《自然基金》NSFC补肾宁心方.pdf_大学文库

国家自然科学基金申请书第 2 页版本 1.018.551 基本信息 7IeOqrU/ 姓名王文君性别女出生年月 1964 年 7 月民族汉族学位硕士职称副教授主要研究领域中西医结合妇科电话 021-63787331 电子邮件 djli@shmu.edu.cn 传真 021-63787331 个人网页工作单位复旦大学 /妇产科医院申请者信息在研项目批准号名称复旦大学代码 20043301 联系人唐郁电子邮件 jihua@fudan.edu.cn 依托单位信息电话 021-65643671 网站地址 www.fudan.edu.cn 单位名称代码 [在此录入修改] 合作单位信息 [在此录入修改] 项目名称补肾宁心方通过ER非经典途径介导对绝经后骨质疏松的防治作用资助类别面上项目亚类说明自由申请项目附注说明申请代码 C03050402:中西医结合临床基础研究 C03050311:中医老年病学基地类别预计研究年限 2005 年 1 月 — 2007 年 12 月研究属性应用基础研究项目基本信息摘要项目研究内容和意义简介（限 400 字）：用临床疗效确切的补肾宁心方灌服绝经后骨质疏松小鼠模型，分析外周免疫活性细胞 Th1/Th2 型细胞因子的表达、内分泌(E2、DHEA)和骨生化指标的变化，观察药物对骨及子宫内膜芳香化酶活性的影响，比较药物对成骨细胞(OB)生物学功能及子宫内膜作用的差异。体外培养 OB，模拟雌激素衰退，分析 OB 优势表达的雌激素受体（ER）亚型，及药物血清对骨吸收抑制因子（OPG）和优势 ER 亚型（α或β）的调节作用。根据体内、外研究结果， RNAi 技术建立优势 ER 亚型沉默表达的成骨细胞及内膜癌细胞系，分析其 pERK1/2 的表达及细胞的增殖与凋亡，解析 ER 亚型介导的信号途径及其对靶细胞的影响。阐明该复方防治绝经后骨质疏松，而对生殖系统无雌激素样副作用的机理。该研究还将有助于寻找药物归经的物质基础，深化中医药的药物归经理论。关键词(用分号分开，最多 5 个) 绝经后骨质疏松；补肾宁心方；雌激素受体；RNAi；选择性作用

国家自然科学基金申请书查看报告正文撰写提纲」报告正文 (一)立项依据与研究内容(4000-8000字项目的立项依据(附主要的参考文献目录【项目的研究意义】绝经后骨质疏松症( postmenopausal osteoporosis,PMO)及其所致的骨折是全球性老年人病死率和医疗费升高的主要原因;随着世界人口的老龄化,PMO将成为前所未有的公共卫生问题。我们据《素问·上古天真论》“女子七七肾气衰,…任脉虚,太冲脉衰少”而组方的补肾宁心方(曾用名更年健/青/春),具有补肾宁心,燮理阴阳的功能。不仅能有效地改善围绝经期妇女的精神和神经症状,同时对绝经后骨质疏松有良好的防治作用23。围绝经期妇女在口服“更年春”后外周血E2 水平无明显变化,Th细胞比例显著增加,IL-2诱生水平明显升高。另外,“更年春”能增强老年雌性大鼠脾细胞雌激素受体(ER)的表达,从而增强雌激素对免疫细胞的生物效应,改善衰老机体的免疫功能。在成骨细胞(OB)和破骨细胞(0C)维持的骨代谢平衡中,0B起着非常重要的作用,而目前应用的经典抗骨质疏松药物(降钙素、二磷酸盐、雌激素等),多为抑制C活性的药物,缺乏刺激OB活性或既刺激OB又抑制OC的药物。因此,应该在深入研究和发掘化学合成药物的同时,更应注重天然植物化合物的开发应用。在补肾宁心方改善围绝经期症状及对骨质疏松良好疗效的基础上,进一步探讨其对绝经后骨质疏松的疗效机制具有重要的意义。【立项依据及国内外研究现状】近来美国妇女健康协会( Wommen' s Health Initiative,wHI)临床研究发现,激素替代治疗(HRT) 虽然降低了骨质疏松和骨折的危险性;但增加了乳腺癌、子宫内膜癌以及心血管疾患、中风的发病率。总体权衡HRT的利弊显示,对妇女健康的风险超过了受益。大量的临床和实验研究证明, 以补肾为主的“更年春”复方对更年期综合征具有良好效果,实验证明老年大鼠灌服“更年春”后虽然其血雌激素浓度不增高,但其下丘脑、垂体、卵巢、脾脏雌激素受体(ER)含量增加‘*5。实验还证实,“更年春”对实验性原发性骨质疏松有防治作用23,并初步证实补肾宁心方对OB的增殖作用。因而进一步探讨ER介导补肾宁心方对PMO的疗效机制具有重要的现实意义。有研究认为,雌激素替代治疗(ERT)既无刺激骨早期合成的效应,也无抑制骨吸收的效应值得注意的是:一些低雌激素(E)水平的妇女并不发生骨质疏松。另外,在E-ER效应机制中,雌激素受体比雌激素扮演着更为重要的角色。目前认为,ERa和ERβ(1996年新克隆的受体)两种第5页版本1.018.551

