选择群体，提高选择效率：通过单倍体的染色体加倍，也可克服优良 杂种性状的进一步分离：对于自交不亲和的异花授粉植物以及雌雄异株植物（如芦笋）都能 很快达到完全的纯合。对于不育的远缘杂种，可通过加倍获得可育双二倍体植株。由于单倍 体不存在显隐性问题，因此可利用单倍体进行诱变育种，产生的隐性突变在第一代即可表现 出来，有利于突变性状的鉴定和选择。另外，通过加倍获得的双二倍体(Dihaploid,DH)也 是构建作物分子标记遗传连锁图谱的重要材料。 1、花药与花粉培养技术 1)花药培养花药离体培养的技术比较简单。将含有适宜发育时期小孢子（常单核）的 花蕾切下，表面消毒后再用无菌蒸溜水冲洗两次，除去萼片和花瓣，立即将花药接种到适合 的培养基上进行培养。注意在剥离花药时尽量不要损伤花药，不然接种后很容易从受伤部位 产生愈伤组织，而不是从小孢子产生愈伤组织。培养温度一般在25℃左右，在光照或黑暗条 件下均可进行培养，只有当形成幼小植株后光照才显得重要，以保证叶绿素的产生和植株正 常生长。花药一般经过20~30天培养后，即可发现花药开裂，长出愈伤组织或释放出胚状体 (embryoid)。将愈伤组织转移至分化培养基（再生培养基），便可进一步分化再生出植株来。 目前甜椒、茄子、大白菜、油菜、萝卜、马铃薯、番茄等作物均成功获得单倍体植株。 在花药培养中，特别是通过愈伤组织形成的植株不一定都是单倍体，常有倍性的变异， 要通过染色体或其它分子生物学鉴定。 2)花粉培养主要有机械分离培养法与散落花粉(shed pollen)培养法，前者通过机械 挤压花药分离出花粉，而后者是通过花药开裂而释放出大量花粉。花粉培养成功的关键是改 变小孢子的正常发育途径，最终使其形成完整植株：同时要配制适当的培养基，使预先处理 过的小孢子能在上面生长。 2、影响花药及花粉培养成功的因素 要高频率获得单倍体植株，主要有以下一些影响因素。首先是供体植株(donor plant) 的基因型。花粉形成单倍体植株（孢子体）的能力，显然受供体植株间基因型不同的影响， 因为产生花粉植株的频率随属、种、亚种和品种而有不同。如在芸墓属中，胚状体形成的难 易顺序分别是，油菜类(Brassican apus)最容易，白菜类(Brassica campestris)次之，甘蓝 类(Brassica oleracea)更难。在同种类中，又存在品种间的较大差异。王玉英等(1978)在 甜椒花药培养中发现供试的19个品种中，只有16个获得了胚状体，但多数品种的诱导频率 都不高，只有少数品种形成胚状体的频率高一些。其次是生理状态和栽培环境条件。从生长 健壮、比较幼龄的植株上选取花药要好一些。还有一个关键影响因素是小孢子发育阶段。多 数植物单核中期至晚期的花粉最容易形成花粉胚或花粉愈伤组织。几种蔬菜小孢子培养适宜
8 （四）花药和花粉培养与单倍体育种 具有配子染色体数目的植物叫做单倍体植物（haploid）。值得一提的是，对于正常的二倍 体植物而言，其单倍体就只含有一个染色体组。如果原始亲本是一个多倍体，那么由此而形 成的单倍体就不只含有一个染色体组，而是孢子体染色体数的一半。目前获得单倍体的途径 主要有花药与花粉培养。 单倍体在育种上的重要性主要表现在以下几个方面。首先，可以加速优良材料的纯合。 从单倍体的染色体加倍可以获得纯合的二倍体，可以省去多代自交，快速地获得自交系，从 而缩短育种周期，减少选择群体，提高选择效率；通过单倍体的染色体加倍，也可克服优良 杂种性状的进一步分离；对于自交不亲和的异花授粉植物以及雌雄异株植物（如芦笋）都能 很快达到完全的纯合。对于不育的远缘杂种，可通过加倍获得可育双二倍体植株。由于单倍 体不存在显隐性问题，因此可利用单倍体进行诱变育种，产生的隐性突变在第一代即可表现 出来，有利于突变性状的鉴定和选择。另外，通过加倍获得的双二倍体（Dihaploid, DH）也 是构建作物分子标记遗传连锁图谱的重要材料。 