检查保护 国家自然科学基金 申请书 申报日期 2004年2月16日 国家自然科学基金委员会
申请代码： 受理部门： 收件日期： 受理编号： 检查保护 国家自然科学基金 申 请 书 资助类别： 亚类说明： 附注说明： 项目名称： 申 请 者： 电话： 依托单位： 通讯地址： 邮政编码： 单位电话： 电子邮件： 申报日期： 2004年2月16日 国家自然科学基金委员会 您现在不能检查保护文档或打印文档，请根据以下三个步骤操作： 1)如果您是 Word2000 或以上版本用户，请把 Word 宏的安全性设为:"中" 方法: Word 菜单->工具->宏->安全性->安全级,设置为"中" (如果您是 Word97 用户，继续执行以下步骤) 2)关闭本文档，重新打开本文档 3)点击"启用宏"按钮，即可开始填写本文档或打印了
国家自然科学基金申请 基本信息 名/王文君 性别女年月94年7月民族汉族 姓学电传 位|硕士 职称副教授 主要研究领域|中西医结合妇科 请 话021-63787331 电子邮件dili@shmu.edu.cn 者 真|021-63787331 信 个人网页 息工作单位复旦大学/妇产科医院 在研项目批准号 名称复旦大学 代码20043301 莅联系人唐郁 电子邮件jihua@fudan.edu.cn 信 话021-65643671 网站地址|w. fudan.edu.cn 单位名称 代码 单[在此录入修改 [在此录入修改] 项目名称 补肾宁心方通过ER非经典途径介导对绝经后骨质疏松的防治作用 项「资助类别面上项目 亚类说明自由申请项目 附注说明 基 本床基础研究 C0305002:中西医结合临c0305031:中医老年病学 信基地类别 息预计研究年限2005年1月-2007年12月研究属性|应用基础研究 项目研究内容和意义简介(限400字) 用临床疗效确切的补肾宁心方灌服绝经后骨质疏松小鼠模型,分析外周免疫活性细胞 摘|11/D2型细胞因子的表达,内分泌(B2,0和骨生化指标的变化,观察药物对骨及子宫 内膜芳香化酶活性的影响,比较药物对成骨细胞(OB)生物学功能及子宫内膜作用的差异 体外培养0B,模拟雌激素衰退,分析OB优势表达的雌激素受体(ER)亚型,及药物血清对 骨吸收抑制因子(0PG)和优势ER亚型(α或β)的调节作用。根据体内、外研究结果, RNAi技术建立优势ER亚型沉默表达的成骨细胞及内膜癌细胞系,分析其pERK1/2的表达及 要细胞的增殖与调亡,解析ER亚型介导的信号途径及其对靶细胞的影响。阐明该复方防治绝 经后骨质疏松,而对生殖系统无雌激素样副作用的机理。该研究还将有助于寻找药物归经 的物质基础,深化中医药的药物归经理论 关键词(用分号分开,最多5个)绝经后骨质疏松:补肾宁心方;雌激素受体:RNAi;选择性作用 第2页 版本1.018.551
国家自然科学基金申请书 第 2 页 版本 1.018.551 基本信息 7IeOqrU/ 姓 名 王文君 性别 女 出生 年月 1964 年 7 月 民 族 汉族 学 位 硕士 职称 副教授 主要研究领域 中西医结合妇科 电 话 021-63787331 电子邮件 djli@shmu.edu.cn 传 真 021-63787331 个 人 网 页 工 作 单 位 复旦大学 /妇产科医院 申 请 者 信 息 在研项目批准号 名 称 复旦大学 代 码 20043301 联 系 人 唐郁 电子邮件 jihua@fudan.edu.cn 依托单位信息 电 话 021-65643671 网站地址 www.fudan.edu.cn 单 位 名 称 代 码 [在此录入修改] 合作单位信息 [在此录入修改] 项目名称 补肾宁心方通过ER非经典途径介导对绝经后骨质疏松的防治作用 资助类别 面上项目 亚类说明 自由申请项目 附注说明 申请代码 C03050402:中西医结合临 床基础研究 C03050311:中医老年病学 基地类别 预计研究年限 2005 年 1 月 — 2007 年 12 月 研究属性 应用基础研究 项 目 基 本 信 息 摘 要 项目研究内容和意义简介（限 400 字）： 用临床疗效确切的补肾宁心方灌服绝经后骨质疏松小鼠模型，分析外周免疫活性细胞 Th1/Th2 型细胞因子的表达、内分泌(E2、DHEA)和骨生化指标的变化，观察药物对骨及子宫 内膜芳香化酶活性的影响，比较药物对成骨细胞(OB)生物学功能及子宫内膜作用的差异。 体外培养 OB，模拟雌激素衰退，分析 OB 优势表达的雌激素受体（ER）亚型，及药物血清对 骨吸收抑制因子（OPG）和优势 ER 亚型（α或β）的调节作用。根据体内、外研究结果， RNAi 技术建立优势 ER 亚型沉默表达的成骨细胞及内膜癌细胞系，分析其 pERK1/2 的表达及 细胞的增殖与凋亡，解析 ER 亚型介导的信号途径及其对靶细胞的影响。阐明该复方防治绝 经后骨质疏松，而对生殖系统无雌激素样副作用的机理。该研究还将有助于寻找药物归经 的物质基础，深化中医药的药物归经理论。 关 键 词(用分号分开，最多 5 个) 绝经后骨质疏松；补肾宁心方；雌激素受体；RNAi；选择性作用
