申请代码 C03050402 受理部门 收件日期 受理编 解除保护 国家自然科学基金 申请书 资助类别:面上项目 亚类说明:自由申请项目 附注说明 项目名称:岀血性血小板病凝血酶受体研究及益气活血方的治疗作用 申请者:沈霖 电话:027-85726395 依托单位:华中科技大学 通讯地址:湖北省武汉市航空路13号 邮政编码:430030 单位电话:027-87543437 电子邮件:shenIinhb@yahoo.com.cn 申报日期 2005年2月21日 国家自然科学基金委员会
申请代码： C03050402 受理部门： 收件日期： 受理编号： 解除保护 国家自然科学基金 申 请 书 资助类别：面上项目 亚类说明：自由申请项目 附注说明： 项目名称：出血性血小板病凝血酶受体研究及益气活血方的治疗作用 申 请 者：沈霖 电话： 027－85726395 依托单位：华中科技大学 通讯地址：湖北省武汉市航空路 13 号 邮政编码：430030 单位电话：027-87543437 电子邮件：shenlinhb@yahoo.com.cn 申报日期： 2005年2月21日 国家自然科学基金委员会
国家自然科学基金申请 基本信息 名/沈霖 性别男年月952年12月民族汉族 申请者 位学士 职称教授 主要研究领域|中西医结合临床基础 研究 话027-85726395 电子邮件|shenlinhbeyahod.com.cn 信传真 个人网页无 息工作单位华中科技大学/同济医学院 在研项目批准号 名 称|华中科技大学 代码43007402 单 联系人张婷姣 电子邮件|kjcjcb@hust.edu.cn 话|027-87543437 网站地址www.husteducn 单位名称 代码 单[在此录入修改 位 信「[在此录入修改 项目名称 出血性血小板病凝血酶受体研究及益气活血方的治疗作用 项目基本 资助类别面上项目 亚类说明自由申请项目 附注说明 03050402:中西医结合临床基 申请代码础研究 信基地类别 息预计研究年限200年1月-2008年12月研究属性|应用基础研究 申请经费26.0000万元 项目研究内容和意义简介(限400字):出血性血小板病是以反复发作性皮肤粘膜出血、月 经过多、鼻衄或眼底、球结膜出血为主症,血小板计数正常,但血小板聚集功能存在缺陷 摘|的出血性疾病。其发病因未明,西医药疗效不甚理想。理论上任何途径的血小板聚集过程 都涉及血小板活化,最终归之于血小板膜糖蛋白(GP)Ⅲb/Ⅲa复合物。凝血酶在其中占 有重要地位。凝血酶是最强的血小板活化剂。其活化血小板主要是通过一个G蛋白偶联七 个穿膜区受体和GPIb-Ⅺ-V两种途径。新近发现人类血小板表达的PAR1和PAR4受体,激 活其中任何一种,都可以诱导血小板活化。本项目拟采用单克隆抗体、流式细胞仪及分子 要生物学技术,在受体及分子水平上研究出血性血小板病凝血酶受体功能与活性,以探讨该 病的发病机理;在此基础上,运用益气活血方治疗,并重点观察中药对凝血酶受体的影响 为中医药治疗受体性疾病提供临床及理论依据。 关键词(用分号分开,最多5个)出血性血小板病:凝血酶受体;益气活血方 第2页 版本1003.094