国家自然科学基金申请书第 5 页版本 1.018.551 查看报告正文撰写提纲报告正文（一）立项依据与研究内容（4000-8000 字）： 1、项目的立项依据（附主要的参考文献目录）。【项目的研究意义】绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis, PMO)及其所致的骨折是全球性老年人病死率和医疗费升高的主要原因；随着世界人口的老龄化，PMO 将成为前所未有的公共卫生问题（1）。我们据《素问·上古天真论》“女子七七肾气衰，…任脉虚，太冲脉衰少”而组方的补肾宁心方（曾用名更年健/青/春），具有补肾宁心，燮理阴阳的功能。不仅能有效地改善围绝经期妇女的精神和神经症状，同时对绝经后骨质疏松有良好的防治作用（2、3）。围绝经期妇女在口服“更年春”后外周血 E2 水平无明显变化，Th 细胞比例显著增加，IL-2 诱生水平明显升高（4）。另外，“更年春”能增强老年雌性大鼠脾细胞雌激素受体（ER）的表达,从而增强雌激素对免疫细胞的生物效应，改善衰老机体的免疫功能（5）。在成骨细胞（OB）和破骨细胞(OC)维持的骨代谢平衡中，OB 起着非常重要的作用，而目前应用的经典抗骨质疏松药物（降钙素、二磷酸盐、雌激素等），多为抑制 OC 活性的药物，缺乏刺激 OB 活性或既刺激 OB 又抑制 OC 的药物。因此，应该在深入研究和发掘化学合成药物的同时，更应注重天然植物化合物的开发应用（6）。在补肾宁心方改善围绝经期症状及对骨质疏松良好疗效的基础上，进一步探讨其对绝经后骨质疏松的疗效机制具有重要的意义。【立项依据及国内外研究现状】近来美国妇女健康协会（Wommen’s Health lnitiative,WHI）临床研究发现，激素替代治疗（HRT）虽然降低了骨质疏松和骨折的危险性；但增加了乳腺癌、子宫内膜癌以及心血管疾患、中风的发病率（7）。总体权衡 HRT 的利弊显示，对妇女健康的风险超过了受益。大量的临床和实验研究证明，以补肾为主的“更年春”复方对更年期综合征具有良好效果，实验证明老年大鼠灌服“更年春”后虽然其血雌激素浓度不增高，但其下丘脑、垂体、卵巢、脾脏雌激素受体（ER）含量增加（4，5）。实验还证实，“更年春”对实验性原发性骨质疏松有防治作用（2，3），并初步证实补肾宁心方对 OB 的增殖作用（8）。因而进一步探讨 ER 介导补肾宁心方对 PMO 的疗效机制具有重要的现实意义。有研究认为，雌激素替代治疗（ERT）既无刺激骨早期合成的效应，也无抑制骨吸收的效应（9）。值得注意的是：一些低雌激素（E）水平的妇女并不发生骨质疏松。另外，在 E-ER 效应机制中，雌激素受体比雌激素扮演着更为重要的角色。目前认为，ERα和 ERβ（1996 年新克隆的受体）两种

国家自然科学基金申请书受体亚型具有各自独特的转录激活区域,以及不同的组织分布,可能是靶组织对E呈现不同反应的关键因素。因此,药物对PMO的治疗作用与对生殖系统的副作用是可以区分的。最近合成的化合物—— Estren,可能通过激活MAK途径,防治PMo而无刺激子宫内膜增生的作用,为实现这一理想的疗效初步提供了可以借鉴的方法和途径 RNAi(RMA干扰)技术通过双链RNA(dsRM)引发转录后沉默,产生RNAi现象12)。该技术具有高度的序列专一性,可使特定基因不表达,比反义RNA技术和同源共抑制更有效,更容易产生功能丧失或降低突变,目前已经成功地对上百种哺乳动物细胞目的基因进行功能分析,从而成为一种抑制体细胞功能基因翻译表达的有效工具13)。