国家自然科学基金申讠 项目组主要成员(杰出青年科学基金不填此栏) 编号姓名 出生年月性别职称学位 单位名称 电话 电子邮件 项目分工作时间 (月) 1钱来 1952-46女|副教授学士复旦大学 021-637873 djligshmu. edu. cn 实验设计 实验及总结 俞瑾 1935106女|教授学士复旦大学 021-6378731djlieshmu. edu.cn 参与课题设5 计及监督 3 王玉东 1974-4-17男|博士生博士复旦大学 021-637813djlieshmu.edu.cn 生物学功能10 郝群 1973-4-13女博士生博士复旦大学 02:6873li@shu.cdu.cn|实验 分子生物学10 5/朱影 1956714女|技师其他复旦大学 03+3701| djlieshmu. edu. cn|免疫学技术5 1975-7-30男|技师 其他复旦大学 021-637701djligshmu. edu.cn 61286 动物实验 6 在此录入修改] 8|在此录入修改 9|【在此录入修改 总人数 高级 中级 博士后 博士生 硕士生 说明:1.高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生人员数由申请者负责填报,总人数自动生成。 2.项目组主要成员不包括项目申请者 版本1018551
国家自然科学基金申请书 第 3 页 版本 1.018.551 项目组主要成员(杰出青年科学基金不填此栏) 编号 姓 名 出生年月 性别 职 称 学 位 单位名称 电话 电子邮件 项目分工 每年工 作时间 （月） 1 钱来娣 1952-4-6 女 副教授 学士 复旦大学 021-637873 31 djli@shmu.edu.cn 实验设计、 实验及总结 8 2 俞瑾 1935-10-6 女 教授 学士 复旦大学 021-637873 31 djli@shmu.edu.cn 参与课题设 计及监督 5 3 王玉东 1974-4-17 男 博士生 博士 复旦大学 021-637873 31 djli@shmu.edu.cn 生物学功能 10 4 郝群 1973-4-13 女 博士生 博士 复旦大学 021-637873 31 djli@shmu.cdu.cn 分子生物学 实验 10 5 朱影 1956-7-14 女 技师 其他 复旦大学 021-637701 618＊286 djli@shmu.edu.cn 免疫学技术 5 6 孟毅 1975-7-30 男 技师 其他 复旦大学 021-637701 61＊286 djli@shmu.edu.cn 动物实验 6 7 [在此录入修改] 8 [在此录入修改] 9 [在此录入修改] 总人数 高级 中级 初级 博士后 博士生 硕士生 7 3 0 2 0 2 说明: 1. 高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生人员数由申请者负责填报，总人数自动生成。 说明: 2. 项目组主要成员不包括项目申请者
国家自然科学基金申请书 经费申请表 (金额单位:万元) 科目 申请经费 备注(计算依据与说明) 研究经费 6000 1.科研业务费 4.5000 (1)测试/计算/分析费 1.000物模型的建立,骨生化指标测定等 (2)能源/动力费 1.0000水电煤气、液氮的维持等 (3)会议费/差旅费 0.5000学术会议、参加学习班等 (4)出版物/文献/信息传播费 1.000查新、发表文章、论文编写、成果鉴定等 (5)其它 1.000购买相关分子生物学软件等 2.实验材料费 12.6000 (1)原材料/试剂/药品购置费 020细胞培养,分子生物学实验、流式高效液相试剂 及 (2)其它 2.4000 购买动物、饲喂、手术等,培养瓶/板等一次性物 3.仪器设备费 1.0000 (1)购置 1.0000实验仪器的保养和维护 (2)试制 0.0000 4.实验室改装费 0.0000 5.协作费 1.5000中药提制、未脱钙骨的冰冻切片 国际合作与交流费 0000 1.项目组成员出国合作交流 2.0000 2.境外专家来华合作交流 1.0000 三.劳务费 1.0000博士后及研究生津贴 四管理费 0.5000 合计 24.1000 国家其他计划资助经费 与本项目相关的 其他经费来源 其他经费资助(含部门匹配) 其他经费来源合计 0.0000 版本1.018.551