1、花药与花粉培养技术 1）花药培养 花药离体培养的技术比较简单。将含有适宜发育时期小孢子（常单核）的 花蕾切下，表面消毒后再用无菌蒸溜水冲洗两次，除去萼片和花瓣，立即将花药接种到适合 的培养基上进行培养。注意在剥离花药时尽量不要损伤花药，不然接种后很容易从受伤部位 产生愈伤组织，而不是从小孢子产生愈伤组织。培养温度一般在 25℃左右，在光照或黑暗条 件下均可进行培养，只有当形成幼小植株后光照才显得重要，以保证叶绿素的产生和植株正 常生长。花药一般经过 20~30 天培养后，即可发现花药开裂，长出愈伤组织或释放出胚状体 （embryoid）。将愈伤组织转移至分化培养基（再生培养基），便可进一步分化再生出植株来。 目前甜椒、茄子、大白菜、油菜、萝卜、马铃薯、番茄等作物均成功获得单倍体植株。 在花药培养中，特别是通过愈伤组织形成的植株不一定都是单倍体，常有倍性的变异， 要通过染色体或其它分子生物学鉴定。 2）花粉培养 主要有机械分离培养法与散落花粉（shed pollen）培养法，前者通过机械 挤压花药分离出花粉，而后者是通过花药开裂而释放出大量花粉。花粉培养成功的关键是改 变小孢子的正常发育途径，最终使其形成完整植株；同时要配制适当的培养基，使预先处理 过的小孢子能在上面生长。 2、影响花药及花粉培养成功的因素 要高频率获得单倍体植株，主要有以下一些影响因素。首先是供体植株（donor plant） 的基因型。花粉形成单倍体植株（孢子体）的能力，显然受供体植株间基因型不同的影响， 因为产生花粉植株的频率随属、种、亚种和品种而有不同。如在芸薹属中，胚状体形成的难 易顺序分别是，油菜类（Brassican apus）最容易，白菜类（Brassica campestris）次之，甘蓝 类（Brassica oleracea）更难。在同种类中，又存在品种间的较大差异。王玉英等（1978）在 甜椒花药培养中发现供试的 19 个品种中，只有 16 个获得了胚状体，但多数品种的诱导频率 都不高，只有少数品种形成胚状体的频率高一些。其次是生理状态和栽培环境条件。从生长 健壮、比较幼龄的植株上选取花药要好一些。还有一个关键影响因素是小孢子发育阶段。多 数植物单核中期至晚期的花粉最容易形成花粉胚或花粉愈伤组织。几种蔬菜小孢子培养适宜
的发育阶段和培养基及其附加成分见表9-1。 表9-1几种蔬菜小孢子培养适宜的发育阶段及培养条件 附加成分 植物 花粉时期 基本培养基 花粉直接成苗诱导花粉愈伤组织 愈伤组织分化出苗 辣椒 单核 MS大量， NAA0.21.0,2,4D2.0, NAA0.2-1.0, Nitsch微量及KT0.5~1.0 KT1.0 KT0.51.0 有机 茄子 单中 MS无机， NAA0.005 2,4-D0.25-0.5, NAA0.01-0.1, H有机 KT1.0 KT1.0 KT1.02.0 甘蓝 单核-成熟Nitsch VB10.25.VB60.25. NAA0.5.KT 1.0 VB31.25,Gy7.5 番茄 减数分裂DBMⅡ NAA2.0 NAA0.1, 中期1-单核 KT1.0 KT2.0 另外，花药、花粉培养前和培养初期的预处理也是影响成功的因素。离体花蕾冷处理是 增加花药内花粉发育成为胚状体的有效方法。在十字花科等作物的培养过程中，培养初期的 短期高温(30~40℃)处理能够显著促进花粉胚状体的形成。有时还涉及到培养基与培养条 件的影响，培养条件中最重要的是温度。培养室的温度一般保持在25℃左右，对于特殊的材 料所要求的温度也有例外。试验结果表明，曼陀罗、小麦和油菜等植物都要求较高的温度， 在30-32℃下花粉愈伤组织诱导率较在26~28℃下高。花药培养对光照的要求因作物而异。 但对于花粉培养，特别是培养的早期，黑暗条件或弱光可能更有利于花粉的启动。 