国家自然科学基金申请书 第 2 页 版本 1.003.094 基本信息 wpPIYr6r/9B 姓 名 沈霖 性别 男 出生 年月 1952 年 12 月 民 族 汉族 学 位 学士 职称 教授 主要研究领域 中西医结合临床基础 研究 电 话 027－85726395 电子邮件 shenlinhb@yahoo.com.cn 传 真 个 人 网 页 无 工 作 单 位 华中科技大学 /同济医学院 申 请 者 信 息 在研项目批准号 名 称 华中科技大学 代 码 43007402 联 系 人 张婷姣 电子邮件 kjcjcb@hust.edu.cn 依托单位信息 电 话 027-87543437 网站地址 www.hust.edu.cn 单 位 名 称 代 码 [在此录入修改] 合作单位信息 [在此录入修改] 项目名称 出血性血小板病凝血酶受体研究及益气活血方的治疗作用 资助类别 面上项目 亚类说明 自由申请项目 附注说明 申请代码 C03050402:中西医结合临床基 础研究 基地类别 预计研究年限 2006 年 1 月 — 2008 年 12 月 研究属性 应用基础研究 项 目 基 本 信 息 申请经费 26.0000 万元 摘 要 项目研究内容和意义简介（限 400 字）：出血性血小板病是以反复发作性皮肤粘膜出血、月 经过多、鼻衄或眼底、球结膜出血为主症，血小板计数正常，但血小板聚集功能存在缺陷 的出血性疾病。其发病因未明，西医药疗效不甚理想。理论上任何途径的血小板聚集过程 都涉及血小板活化，最终归之于血小板膜糖蛋白（GP）Ⅱb／Ⅲa 复合物。凝血酶在其中占 有重要地位。凝血酶是最强的血小板活化剂。其活化血小板主要是通过一个 G 蛋白偶联七 个穿膜区受体和 GPⅠb-Ⅺ-Ⅴ两种途径。新近发现人类血小板表达的 PARl 和 PAR4 受体，激 活其中任何一种，都可以诱导血小板活化。本项目拟采用单克隆抗体、流式细胞仪及分子 生物学技术，在受体及分子水平上研究出血性血小板病凝血酶受体功能与活性，以探讨该 病的发病机理；在此基础上，运用益气活血方治疗，并重点观察中药对凝血酶受体的影响， 为中医药治疗受体性疾病提供临床及理论依据。 关 键 词(用分号分开，最多 5 个) 出血性血小板病；凝血酶受体；益气活血方
国家自然科学基金申讠 项目组主要成员(国家杰出青年科学基金不填此栏) 编号姓名 出生年月性别职称学位 单位名称 电话 电子邮件 项目分工作时间 (月) 19271男教授其他华中科技大学 0278572913shendiwh/@yahoo.com.cn指导研究|6 1957-12-31女教授博士华中科技大学 027-8572682 mz1988@yahoo.com 凝血酶受体 3 196121女主治医师博士华中科技大学 0285259Ilileilei2l@yahoo.com.cn/RT-PCR技术 谢晶 1965312男副教授博士华中科技大学 027-8572639 Jingxieg@hotmail.com 流式细胞仪 5网不球c3男助理研究硕士华中科技大学 027-8572682 中|8 杨艳萍 19626-29女副教授学士华中科技大学 027-8572639 Yanpingyang@ yahooco血小板膜糖 戴燚 19713男博士生|硕士华中科技大学 027-8572682| daiyifreeman'9401@cn.免疫印迹实 com 19781123男|博土生硕士华中科技大学 02785282|yuanjunxia/@yahoo.com血小板活化 9|【在此录入修改 总人数 高级 中级 博士后 博士生 硕士生 说明:1.高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生人员数由申请者负责填报,总人数自动生成。 2.项目组主要成员不包括项目申请者 版本1003094