国家自然科学基金申请书 第 4 页 版本 1.018.551 经费申请表 （金额单位：万元） 科目 申请经费 备注（计算依据与说明） 一.研究经费 19.6000 1.科研业务费 4.5000 （1）测试/计算/分析费 1.0000 动物模型的建立，骨生化指标测定等。 （2）能源/动力费 1.0000 水电煤气、液氮的维持等 （3）会议费/差旅费 0.5000 学术会议、参加学习班等 （4）出版物/文献/信息传播费 1.0000 查新、发表文章、论文编写、成果鉴定等 （5）其它 1.0000 购买相关分子生物学软件等 2.实验材料费 12.6000 （1）原材料/试剂/药品购置费 10.2000 细胞培养、分子生物学实验、流式/高效液相试剂、 激素、细胞因子及其测定试剂盒 （2）其它 2.4000 购买动物、饲喂、手术等，培养瓶/板等一次性物 品 3.仪器设备费 1.0000 （1）购置 1.0000 实验仪器的保养和维护 （2）试制 0.0000 4.实验室改装费 0.0000 5.协作费 1.5000 中药提制、未脱钙骨的冰冻切片 二.国际合作与交流费 3.0000 1.项目组成员出国合作交流 2.0000 2.境外专家来华合作交流 1.0000 三.劳务费 1.0000 博士后及研究生津贴 四.管理费 0.5000 合 计 24.1000 国家其他计划资助经费 其他经费资助（含部门匹配） 与本项目相关的 其他经费来源 其他经费来源合计 0.0000
国家自然科学基金申请书 查看报告正文撰写提纲」 报告正文 (一)立项依据与研究内容(4000-8000字 项目的立项依据(附主要的参考文献目录 【项目的研究意义】 绝经后骨质疏松症( postmenopausal osteoporosis,PMO)及其所致的骨折是全球性老年人病死 率和医疗费升高的主要原因;随着世界人口的老龄化,PMO将成为前所未有的公共卫生问题。我 们据《素问·上古天真论》“女子七七肾气衰,…任脉虚,太冲脉衰少”而组方的补肾宁心方(曾用 名更年健/青/春),具有补肾宁心,燮理阴阳的功能。不仅能有效地改善围绝经期妇女的精神和神经 症状,同时对绝经后骨质疏松有良好的防治作用23。围绝经期妇女在口服“更年春”后外周血E2 水平无明显变化,Th细胞比例显著增加,IL-2诱生水平明显升高。另外,“更年春”能增强老年 雌性大鼠脾细胞雌激素受体(ER)的表达,从而增强雌激素对免疫细胞的生物效应,改善衰老机体的 免疫功能。 在成骨细胞(OB)和破骨细胞(0C)维持的骨代谢平衡中,0B起着非常重要的作用,而目前应用 的经典抗骨质疏松药物(降钙素、二磷酸盐、雌激素等),多为抑制C活性的药物,缺乏刺激OB活 性或既刺激OB又抑制OC的药物。因此,应该在深入研究和发掘化学合成药物的同时,更应注重天 然植物化合物的开发应用。在补肾宁心方改善围绝经期症状及对骨质疏松良好疗效的基础上,进 一步探讨其对绝经后骨质疏松的疗效机制具有重要的意义。 【立项依据及国内外研究现状】 近来美国妇女健康协会( Wommen' s Health Initiative,wHI)临床研究发现,激素替代治疗(HRT) 虽然降低了骨质疏松和骨折的危险性;但增加了乳腺癌、子宫内膜癌以及心血管疾患、中风的发病 率。总体权衡HRT的利弊显示,对妇女健康的风险超过了受益。大量的临床和实验研究证明, 以补肾为主的“更年春”复方对更年期综合征具有良好效果,实验证明老年大鼠灌服“更年春”后 虽然其血雌激素浓度不增高,但其下丘脑、垂体、卵巢、脾脏雌激素受体(ER)含量增加‘*5。实 验还证实,“更年春”对实验性原发性骨质疏松有防治作用23,并初步证实补肾宁心方对OB的增 殖作用。因而进一步探讨ER介导补肾宁心方对PMO的疗效机制具有重要的现实意义。 有研究认为,雌激素替代治疗(ERT)既无刺激骨早期合成的效应,也无抑制骨吸收的效应 值得注意的是:一些低雌激素(E)水平的妇女并不发生骨质疏松。另外,在E-ER效应机制中,雌 激素受体比雌激素扮演着更为重要的角色。目前认为,ERa和ERβ(1996年新克隆的受体)两种 第5页 版本1.018.551
国家自然科学基金申请书 第 5 页 版本 1.018.551 查看报告正文撰写提纲 报告正文 （一）立项依据与研究内容（4000-8000 字）： 1、 项目的立项依据（附主要的参考文献目录）。 【项目的研究意义】 绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis, PMO)及其所致的骨折是全球性老年人病死 率和医疗费升高的主要原因；随着世界人口的老龄化，PMO 将成为前所未有的公共卫生问题（1）。我 们据《素问·上古天真论》“女子七七肾气衰，…任脉虚，太冲脉衰少”而组方的补肾宁心方（曾用 名更年健/青/春），具有补肾宁心，燮理阴阳的功能。不仅能有效地改善围绝经期妇女的精神和神经 症状，同时对绝经后骨质疏松有良好的防治作用（2、3）。围绝经期妇女在口服“更年春”后外周血 E2 水平无明显变化，Th 细胞比例显著增加，IL-2 诱生水平明显升高（4）。另外，“更年春”能增强老年 雌性大鼠脾细胞雌激素受体（ER）的表达,从而增强雌激素对免疫细胞的生物效应，改善衰老机体的 免疫功能（5） 。 