3、单倍体植株染色体的加倍 通过花药或花粉培养获得单倍体植株是遗传育种工作的重要材料。单倍体是不育的，因 此在单倍体育种过程中，在确认获得单倍体后，应进行染色体加倍，形成纯合的二倍体可育 植株。 尽管在诱导单倍体花粉植株的过程中，会有很少的植株自然加倍，但这种加倍的频率很 低。因此，常用的方法是利用秋水仙碱处理，如用0.02~0.5%的秋水仙碱溶液处理所获得的 单倍体植株，一般来说木本植物所用浓度要大些，时间也相对较长为宜。此外，利用单倍体 花粉植株茎段和其它部分培养，使之产生愈伤组织，己知在愈伤组织培养中会出现较高的核 内有丝分裂，从而导致染色体数目的加倍，然后在分化培养基上进一步分化芽和根，也可获 得二倍体植株。当然，对于染色体的加倍，事先和事后都要进行细胞学检查。 三、原生质体培养与体细胞杂交 1、原生质体培养与体细胞杂交技术 由于原生质体比完整的细胞更容易摄取外来的遗传物质，可以作为高等植物的遗传转化 的受体系统，而且在一定的条件下可以诱导其融合形成体细胞杂种(somatic hybrid)植株， 因而深受人们关注。目前己从多种园艺作物成功获得原生质体再生植株。 体细胞杂交就是将不同种、属或科间的两个体细胞原生质体进行融合，与常规有性杂交
9 的发育阶段和培养基及其附加成分见表 9-1。 表 9-1 几种蔬菜小孢子培养适宜的发育阶段及培养条件 植物 花粉时期 基本培养基 附加成分 花粉直接成苗 诱导花粉愈伤组织 愈伤组织分化出苗 辣椒 单核 MS 大量， Nitsch 微量及 有机 NAA 0.2~1.0, KT 0.5~1.0 2,4~D 2.0, KT 1.0 NAA 0.2~1.0, KT 0.5~1.0 茄子 单中 MS 无机， H 有机 NAA 0.005, KT 1.0 2,4-D 0.25~0.5, KT 1.0 NAA 0.01~0.1, KT 1.0~2.0 甘蓝 单核-成熟 Nitsch —— VB1 0.25, VB6 0.25, VB3 1.25, Gly 7.5 NAA 0.5, KT 1.0 番茄 减数分裂 中期 I-单核 DBM II —— NAA 2.0 KT 1.0 NAA 0.1, KT 2.0 另外，花药、花粉培养前和培养初期的预处理也是影响成功的因素。离体花蕾冷处理是 增加花药内花粉发育成为胚状体的有效方法。在十字花科等作物的培养过程中，培养初期的 短期高温（30~40℃）处理能够显著促进花粉胚状体的形成。有时还涉及到培养基与培养条 件的影响，培养条件中最重要的是温度。培养室的温度一般保持在 25℃左右，对于特殊的材 料所要求的温度也有例外。试验结果表明，曼陀罗、小麦和油菜等植物都要求较高的温度， 在 30~32℃下花粉愈伤组织诱导率较在 26~28℃下高。花药培养对光照的要求因作物而异。 但对于花粉培养，特别是培养的早期，黑暗条件或弱光可能更有利于花粉的启动。 3、单倍体植株染色体的加倍 通过花药或花粉培养获得单倍体植株是遗传育种工作的重要材料。单倍体是不育的，因 此在单倍体育种过程中，在确认获得单倍体后，应进行染色体加倍，形成纯合的二倍体可育 植株。 尽管在诱导单倍体花粉植株的过程中，会有很少的植株自然加倍，但这种加倍的频率很 低。因此，常用的方法是利用秋水仙碱处理，如用 0.02~0.5％的秋水仙碱溶液处理所获得的 单倍体植株，一般来说木本植物所用浓度要大些，时间也相对较长为宜。此外，利用单倍体 花粉植株茎段和其它部分培养，使之产生愈伤组织，已知在愈伤组织培养中会出现较高的核 内有丝分裂，从而导致染色体数目的加倍，然后在分化培养基上进一步分化芽和根，也可获 得二倍体植株。当然，对于染色体的加倍，事先和事后都要进行细胞学检查。 三、原生质体培养与体细胞杂交 1、原生质体培养与体细胞杂交技术 由于原生质体比完整的细胞更容易摄取外来的遗传物质，可以作为高等植物的遗传转化 的受体系统，而且在一定的条件下可以诱导其融合形成体细胞杂种（somatic hybrid）植株， 因而深受人们关注。目前已从多种园艺作物成功获得原生质体再生植株。 体细胞杂交就是将不同种、属或科间的两个体细胞原生质体进行融合，与常规有性杂交