将药物作用下的优势ER亚型选择性地抑制表达,可有效地分析ER介导药物作用的机制,国内外迄今未见利用此技术研究中药作用机制的报道。参考文献 1.王玉东,李大金:绝经后骨质疏松症发生的分子机制。中华老年医学杂志2003;22(3):187 2.王文君,俞瑾,王静:“更年春”对实验性原发性骨质疏松病理形态学的初步作察.上海医科大学学报2000;27(1):54-6 3.王文君,俞瑾,王静:中药“更年春”对大鼠实验性原发性骨质疏松的预防作用观察.上海中医药杂志2001;35(11)46-9 4.李大金李超荆俞瑾等:中药复方对更年期综合征妇女生殖内分泌免疫功能的调节.上海免疫学杂志195,15(5)257-60 5.王文君俞谨,李大金中药复方”更年春”对老年雌性大鼠脾细胞ER及Ⅱ-2、TNF活性的影响生殖与避孕1996;16(4):263-7 6.廖二元骨质疏松研究的现状与展望.中华内分泌代谢杂志2002;18(2):87-9 7. Martin Enserink. The Vanishing Promises of Hormone Replacement. Science 2002; 297: 325-6 8.王玉东,李大金补肾宁心方对成骨细胞的增殖和抗凋亡作用.中国中西医结合杂志2004(待发表) 9. Fiore CE, Pennisi P, Tandurella FG et al. Response of biochemical of bone turnover to estrogen treatment in post-menopausal women: evidence against an early anabolic effect on bone formation Endocrinol Invest 2001; 24(6): 423-9 10. Gilles B. Tremblay l, Andre Tremblay l, Neal G. Copeland, et al. Cloning, Chromosomal Localization, and Functional Analysis of the Murine Estrogen Receptor B. Molecular Endocrinology 1997; 11(3) 353-65 11. Miller G. Divorcing estrogen,'s bright and dark sides. Science 2002: 298: 723-4 12. Phillip D. Zamore, Thomas Tuschl, Phillip A. Sharp. RNAi: Double-Stranded RNA Directs the ATP-Dependent Cleavage of mRNA at 21 to 23 Nucleotide Intervals. Cell 2000: 101: 25-33 13. Morita T, Yoshida K. RNAi provides a new tool for functional analyses of the mammalian genes Tanpakushitsu Kakusan Koso 2002 47(14): 1839-45 第6页版本1.018.551

国家自然科学基金申请书第 6 页版本 1.018.551 受体亚型具有各自独特的转录激活区域，以及不同的组织分布，可能是靶组织对 E 呈现不同反应的关键因素（10）。因此，药物对 PMO 的治疗作用与对生殖系统的副作用是可以区分的。最近合成的化合物——Estren，可能通过激活 MAPK 途径，防治 PMO 而无刺激子宫内膜增生的作用，为实现这一理想的疗效初步提供了可以借鉴的方法和途径（11）。 RNAi（RNA干扰）技术通过双链RNA（dsRNA）引发转录后沉默，产生RNAi现象（12）。该技术具有高度的序列专一性，可使特定基因不表达，比反义RNA技术和同源共抑制更有效，更容易产生功能丧失或降低突变，目前已经成功地对上百种哺乳动物细胞目的基因进行功能分析，从而成为一种抑制体细胞功能基因翻译表达的有效工具（13）。