在成骨细胞（OB）和破骨细胞(OC)维持的骨代谢平衡中，OB 起着非常重要的作用，而目前应用 的经典抗骨质疏松药物（降钙素、二磷酸盐、雌激素等），多为抑制 OC 活性的药物，缺乏刺激 OB 活 性或既刺激 OB 又抑制 OC 的药物。因此，应该在深入研究和发掘化学合成药物的同时，更应注重天 然植物化合物的开发应用（6）。在补肾宁心方改善围绝经期症状及对骨质疏松良好疗效的基础上，进 一步探讨其对绝经后骨质疏松的疗效机制具有重要的意义。 【立项依据及国内外研究现状】 近来美国妇女健康协会（Wommen’s Health lnitiative,WHI）临床研究发现，激素替代治疗（HRT） 虽然降低了骨质疏松和骨折的危险性；但增加了乳腺癌、子宫内膜癌以及心血管疾患、中风的发病 率（7）。总体权衡 HRT 的利弊显示，对妇女健康的风险超过了受益。大量的临床和实验研究证明， 以补肾为主的“更年春”复方对更年期综合征具有良好效果，实验证明老年大鼠灌服“更年春”后 虽然其血雌激素浓度不增高，但其下丘脑、垂体、卵巢、脾脏雌激素受体（ER）含量增加（4，5） 。实 验还证实，“更年春”对实验性原发性骨质疏松有防治作用（2，3） ，并初步证实补肾宁心方对 OB 的增 殖作用（8） 。因而进一步探讨 ER 介导补肾宁心方对 PMO 的疗效机制具有重要的现实意义。 有研究认为，雌激素替代治疗（ERT）既无刺激骨早期合成的效应，也无抑制骨吸收的效应（9） 。 值得注意的是：一些低雌激素（E）水平的妇女并不发生骨质疏松。另外，在 E-ER 效应机制中，雌 激素受体比雌激素扮演着更为重要的角色。目前认为，ERα和 ERβ（1996 年新克隆的受体）两种
国家自然科学基金申请书 受体亚型具有各自独特的转录激活区域,以及不同的组织分布,可能是靶组织对E呈现不同反应的 关键因素。因此,药物对PMO的治疗作用与对生殖系统的副作用是可以区分的。最近合成的化 合物—— Estren,可能通过激活MAK途径,防治PMo而无刺激子宫内膜增生的作用,为实现这一 理想的疗效初步提供了可以借鉴的方法和途径 RNAi(RMA干扰)技术通过双链RNA(dsRM)引发转录后沉默,产生RNAi现象12)。该技术具有 高度的序列专一性,可使特定基因不表达,比反义RNA技术和同源共抑制更有效,更容易产生功能丧 失或降低突变,目前已经成功地对上百种哺乳动物细胞目的基因进行功能分析,从而成为一种抑制 体细胞功能基因翻译表达的有效工具13)。将药物作用下的优势ER亚型选择性地抑制表达,可有效地 分析ER介导药物作用的机制,国内外迄今未见利用此技术研究中药作用机制的报道。 参考文献 1.王玉东,李大金:绝经后骨质疏松症发生的分子机制。中华老年医学杂志2003;22(3):187 2.王文君,俞瑾,王静:“更年春”对实验性原发性骨质疏松病理形态学的初步作察.上海医科大学 学报2000;27(1):54-6 3.王文君,俞瑾,王静:中药“更年春”对大鼠实验性原发性骨质疏松的预防作用观察.上海中医药 杂志2001;35(11)46-9 4.李大金李超荆俞瑾等:中药复方对更年期综合征妇女生殖内分泌免疫功能的调节.上海免疫学 杂志195,15(5)257-60 5.王文君俞谨,李大金中药复方”更年春”对老年雌性大鼠脾细胞ER及Ⅱ-2、TNF活性的影响生 殖与避孕1996;16(4):263-7 6.廖二元骨质疏松研究的现状与展望.中华内分泌代谢杂志2002;18(2):87-9 7. Martin Enserink. The Vanishing Promises of Hormone Replacement. Science 2002; 297: 325-6 8.王玉东,李大金补肾宁心方对成骨细胞的增殖和抗凋亡作用.中国中西医结合杂志2004(待发 表) 9. Fiore CE, Pennisi P, Tandurella FG et al. Response of biochemical of bone turnover to estrogen treatment in post-menopausal women: evidence against an early anabolic effect on bone formation Endocrinol Invest 2001; 24(6): 423-9 10. Gilles B. Tremblay l, Andre Tremblay l, Neal G. Copeland, et al. Cloning, Chromosomal Localization, and Functional Analysis of the Murine Estrogen Receptor B. Molecular Endocrinology 1997; 11(3) 353-65 11. Miller G. Divorcing estrogen,'s bright and