不同的是打破了种间基因交流的界限，体细胞杂交过程中没有减数分裂，由两个二倍体体细 胞原生质体融合，便产生异源四倍体的杂种植株。而用同样的亲本进行有性杂交则只产生二 倍体杂种。通常在有性杂交中，父本几乎不提供细胞质，通常都出现母本细胞质遗传现象： 而在体细胞原生质体融合时，两个亲本所提供的细胞质差不多是相等的。 当然也可以利用去核原生质体(enucleated protoplast)与正常的原生质体融合而获得胞 质杂种(cybrid),这种杂种具有两个不同物种的混合胞质，但核基因则只是来自一个物种： 另外体细胞杂交也可避免有性杂交中因减数分裂所带来的性状分离。在马铃薯育种中，选择 两个优良的双单倍体进行体细胞杂交，即可获得优良的四倍体马铃薯品种。 体细胞杂交可分为以下几个步骤： 1)原生质体的分离植物细胞具有细胞壁，因此要进行体细胞杂交首先需要设法去掉细 胞壁，获得大量有活力的原生质体。材料的来源一般采用叶肉、茎尖或液体悬浮培养的细胞， 在有合适的渗透稳定剂溶液中（如在高渗的蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇溶液），运用分离细胞 和降解细胞壁的酶（如果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶等）混合处理，进行原生质体分离。 2)诱导原生质体的融合原生质体的融合是体细胞杂交的关键.有自发融合(spontaneous fusion)和诱导融合(induced fusion)两类。当酶降解细胞壁时，常常可以发现相邻的同源原 生质体融合在一起形成同核体(homokaryons),即自发融合。这种自发融合的每一个同核体 中可以发现有2~40个核。当利用正处于活跃分裂的培养细胞制备原生质体时，更容易出现 这种多核融合体。 诱导融合分为化学融合和电融合两种。化学融合多采用高分子量的(1500-6000MW) 28~50%的聚乙二醇(PEG)处理，两个不同物种的异源原生质体就会形成粘连的团聚体，然 后再用高钙(Ca2+)、高pH的溶液处理，诱导融合率可提高到30-50%或更高一些，形成异 核体(heterokaryons)。电融合也是较流行的融合方法，主要步骤是：原生质体悬浮液在两极 间施加高频交流电场（一般为0.4~1.5MHz,100250V/cm),使原生质体偶极化而沿电场线 方向泳动，并相互吸引形成与电场线平行的原生质体链：再用一次或多次瞬间高压直流电脉 冲（一般为3×10μs,1~3KV/cm)来引发质膜的可逆性破裂而形成融合体。 3)异核体的识别和杂种细胞的选择识别真正的异核体识别采用的方法主要有：根据原 生质体特性差异的机械选择法。有人采用形态上有明显差别的原生质体作为融合材料，如胡 萝卜与大麦进行体细胞杂交，利用胡萝卜具有稠密细胞质，无色质粒和淀粉粒的细胞，大麦 则采用具有叶绿体的叶肉细胞，两者的原生质体融合，就能从融合体中找到具有两者特征的 异核体，异核体经重建细胞壁和核融合后，便成为杂种细胞。或者根据杂种细胞生长差异的 选择方法，即利用选择性培养基供杂种细胞选择生长。第三种方法是突变细胞互补选择法。 如利用光敏感性，叶绿素缺陷突变体供互补选择：利用生化突变供杂种细胞的互补选择以及 利用两个非等位白化突变来选择杂种细胞（杂种细胞经互补转为绿色）等。 4)杂种植株的再生获得杂种细胞后在适当的培养基上促进杂种细胞持续分裂，逐渐形 成肉眼可见的愈伤组织，然后再将其转移至分化培养基上进行培养，诱导其分化出胚状体、 芽和根等，形成完整植株。 2、原生质体培养与体细胞杂交的应用 原生质体培养可直接用于作物改良。如从马铃薯叶肉原生质体细胞克隆再生植株群中表 10