国家自然科学基金申请书 第 3 页 版本 1.003.094 项目组主要成员(国家杰出青年科学基金不填此栏) 编号 姓 名 出生年月 性别 职 称 学 位 单位名称 电话 电子邮件 项目分工 每年工 作时间 （月） 1 沈迪 1922-7-1 男 教授 其他 华中科技大学 027-8572913 9 shendiwh@yahoo.com.cn 指导研究 6 2 朱闽 1957-12-31 女 教授 博士 华中科技大学 027-8572682 3 mz1988@yahoo.com 凝血酶受体 检测 4 3 李蕾 1966-1-21 女 主治医师 博士 华中科技大学 027-8572639 5 lileilei21@yahoo.com.cn RT-PCR技术 测定 6 4 谢晶 1965-3-12 男 副教授 博士 华中科技大学 027-8572639 5 Jingxie9@hotmail.com 流式细胞仪 检测 6 5 周丕琪 1968-1-3 男 助理研究 员 硕士 华中科技大学 027-8572682 3 zhoupiqi@yahoo.com.cn 免疫印迹实 验 8 6 杨艳萍 1962-6-29 女 副教授 学士 华中科技大学 027-8572639 5 Yanpingyang@yahoo.co m.cn 血小板膜糖 蛋白试验 8 7 戴燚 1977-11-3 男 博士生 硕士 华中科技大学 027-8572682 3 daiyifreeman9401@21cn. com 免疫印迹实 验 8 8 夏远军 1978-11-23 男 博士生 硕士 华中科技大学 027-8572682 3 yuanjunxia@yahoo.com. cn 血小板活化 实验 8 9 [在此录入修改] 总人数 高级 中级 初级 博士后 博士生 硕士生 9 5 2 2 说明: 1. 高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生人员数由申请者负责填报，总人数自动生成。 说明: 2. 项目组主要成员不包括项目申请者
国家自然科学基金申请书 经费申请表 (金额单位:万元) 科目 申请经费 备注(计算依据与说明) 研究经费 以下严格按“国家自然科学基金经费管理办法”执 23.7500 1.科研业务费 3.3000 (1)测试/计算/分析费 1.5000血小板聚集、流式细胞仪、血小板活化试验检测 (2)能源/动力费 0.5000水电费 (3)会议费/差旅费 0.8000重要学术会议支出 (4)出版物/文献/信息传播费 0.5000文献查询、论文版面费和印刷费 (5)其它 0.0000 2.实验材料费 18.4500 (1)原材料/试剂/药品购置费 18.0000 单克隆抗体,各种荧光与酶标二抗,PVDF膜:ECL 显色试剂盒:中药材及制剂 (2)其它 0.4500购买实验耗材 3.仪器设备费 1.0000 (1)购置 0.0000 (2)试制 1.000制备实验标本 4.实验室改装费 0.0000 5.协作费 1.0000 实验标本收集;化验室进行血小板计数、出、凝血 时间等常规检测协作费 国际合作与交流费 0.0000 1.项目组成员出国合作交流 0.0000 2.境外专家来华合作交流 0.0000 三.劳务费 1.0000究生及博士后人员科研劳务费 四管理费 1.2500按申请金额5%计算 合计 26.0000 国家其他计划资助经费 与本项目相关的 其他经费来源 其他经费资助(含部门匹配) 其他经费来源合计 0.0000 版本1003.094
