国家自然科学基金申请书 (2)PM0模型的建立与实验分组 12-13月龄雌性BALB/c小鼠 氯胺酮麻醉(100mg/kg),经背部入腹切除双侧卵巢 术后7天,分组(每组10只)并灌服等体积(1m1/天)液体 0VX+(补肾宁心方/E2/生理盐水)组/假手术组/正常组 灌药6周后,从0VX盐水组、正常组、假手术组各随机取2只小鼠的股骨和腰椎 进行病理切片观察,确定PM模型的建立,排除手术的影响。 液体灌胃12周,处死后分别取血、脾脏、子宫和骨 (3)补肾宁心方对骨和子宫内膜芳香化酶活性的调节 补肾宁心方组/E2组 组 分别取子宫内膜和股骨干骺端,匀浆,制备微粒体 (离心:1000g×20min→10000g×20min→105000g×120min) 构建反应体系1m1:50-100μMPBs;0.2-2mg/m微粒体总蛋白 底物:DHEA 加入1 mM NADPH(开始计时),37℃,约10-15min:70%高氯酸 75-100μ1终止反应,迅速涡旋混匀,冰浴冷却 高速离心20000g×20min,4℃ C18反相HPLC分析(粒径5μm,4.6mi.d.×25cm),流动相为乙腈/水 (40:60,V/V)lml/min,柱温40℃,进样量5-20μ1,紫外检测波长254nm 分析产物生成速率,比较芳香化酶的活性 第10页 版本1.018.551国家自然科学基金申请书 第 10 页 版本 1.018.551 （2） PMO 模型的建立与实验分组 12-13 月龄雌性 BALB/c 小鼠 ↓ 氯胺酮麻醉（100mg/kg），经背部入腹切除双侧卵巢 ↓ 术后 7 天，分组（每组 10 只）并灌服等体积（1ml/天）液体 OVX+（补肾宁心方/E2/生理盐水）组/ 假手术组/ 正常组 ↓ 灌药 6 周后，从 OVX+盐水组、正常组、假手术组各随机取 2 只小鼠的股骨和腰椎 进行病理切片观察，确定 PMO 模型的建立，排除手术的影响。 ↓ 液体灌胃 12 周，处死后分别取血、脾脏、子宫和骨 （3） 补肾宁心方对骨和子宫内膜芳香化酶活性的调节 补肾宁心方组/ E2 组/ 盐水组 ↓ 分别取子宫内膜和股骨干骺端，匀浆，制备微粒体 （离心：1000g×20min→10000g×20min→105000g×120min） ↓ 构建反应体系 1ml：50-100μM PBS;0.2-2mg/ml 微粒体总蛋白 底物：DHEA ↓ 加入 1mM NADPH（开始计时），37℃，约 10-15min；70%高氯酸 75-100μl 终止反应，迅速涡旋混匀，冰浴冷却。 ↓ 高速离心 20000g ×20min，4℃ ↓ C18 反相 HPLC 分析（粒径 5μm,4.6mm i.d. ×25 ㎝），流动相为乙腈/水 （40：60，V/V）1ml/min，柱温 40℃，进样量 5-20μl, 紫外检测波长 254nm ↓ 分析产物生成速率，比较芳香化酶的活性