dark sides. Science 2002: 298: 723-4 12. Phillip D. Zamore, Thomas Tuschl, Phillip A. Sharp. RNAi: Double-Stranded RNA Directs the ATP-Dependent Cleavage of mRNA at 21 to 23 Nucleotide Intervals. Cell 2000: 101: 25-33 13. Morita T, Yoshida K. RNAi provides a new tool for functional analyses of the mammalian genes Tanpakushitsu Kakusan Koso 2002 47(14): 1839-45 第6页 版本1.018.551
国家自然科学基金申请书 第 6 页 版本 1.018.551 受体亚型具有各自独特的转录激活区域，以及不同的组织分布，可能是靶组织对 E 呈现不同反应的 关键因素（10）。因此，药物对 PMO 的治疗作用与对生殖系统的副作用是可以区分的。最近合成的化 合物——Estren，可能通过激活 MAPK 途径，防治 PMO 而无刺激子宫内膜增生的作用，为实现这一 理想的疗效初步提供了可以借鉴的方法和途径（11） 。 RNAi（RNA干扰）技术通过双链RNA（dsRNA）引发转录后沉默，产生RNAi现象（12）。该技术具有 高度的序列专一性，可使特定基因不表达，比反义RNA技术和同源共抑制更有效，更容易产生功能丧 失或降低突变，目前已经成功地对上百种哺乳动物细胞目的基因进行功能分析，从而成为一种抑制 体细胞功能基因翻译表达的有效工具（13）。将药物作用下的优势ER亚型选择性地抑制表达，可有效地 分析ER介导药物作用的机制，国内外迄今未见利用此技术研究中药作用机制的报道。 参考文献 1. 王玉东，李大金：绝经后骨质疏松症发生的分子机制。 中华老年医学杂志 2003；22（3）：187 －8 2. 王文君，俞瑾, 王静：“更年春”对实验性原发性骨质疏松病理形态学的初步作察.上海医科大学 学报 2000；27（1）：54-6 3. 王文君，俞瑾,王静：中药“更年春”对大鼠实验性原发性骨质疏松的预防作用观察.上海中医药 杂志 2001;35(11):46-9 4. 李大金,李超荆,俞瑾等: 中药复方对更年期综合征妇女生殖内分泌免疫功能的调节. 上海免疫学 杂志 1995; 15(5):257-60 5. 王文君,俞谨, 李大金. 中药复方”更年春”对老年雌性大鼠脾细胞 ER 及 IL-2、TNF 活性的影响.生 殖与避孕 1996；16（4）：263-7 6. 廖二元.骨质疏松研究的现状与展望.中华内分泌代谢杂志 2002；18（2）：87-9. 7. Martin Enserink. The Vanishing Promises of Hormone Replacement. Science 2002; 297: 325-6. 8. 王玉东，李大金. 补肾宁心方对成骨细胞的增殖和抗凋亡作用. 中国中西医结合杂志 2004 (待发 表) 9. Fiore CE, Pennisi P, Tandurella FG, et al. Response of biochemical of bone turnover to estrogen treatment in post-menopausal women: evidence against an early anabolic effect on bone formation. J Endocrinol Invest 2001; 24(6): 423-9. 10. Gilles B. Tremblay1, André Tremblay1, Neal G. Copeland, et al. Cloning, Chromosomal Localization, and Functional Analysis of the Murine Estrogen Receptor ß. Molecular Endocrinology 1997; 11 (3): 353-65. 11. Miller G. Divorcing estrogen's bright and dark sides. Science 2002; 298:723-4. 12. Phillip D. Zamore, Thomas Tuschl, Phillip A. Sharp. RNAi: Double-Stranded RNA Directs the ATP-Dependent Cleavage of mRNA at 21 to 23 Nucleotide Intervals. Cell 2000; 101:25–33. 13. Morita T, Yoshida K. RNAi provides a new tool for functional analyses of the mammalian genes. Tanpakushitsu Kakusan Koso 2002;47(14):1839-45