国家自然科学基金申请书 第 4 页 版本 1.003.094 经费申请表 （金额单位：万元） 科目 申请经费 备注（计算依据与说明） 一.研究经费 23.7500 以下严格按“国家自然科学基金经费管理办法”执 行 1.科研业务费 3.3000 （1）测试/计算/分析费 1.5000 血小板聚集、流式细胞仪、血小板活化试验检测 （2）能源/动力费 0.5000 水电费 （3）会议费/差旅费 0.8000 重要学术会议支出 （4）出版物/文献/信息传播费 0.5000 文献查询、论文版面费和印刷费 （5）其它 0.0000 2.实验材料费 18.4500 （1）原材料/试剂/药品购置费 18.0000 单克隆抗体，各种荧光与酶标二抗，PVDF 膜；ECL 显色试剂盒；中药材及制剂 （2）其它 0.4500 购买实验耗材 3.仪器设备费 1.0000 （1）购置 0.0000 （2）试制 1.0000 制备实验标本 4.实验室改装费 0.0000 5.协作费 1.0000 实验标本收集；化验室进行血小板计数、出、凝血 时间等常规检测协作费 二.国际合作与交流费 0.0000 1.项目组成员出国合作交流 0.0000 2.境外专家来华合作交流 0.0000 三.劳务费 1.0000 研究生及博士后人员科研劳务费 四.管理费 1.2500 按申请金额 5％计算 合 计 26.0000 国家其他计划资助经费 其他经费资助（含部门匹配） 与本项目相关的 其他经费来源 其他经费来源合计 0.0000
国家自然科学基金申请书 查看报告正文撰写提纲 报告正文 )立项依据与研究内容(40008000字) 1.项目的立项依据 出血性血小板病是一组反复发作性出血性疾病。患者常有轻重不等的肢体瘀斑,月 经过多,鼻衄,齿龈出血或眼底、球结膜等出血倾向,血小板计数、血小板形态、出凝 血时间及凝血象均属正常,且除外其它原因所致的出血,但血小板聚集功能存在缺陷。 在本病的发病原因及治疗方面虽有不少论点,但其确切的发病机制至今未明;西医药用 强的松、氨肽素、安络血及维生素C、P等治疗,疗效也不甚理想。 关于皮肤粘膜出血和月经过多症状与血小板聚集功能缺陷的关系,是我们在临床上 研究类似出血性疾病时所见到的。早在1984年,同济医科大学沈迪等人发现一组血小板 计数正常而对刺参粘多糖诱导的血小板聚集反应明显减低或缺如的皮肤粘膜出血或伴 月经过多患者,当时称为“新型血小板聚集功能缺陷症”,并经国内部分血液学家的复 制和证实。然而其中有些出血者的血小板被腺苷二磷酸(ADP)、花生四烯酸(AA)、 血小板活化因子(PAF)、肾上腺素和胶原等诱导,也可出现血小板聚集缺陷,其缺陷 率在752例中约占316%,称为“未明原因血小板病”。这两组出血性血小板病的研究 均曾受国家自然科学基金的资助(编号3870716和39370322),研究结果共发表论文40 余篇,他人重复试验和证实的发表论文37篇。 90年代初,在湖北省卫生厅资助下,研究组开始运用中医药辩证治疗本病。本病的 出血症状属中医“血证”。在临床辩证中,发现上述两种血小板病患者中有“气虚”者 占78.1%,提示该病中医病机多属“气不摄血证”。根据中医“活血止血”的理论,经 体外筛选及临床摸索,自拟益气活血方治疗本病。方中黄芪、党参益气,当归活血补血 黄芪、当归含有当归补血汤之意。赤芍、桃仁活血化瘀,甘草和中。经临床验证467 例,中药组在控制出血,改善气虚症状,对血小板聚集缺陷的纠正及停药1年后复发率 等疗效方面均明显优于西药氨肽素、安络血、维生素C、P对照组。但其确切的药理作 用有待深入研究 第5页 版本1003.094