将药物作用下的优势ER亚型选择性地抑制表达，可有效地分析ER介导药物作用的机制，国内外迄今未见利用此技术研究中药作用机制的报道。参考文献 1. 王玉东，李大金：绝经后骨质疏松症发生的分子机制。中华老年医学杂志 2003；22（3）：187 －8 2. 王文君，俞瑾, 王静：“更年春”对实验性原发性骨质疏松病理形态学的初步作察.上海医科大学学报 2000；27（1）：54-6 3. 王文君，俞瑾,王静：中药“更年春”对大鼠实验性原发性骨质疏松的预防作用观察.上海中医药杂志 2001;35(11):46-9 4. 李大金,李超荆,俞瑾等: 中药复方对更年期综合征妇女生殖内分泌免疫功能的调节. 上海免疫学杂志 1995; 15(5):257-60 5. 王文君,俞谨, 李大金. 中药复方”更年春”对老年雌性大鼠脾细胞 ER 及 IL-2、TNF 活性的影响.生殖与避孕 1996；16（4）：263-7 6. 廖二元.骨质疏松研究的现状与展望.中华内分泌代谢杂志 2002；18（2）：87-9. 7. Martin Enserink. The Vanishing Promises of Hormone Replacement. Science 2002; 297: 325-6. 8. 王玉东，李大金. 补肾宁心方对成骨细胞的增殖和抗凋亡作用. 中国中西医结合杂志 2004 (待发表) 9. Fiore CE, Pennisi P, Tandurella FG, et al. Response of biochemical of bone turnover to estrogen treatment in post-menopausal women: evidence against an early anabolic effect on bone formation. J Endocrinol Invest 2001; 24(6): 423-9. 10. Gilles B. Tremblay1, André Tremblay1, Neal G. Copeland, et al. Cloning, Chromosomal Localization, and Functional Analysis of the Murine Estrogen Receptor ß. Molecular Endocrinology 1997; 11 (3): 353-65. 11. Miller G. Divorcing estrogen's bright and dark sides. Science 2002; 298:723-4. 12. Phillip D. Zamore, Thomas Tuschl, Phillip A. Sharp. RNAi: Double-Stranded RNA Directs the ATP-Dependent Cleavage of mRNA at 21 to 23 Nucleotide Intervals. Cell 2000; 101:25–33. 13. Morita T, Yoshida K. RNAi provides a new tool for functional analyses of the mammalian genes. Tanpakushitsu Kakusan Koso 2002;47(14):1839-45

国家自然科学基金申请书 2、项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键问题【建立假设】补肾宁心方能防治PMO而少见ERT样副作用。该方对老年大鼠外周血E水平无明显影响,但可增强ER的表达,具有促进OB增殖和抗凋亡作用。因此,该方通过哪种ER亚型、介导何种信号转导途径发挥选择性作用,是本题亟待解决的问题。【研究目标】 (1)观察补肾宁心方对免疫内分泌、骨生化指标和芳香化酶活性的影响:比较该方对骨与子宫作用的差异。 (2)体外培养OB,分析正常及药物血清作用下优势表达的ER亚型。 (3)建立优势ER亚型沉默表达的人0B细胞系(MG63)和人子宫内膜癌细胞系(HEC1-B),结合抗ER亚型与抗AR(雄激素受体)单抗对信号传导途径的阻断作用,确定在骨及子宫内膜中发挥重要作用的ER亚型及其信号转导途径【研究内容】 (1)补肾宁心复方灌服PMo模型BALB/c小鼠12周,处死后取椎骨测定BD、形态计量、原位分析OB凋亡,称量子宫湿重;制备药物血清,测定E2、脱氢表雄酮 (DHEA):取脾脏免疫活性细胞分析Th/Th2型细胞因子的表达水平;取颅骨植块法培养,观察骨片融合时间、OB增殖能力的变化 (2)透射电镜下观察左股骨的胶原纤维排列,OB形态及其细胞器的变化。取右股骨松质端和子宫内膜制备微粒体,分析芳香化酶活性。取胫骨,提取总RNA,分析骨吸收抑制因子(OPG) 和优势表达的ER亚型。 3)取新生BALB/c小鼠颅骨酶解法培养B,体外模拟雌激素撤退现象,予以药物血淸局部干预, 观察优势表达的ER亚型及0B增殖能力的改变 (4)扫描优势ER亚型编码区基因中的A序列,据其皿RNA低二级结构的区域设计 SiRNA,用T7 体外转录 SIRNA,纯化并转染hG63和HC1-B细胞系,建立优势ER亚型沉默表达的细胞系, 分析该亚型缺失(或低表达)对pRK1/2(MAPK途径中磷酸化的细胞外信号调控激酶)的【拟解决的关键问题】 (1)分析OB优势表达的ER亚型及其胞内信号转导途径,阐明中药复方治疗PMO的作用机制。 (2)通过比较补肾宁心方对不同组织的选择性作用,使有效治疗PM0而避免HRT样副作用成为可能,从而深化中医药的药物归经理论第7页版本1.018.551

国家自然科学基金申请书第 7 页版本 1.018.551 2、项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键问题。【建立假设】补肾宁心方能防治 PMO 而少见 ERT 样副作用。该方对老年大鼠外周血 E2水平无明显影响，但可增强 ER 的表达，具有促进 OB 增殖和抗凋亡作用。因此，该方通过哪种 ER 亚型、介导何种信号转导途径发挥选择性作用，是本题亟待解决的问题。【研究目标】（1）观察补肾宁心方对免疫内分泌、骨生化指标和芳香化酶活性的影响；比较该方对骨与子宫作用的差异。（2）体外培养 OB，分析正常及药物血清作用下优势表达的 ER 亚型。（3）建立优势 ER 亚型沉默表达的人 OB 细胞系（MG63）和人子宫内膜癌细胞系（HEC1-B），结合抗 ER 亚型与抗 AR（雄激素受体）单抗对信号传导途径的阻断作用，确定在骨及子宫内膜中发挥重要作用的 ER 亚型及其信号转导途径。【研究内容】（1）补肾宁心复方灌服 PMO 模型 BALB/c 小鼠 12 周，处死后取椎骨测定 BMD、形态计量、原位分析 OB 凋亡，称量子宫湿重；制备药物血清，测定 E2、脱氢表雄酮(DHEA)；取脾脏免疫活性细胞分析 Th1/Th2 型细胞因子的表达水平；取颅骨植块法培养，观察骨片融合时间、OB 增殖能力的变化。（2）透射电镜下观察左股骨的胶原纤维排列，OB 形态及其细胞器的变化。取右股骨松质端和子宫内膜制备微粒体，分析芳香化酶活性。取胫骨，提取总 RNA，分析骨吸收抑制因子（OPG）和优势表达的 ER 亚型。（3）取新生 BALB/c 小鼠颅骨酶解法培养 OB，体外模拟雌激素撤退现象，予以药物血清局部干预，观察优势表达的 ER 亚型及 OB 增殖能力的改变。（4）扫描优势 ER 亚型编码区基因中的 AA 序列，据其 mRNA 低二级结构的区域设计 siRNA，用 T7 体外转录 siRNA，纯化并转染 hMG63 和 HEC1-B 细胞系，建立优势 ER 亚型沉默表达的细胞系，分析该亚型缺失（或低表达）对 pERK1/2（MAPK 途径中磷酸化的细胞外信号调控激酶）的影响。【拟解决的关键问题】（1）分析 OB 优势表达的 ER 亚型及其胞内信号转导途径，阐明中药复方治疗 PMO 的作用机制。（2）通过比较补肾宁心方对不同组织的选择性作用，使有效治疗 PMO 而避免 HRT 样副作用成为可能，从而深化中医药的药物归经理论