国家自然科学基金申请书 2、项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键问题 【建立假设】 补肾宁心方能防治PMO而少见ERT样副作用。该方对老年大鼠外周血E水平无明显影响,但可 增强ER的表达,具有促进OB增殖和抗凋亡作用。因此,该方通过哪种ER亚型、介导何种信号转 导途径发挥选择性作用,是本题亟待解决的问题。 【研究目标】 (1)观察补肾宁心方对免疫内分泌、骨生化指标和芳香化酶活性的影响:比较该方对骨与子宫 作用的差异。 (2)体外培养OB,分析正常及药物血清作用下优势表达的ER亚型。 (3)建立优势ER亚型沉默表达的人0B细胞系(MG63)和人子宫内膜癌细胞系(HEC1-B),结合 抗ER亚型与抗AR(雄激素受体)单抗对信号传导途径的阻断作用,确定在骨及子宫内膜 中发挥重要作用的ER亚型及其信号转导途径 【研究内容】 (1)补肾宁心复方灌服PMo模型BALB/c小鼠12周,处死后取椎骨测定BD、形态计量、原位分 析OB凋亡,称量子宫湿重;制备药物血清,测定E2、脱氢表雄酮 (DHEA):取脾脏免疫活性 细胞分析Th/Th2型细胞因子的表达水平;取颅骨植块法培养,观察骨片融合时间、OB增 殖能力的变化 (2)透射电镜下观察左股骨的胶原纤维排列,OB形态及其细胞器的变化。取右股骨松质端和子 宫内膜制备微粒体,分析芳香化酶活性。取胫骨,提取总RNA,分析骨吸收抑制因子(OPG) 和优势表达的ER亚型。 3)取新生BALB/c小鼠颅骨酶解法培养B,体外模拟雌激素撤退现象,予以药物血淸局部干预, 观察优势表达的ER亚型及0B增殖能力的改变 (4)扫描优势ER亚型编码区基因中的A序列,据其皿RNA低二级结构的区域设计 SiRNA,用T7 体外转录 SIRNA,纯化并转染hG63和HC1-B细胞系,建立优势ER亚型沉默表达的细胞系, 分析该亚型缺失(或低表达)对pRK1/2(MAPK途径中磷酸化的细胞外信号调控激酶)的 【拟解决的关键问题】 (1)分析OB优势表达的ER亚型及其胞内信号转导途径,阐明中药复方治疗PMO的作用机制。 (2)通过比较补肾宁心方对不同组织的选择性作用,使有效治疗PM0而避免HRT样副作用成为 可能,从而深化中医药的药物归经理论 第7页 版本1.018.551
国家自然科学基金申请书 第 7 页 版本 1.018.551 2、 项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键问题。 【建立假设】 补肾宁心方能防治 PMO 而少见 ERT 样副作用。该方对老年大鼠外周血 E2水平无明显影响，但可 增强 ER 的表达，具有促进 OB 增殖和抗凋亡作用。因此，该方通过哪种 ER 亚型、介导何种信号转 导途径发挥选择性作用，是本题亟待解决的问题。 【研究目标】 （1） 观察补肾宁心方对免疫内分泌、骨生化指标和芳香化酶活性的影响；比较该方对骨与子宫 作用的差异。 （2） 体外培养 OB，分析正常及药物血清作用下优势表达的 ER 亚型。 （3） 建立优势 ER 亚型沉默表达的人 OB 细胞系（MG63）和人子宫内膜癌细胞系（HEC1-B），结合 抗 ER 亚型与抗 AR（雄激素受体）单抗对信号传导途径的阻断作用，确定在骨及子宫内膜 中发挥重要作用的 ER 亚型及其信号转导途径。 【研究内容】 （1） 补肾宁心复方灌服 PMO 模型 BALB/c 小鼠 12 周，处死后取椎骨测定 BMD、形态计量、原位分 析 OB 凋亡，称量子宫湿重；制备药物血清，测定 E2、脱氢表雄酮(DHEA)；取脾脏免疫活性 细胞分析 Th1/Th2 型细胞因子的表达水平；取颅骨植块法培养，观察骨片融合时间、OB 增 殖能力的变化。 （2） 透射电镜下观察左股骨的胶原纤维排列，OB 形态及其细胞器的变化。取右股骨松质端和子 宫内膜制备微粒体，分析芳香化酶活性。取胫骨，提取总 RNA，分析骨吸收抑制因子（OPG） 和优势表达的 ER 亚型。 （3） 取新生 BALB/c 小鼠颅骨酶解法培养 OB，体外模拟雌激素撤退现象，予以药物血清局部干预， 观察优势表达的 ER 亚型及 OB 增殖能力的改变。 （4） 扫描优势 ER 亚型编码区基因中的 AA 序列，据其 mRNA 低二级结构的区域设计 siRNA，用 T7 体外转录 siRNA，纯化并转染 hMG63 和 HEC1-B 细胞系，建立优势 ER 亚型沉默表达的细胞系， 分析该亚型缺失（或低表达）对 pERK1/2（MAPK 途径中磷酸化的细胞外信号调控激酶）的 影响。 【拟解决的关键问题】 （1） 分析 OB 优势表达的 ER 亚型及其胞内信号转导途径，阐明中药复方治疗 PMO 的作用机制。 （2） 通过比较补肾宁心方对不同组织的选择性作用，使有效治疗 PMO 而避免 HRT 样副作用成为 可能，从而深化中医药的药物归经理论