国家自然科学基金申请书 第 5 页 版本 1.003.094 查看报告正文撰写提纲 报告正文 （一）立项依据与研究内容 （4000-8000 字）： 1. 项目的立项依据 出血性血小板病是一组反复发作性出血性疾病。患者常有轻重不等的肢体瘀斑，月 经过多，鼻衄，齿龈出血或眼底、球结膜等出血倾向，血小板计数、血小板形态、出凝 血时间及凝血象均属正常，且除外其它原因所致的出血，但血小板聚集功能存在缺陷。 在本病的发病原因及治疗方面虽有不少论点，但其确切的发病机制至今未明；西医药用 强的松、氨肽素、安络血及维生素 C、P 等治疗，疗效也不甚理想。 关于皮肤粘膜出血和月经过多症状与血小板聚集功能缺陷的关系，是我们在临床上 研究类似出血性疾病时所见到的。早在 1984 年,同济医科大学沈迪等人发现一组血小板 计数正常而对刺参粘多糖诱导的血小板聚集反应明显减低或缺如的皮肤粘膜出血或伴 月经过多患者，当时称为“新型血小板聚集功能缺陷症”，并经国内部分血液学家的复 制和证实。然而其中有些出血者的血小板被腺苷二磷酸（ADP）、花生四烯酸（AA）、 血小板活化因子（PAF）、肾上腺素和胶原等诱导，也可出现血小板聚集缺陷，其缺陷 率在 752 例中约占 31.6%，称为“未明原因血小板病”。这两组出血性血小板病的研究 均曾受国家自然科学基金的资助（编号 3870716 和 39370322），研究结果共发表论文 40 余篇，他人重复试验和证实的发表论文 37 篇。 90 年代初，在湖北省卫生厅资助下，研究组开始运用中医药辩证治疗本病。本病的 出血症状属中医“血证”。在临床辩证中，发现上述两种血小板病患者中有“气虚”者 占 78.1%，提示该病中医病机多属“气不摄血证”。根据中医“活血止血”的理论，经 体外筛选及临床摸索，自拟益气活血方治疗本病。方中黄芪、党参益气，当归活血补血， 黄芪、当归含有当归补血汤之意。赤芍、桃仁活血化瘀，甘草和中。经临床验证 467 例，中药组在控制出血，改善气虚症状，对血小板聚集缺陷的纠正及停药 1 年后复发率 等疗效方面均明显优于西药氨肽素、安络血、维生素 C、P 对照组。但其确切的药理作 用有待深入研究
国家自然科学基金申请书 202年本项研究继续获得国家自然科学基金资助(项目批准号30171194),重点 研究了出血性血小板病膜糖蛋白受体变化及中药对其的影响。归纳研究的重点内容: ELSA检测膜糖蛋白( Membrane Glycoprateins,GP)Ⅱb、Ⅲa含量减低,洗涤血小板 后又可恢复正常范围;流式细胞术测GPIb/ⅨX、GPIb/Ia、GPIb、GPIa及p-选择 素表达荧光强度均低于正常人(P005)而明显优于西药组(P<005)。提示益气 活血方在受体蛋白水平上调节血小板膜糖蛋白的表达是其治疗出血性血小板病的疗效 机理之一。值得指出的是,由于GPIb为血小板高亲和力凝血酶受体,而我们的研究 发现出血性血小板病患者GPIb低下,这就进一步启迪我们,该病发病机理可能与凝 血酶受体异常有关。 凝血酶是一个多功能血浆丝氨酸蛋白酶,它能活化血小板使之发生聚集。GPIb/Ⅸ Ⅴ复合物是血小板表面的重要膜糖蛋白,能与凝血酶结合,在血小板粘附及聚集过程 中起重要作用,长期以来被普遍认为是凝血酶受体。GPIb/Ⅸ/V包括4种成分:GP Iba、GPIbβ、GPⅨ、GPV。很多资料表明,凝血酶高亲和力结合位点于GPIb a,GPⅤ对凝血酶高亲和力结合位点形成有重要作用。近年来研究发现血小板表面还 存在一类重要的凝血酶受体,即PARs( protease-activated receptors),凝血酶的细胞反应 可部分地通过这一个G蛋白偶连受体的小家族介导进行信号传递,这一家族包括PARl PAR2、PAR3与PAR4四大成员。通常凝血酶反应由一个以上PARs受体介导,切割其 特定位点暴露新的氨基末端,从而形成一个固定配基与受体进行分子内结合,影响跨膜 信号传导。人类血小板表达PAR与PAR4受体,它们都能与G12/13、Gq家族偶连,并 通过分泌ADP引起P2Y12受体活化而间接激活Gi信号途径,引起血小板聚集、释放 以及膜糖蛋白的一系列改变。PARI具有高亲和力,低浓度凝血酶即诱导其活化,产生 快速、强劲的血小板反应。PAR4则亲和力较低,作用弱于PARl,由高浓度凝血酶活化, 可以成为PAR途径的补充。 PARs受体的研究在国内尚刚起步,而国际上正成为热点 因此进行凝血酶与血小板相互作用的研究,对于深刻了解出血性疾病的发病机制的机理 非常重要 本项目根据我们十余年来对出血性血小板病研究的初步结果及中医药治疗的疗效, 第6页 版本1003.094