10 不同的是打破了种间基因交流的界限，体细胞杂交过程中没有减数分裂，由两个二倍体体细 胞原生质体融合，便产生异源四倍体的杂种植株。而用同样的亲本进行有性杂交则只产生二 倍体杂种。通常在有性杂交中，父本几乎不提供细胞质，通常都出现母本细胞质遗传现象； 而在体细胞原生质体融合时，两个亲本所提供的细胞质差不多是相等的。 当然也可以利用去核原生质体（enucleated protoplast）与正常的原生质体融合而获得胞 质杂种（cybrid），这种杂种具有两个不同物种的混合胞质，但核基因则只是来自一个物种； 另外体细胞杂交也可避免有性杂交中因减数分裂所带来的性状分离。在马铃薯育种中，选择 两个优良的双单倍体进行体细胞杂交，即可获得优良的四倍体马铃薯品种。 体细胞杂交可分为以下几个步骤： 1）原生质体的分离 植物细胞具有细胞壁，因此要进行体细胞杂交首先需要设法去掉细 胞壁，获得大量有活力的原生质体。材料的来源一般采用叶肉、茎尖或液体悬浮培养的细胞， 在有合适的渗透稳定剂溶液中（如在高渗的蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇溶液），运用分离细胞 和降解细胞壁的酶（如果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶等）混合处理，进行原生质体分离。 2）诱导原生质体的融合 原生质体的融合是体细胞杂交的关键。有自发融合（spontaneous fusion）和诱导融合（induced fusion）两类。当酶降解细胞壁时，常常可以发现相邻的同源原 生质体融合在一起形成同核体（homokaryons），即自发融合。这种自发融合的每一个同核体 中可以发现有 2~40 个核。当利用正处于活跃分裂的培养细胞制备原生质体时，更容易出现 这种多核融合体。 诱导融合分为化学融合和电融合两种。化学融合多采用高分子量的（1500~6000MW） 28~50％的聚乙二醇（PEG）处理，两个不同物种的异源原生质体就会形成粘连的团聚体，然 后再用高钙（Ca2+）、高 pH 的溶液处理，诱导融合率可提高到 30~50％或更高一些，形成异 核体（heterokaryons）。电融合也是较流行的融合方法，主要步骤是：原生质体悬浮液在两极 间施加高频交流电场（一般为 0.4~1.5MHz，100~250V/cm），使原生质体偶极化而沿电场线 方向泳动，并相互吸引形成与电场线平行的原生质体链；再用一次或多次瞬间高压直流电脉 冲（一般为 3×10μs，1~3KV/cm）来引发质膜的可逆性破裂而形成融合体。 3）异核体的识别和杂种细胞的选择识别 真正的异核体识别采用的方法主要有：根据原 生质体特性差异的机械选择法。有人采用形态上有明显差别的原生质体作为融合材料，如胡 萝卜与大麦进行体细胞杂交，利用胡萝卜具有稠密细胞质，无色质粒和淀粉粒的细胞，大麦 则采用具有叶绿体的叶肉细胞，两者的原生质体融合，就能从融合体中找到具有两者特征的 异核体，异核体经重建细胞壁和核融合后，便成为杂种细胞。或者根据杂种细胞生长差异的 选择方法，即利用选择性培养基供杂种细胞选择生长。第三种方法是突变细胞互补选择法。 如利用光敏感性，叶绿素缺陷突变体供互补选择；利用生化突变供杂种细胞的互补选择以及 利用两个非等位白化突变来选择杂种细胞（杂种细胞经互补转为绿色）等。 4）杂种植株的再生 获得杂种细胞后在适当的培养基上促进杂种细胞持续分裂，逐渐形 成肉眼可见的愈伤组织，然后再将其转移至分化培养基上进行培养，诱导其分化出胚状体、 芽和根等，形成完整植株。 2、原生质体培养与体细胞杂交的应用 原生质体培养可直接用于作物改良。如从马铃薯叶肉原生质体细胞克隆再生植株群中表