国家自然科学基金申请书 拟采取的研究方案及可行性分析 【研究方法】 (1)酶解与植块法培养原代0B,碱性磷酸酶(ALP)显色鉴定。 (2) ELISA分析小鼠免疫活性细胞表达的Th1/Th2型细胞因子水平。 3)流式细胞术(FCM)分析DNA周期和细胞凋亡,H掺入法分析0B增殖能力。 (4)HPLC(高效液相色谱)比较骨和子宫内膜中芳香化酶( aromatase)活性。 (5)免疫化学发光法测定内分泌激素水平,DEXA测量BMD,骨和子宫内膜的组织切片形态计量 (6)实时定量RT-PCR比较ER亚型, OPG mRNA的表达; immunoblotting分析pERK1/2表达 (7)透射电镜(TEM)观察体外及骨组织中0B形态及其细胞器的变化 (8) TUNEL法原位分析骨组织中OB的凋亡;PCNA免疫荧光组织分析OB细胞增殖潜能。 (9)RNAi技术建立优势ER亚型沉默表达的hG63和HEC1-B细胞系用于解析细胞内信号转导途 【技术路线】 (1)补肾宁心方对骨和子宫的选择性作用及对0B生物学功能的影响 雌性BALB/c小鼠(12-13月龄) 正常对照假手术对照 去势手术 (7天后) 生理盐水(等体积)生理盐水/E2/补肾宁心方 取血——制备药物血清,测定内分泌 脾脏——免疫活性细胞细胞因子表达水平 子宫——称量湿重,内膜组化分析腺体改变,制备微粒体 股骨——电镜观察OB细胞器变化,制备微粒体 胫骨——提取RNA,RT-PCR分析ER亚型表达 椎骨——测酬MD,骨形态计量,原位分析细胞凋亡,及PCNA分析细胞增殖潜能 颅骨 植块法培养,观察骨片融合时间;传1代,H掺入法分析细胞增殖,FCM分析DNA周期 第8页 版本1.018.551
国家自然科学基金申请书 第 8 页 版本 1.018.551 3、 拟采取的研究方案及可行性分析。 【研究方法】 （1） 酶解与植块法培养原代 OB，碱性磷酸酶（ALP）显色鉴定。 （2） ELISA 分析小鼠免疫活性细胞表达的 Th1/Th2 型细胞因子水平。 （3） 流式细胞术（FCM）分析 DNA 周期和细胞凋亡，3 H 掺入法分析 OB 增殖能力。 （4） HPLC（高效液相色谱）比较骨和子宫内膜中芳香化酶（aromatase）活性。 （5） 免疫化学发光法测定内分泌激素水平，DEXA 测量 BMD,骨和子宫内膜的组织切片形态计量。 （6） 实时定量 RT-PCR 比较 ER 亚型，OPG mRNA 的表达；immunoblotting 分析 pERK1/2 表达。 （7） 透射电镜（TEM）观察体外及骨组织中 OB 形态及其细胞器的变化。 （8） TUNEL 法原位分析骨组织中 OB 的凋亡；PCNA 免疫荧光组织分析 OB 细胞增殖潜能。 （9） RNAi 技术建立优势 ER 亚型沉默表达的 hMG63 和 HEC1-B 细胞系用于解析细胞内信号转导途 径。 【技术路线】 （1） 补肾宁心方对骨和子宫的选择性作用及对 OB 生物学功能的影响 雌性 BALB/c 小鼠（12-13 月龄） ↓ 正常对照 假手术对照 去势手术 （7 天后） ↓ ↓ 生理盐水（等体积） 生理盐水/E2/补肾宁心方 ↓ 取血——制备药物血清，测定内分泌 ↓ 脾脏——免疫活性细胞细胞因子表达水平 ↓ 子宫——称量湿重，内膜组化分析腺体改变，制备微粒体 ↓ 股骨——电镜观察 OB 细胞器变化，制备微粒体 ↓ 胫骨——提取 RNA，RT-PCR 分析 ER 亚型表达 ↓ 椎骨——测 BMD，骨形态计量，原位分析细胞凋亡，及 PCNA 分析细胞增殖潜能 ↓ 颅骨 ↓ 植块法培养，观察骨片融合时间；传 1 代，3 H 掺入法分析细胞增殖，FCM 分析 DNA 周期
国家自然科学基金申请书 (2)药物血清对0B优势ER亚型的调节 OB原代培养(酶消化法)、鉴定 确定细胞密度,模仿雌激素撤退现象 加入不同浓度的药物血清 电镜观察OB细胞器变化:FCM分析DNA细胞周期和细胞调亡 实时定量RT-PCR分析ERa/β、 Aromatase的mRNA变化, (3)介导0B及内膜癌细胞增殖的优势BR亚型及其胞内信号转导途径 建立优势ER亚型沉默表达的hMG63和HECl-B细胞系 加入不同浓度的药物血清或生理浓度的E2/DHEA 检测两种细胞的DNA周期和调亡;分析pERK1/2的表达 确定两种细胞优势表达的ER亚型及其介导的信号途径对细胞增殖的影响 【实验方案】 (1)绝经后骨质疏松症中医辨证 绝经前后妇女年近五旬,肾中精气渐衰。肾精不足则骨无以充,故骨骼酸楚疼痛;甚者,骨枯 而髓减,发为骨痿,并可见骨折。精血不足,肾水不能上济心火,则心火上炎。肾虚则气化不及 气血失调而产生痰瘀,痰瘀又可进一步加重肾虚,从而促进骨质疏松的产生。 治则:补肾壮骨,宁心泻 处方:生地18知母15补骨脂12仙灵脾12巴戟天12 枸杞子12酸枣仁9黄柏9 方解:生地、知母滋补肾阴,为君药。仙灵脾、巴戟天温补肾阳,补骨脂补肾活血,为臣药, 共助君药补肾益精,使得阴阳平衡。枸杞子滋肝以补肾,酸枣仁宁心安神,为佐药。黄柏泻相火, 以使水火相济;并能引诸药入肾经。全方以补肾为主,有坚肾壮骨髓之功。 版本1.018.551
国家自然科学基金申请书 第 9 页 版本 1.018.551 （2） 药物血清对 OB 优势 ER 亚型的调节 OB 原代培养（酶消化法）、鉴定 ↓ 确定细胞密度，模仿雌激素撤退现象 ↓ 加入不同浓度的药物血清 ↓ 电镜观察 OB 细胞器变化；FCM 分析 DNA 细胞周期和细胞调亡 ↓ 实时定量 RT-PCR 分析 ERα/β、Aromatase 的 mRNA 变化， （3）介导 OB 及内膜癌细胞增殖的优势 ER 亚型及其胞内信号转导途径 建立优势 ER 亚型沉默表达的 hMG63 和 HEC1-B 细胞系 ↓ 加入不同浓度的药物血清或生理浓度的 E2/DHEA ↓ 检测两种细胞的 DNA 周期和调亡；分析 pERK1/2 的表达 ↓ 确定两种细胞优势表达的 ER 亚型及其介导的信号途径对细胞增殖的影响 【实验方案】 （1） 绝经后骨质疏松症中医辨证： 绝经前后妇女年近五旬，肾中精气渐衰。肾精不足则骨无以充，故骨骼酸楚疼痛；甚者，骨枯 而髓减，发为骨痿，并可见骨折。精血不足，肾水不能上济心火，则心火上炎。肾虚则气化不及， 气血失调而产生痰瘀，痰瘀又可进一步加重肾虚，从而促进骨质疏松的产生。 治则：补肾壮骨，宁心泻火。 处方：生地 18 知母 15 补骨脂 12 仙灵脾 12 巴戟天 12 枸杞子 12 酸枣仁 9 黄柏 9 方解：生地、知母滋补肾阴，为君药。仙灵脾、巴戟天温补肾阳，补骨脂补肾活血，为臣药， 共助君药补肾益精，使得阴阳平衡。枸杞子滋肝以补肾，酸枣仁宁心安神，为佐药。黄柏泻相火， 以使水火相济；并能引诸药入肾经。全方以补肾为主，有坚肾壮骨髓之功
国家自然科学基金申请书 (2)PM0模型的建立与实验分组 12-13月龄雌性BALB/c小鼠 氯胺酮麻醉(100mg/kg),经背部入腹切除双侧卵巢 术后7天,分组(每组10只)并灌服等体积(1m1/天)液体 0VX+(补肾宁心方/E2/生理盐水)组/假手术组/正常组 灌药6周后,从0VX盐水组、正常组、假手术组各随机取2只小鼠的股骨和腰椎 进行病理切片观察,确定PM模型的建立,排除手术的影响。 液体灌胃12周,处死后分别取血、脾脏、子宫和骨 (3)补肾宁心方对骨和子宫内膜芳香化酶活性的调节 补肾宁心方组/E2组 组 分别取子宫内膜和股骨干骺端,匀浆,制备微粒体 (离心:1000g×20min→10000g×20min→105000g×120min) 构建反应体系1m1:50-100μMPBs;0.2-2mg/m微粒体总蛋白 底物:DHEA 加入1 mM NADPH(开始计时),37℃,约10-15min:70%高氯酸 75-100μ1终止反应,迅速涡旋混匀,冰浴冷却 高速离心20000g×20min,4℃ C18反相HPLC分析(粒径5μm,4.6mi.d.×25cm),流动相为乙腈/水 (40:60,V/V)lml/min,柱温40℃,进样量5-20μ1,紫外检测波长254nm 分析产物生成速率,比较芳香化酶的活性 第10页 版本1.018.551
国家自然科学基金申请书 第 10 页 版本 1.018.551 （2） PMO 模型的建立与实验分组 12-13 月龄雌性 BALB/c 小鼠 ↓ 氯胺酮麻醉（100mg/kg），经背部入腹切除双侧卵巢 ↓ 术后 7 天，分组（每组 10 只）并灌服等体积（1ml/天）液体 OVX+（补肾宁心方/E2/生理盐水）组/ 假手术组/ 正常组 ↓ 灌药 6 周后，从 OVX+盐水组、正常组、假手术组各随机取 2 只小鼠的股骨和腰椎 进行病理切片观察，确定 PMO 模型的建立，排除手术的影响。 ↓ 液体灌胃 12 周，处死后分别取血、脾脏、子宫和骨 （3） 补肾宁心方对骨和子宫内膜芳香化酶活性的调节 补肾宁心方组/ E2 组/ 盐水组 ↓ 分别取子宫内膜和股骨干骺端，匀浆，制备微粒体 （离心：1000g×20min→10000g×20min→105000g×120min） ↓ 构建反应体系 1ml：50-100μM PBS;0.2-2mg/ml 微粒体总蛋白 底物：DHEA ↓ 加入 1mM NADPH（开始计时），37℃，约 10-15min；70%高氯酸 75-100μl 终止反应，迅速涡旋混匀，冰浴冷却。 ↓ 高速离心 20000g ×20min，4℃ ↓ C18 反相 HPLC 分析（粒径 5μm,4.6mm i.d. ×25 ㎝），流动相为乙腈/水 （40：60，V/V）1ml/min，柱温 40℃，进样量 5-20μl, 紫外检测波长 254nm ↓ 分析产物生成速率，比较芳香化酶的活性