国家自然科学基金申请书 第 6 页 版本 1.003.094 2002 年本项研究继续获得国家自然科学基金资助（项目批准号 30171194），重点 研究了出血性血小板病膜糖蛋白受体变化及中药对其的影响。归纳研究的重点内容： ELISA 检测膜糖蛋白（ Membrane Glycoprateins，GP）Ⅱb、Ⅲa 含量减低，洗涤血小板 后又可恢复正常范围；流式细胞术测 GPⅠb/Ⅸ、GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb、GPⅢa 及 p-选择 素表达荧光强度均低于正常人（P0.05）而明显优于西药组（P<0.05）。提示益气 活血方在受体蛋白水平上调节血小板膜糖蛋白的表达是其治疗出血性血小板病的疗效 机理之一。值得指出的是，由于 GPⅠb 为血小板高亲和力凝血酶受体，而我们的研究 发现出血性血小板病患者 GPⅠb 低下，这就进一步启迪我们，该病发病机理可能与凝 血酶受体异常有关。 凝血酶是一个多功能血浆丝氨酸蛋白酶，它能活化血小板使之发生聚集。GPⅠb/ Ⅸ / Ⅴ复合物是血小板表面的重要膜糖蛋白，能与凝血酶结合，在血小板粘附及聚集过程 中起重要作用，长期以来被普遍认为是凝血酶受体。GPⅠb/ Ⅸ/ Ⅴ包括 4 种成分：GP Ⅰbα、GPⅠbβ、GP Ⅸ、GPⅤ。很多资料表明，凝血酶高亲和力结合位点于 GPⅠb α，GPⅤ对凝血酶高亲和力结合位点形成有重要作用。近年来研究发现血小板表面还 存在一类重要的凝血酶受体，即 PARs (protease-activated receptors)，凝血酶的细胞反应 可部分地通过这一个 G 蛋白偶连受体的小家族介导进行信号传递，这一家族包括 PARl、 PAR2、PAR3 与 PAR4 四大成员。通常凝血酶反应由一个以上 PARs 受体介导，切割其 特定位点暴露新的氨基末端，从而形成一个固定配基与受体进行分子内结合，影响跨膜 信号传导。人类血小板表达 PARl 与 PAR4 受体，它们都能与 G12/13、Gq 家族偶连，并 通过分泌 ADP 引起 P2Y12 受体活化而间接激活 Gi 信号途径，引起血小板聚集、释放 以及膜糖蛋白的一系列改变。PARl 具有高亲和力，低浓度凝血酶即诱导其活化，产生 快速、强劲的血小板反应。PAR4 则亲和力较低，作用弱于 PARl，由高浓度凝血酶活化， 可以成为 PARl 途径的补充。PARs 受体的研究在国内尚刚起步，而国际上正成为热点。 因此进行凝血酶与血小板相互作用的研究，对于深刻了解出血性疾病的发病机制的机理 非常重要。 本项目根据我们十余年来对出血性血小板病研究的初步结果及中医药治疗的疗效
国家自然科学基金申请 结合国内、外专家理论,认为不论何种诱导剂引起血小板聚集反应的途径如何,其前提 是血小板活化,凝血酶是最强的血小板活化剂,其可以调节血小板聚集、释放与内皮细 胞活化。因此研究血小板表面凝血酶受体功能对于出血与止血研究至关重要。而我们所 见的病例中多有GPIb-I复合物含量减低的,故初步推想这类出血性疾病可能是一组凝 血酶受体功能异常所致。而益气活血中药治疗该病的疗效机理之一,可能与调节凝血酶 受体存在一定关联。因此本课题拟用相应的单克隆抗体,流式细胞术及分子生物学等现 代新技术,研究本病中药治疗前后血小板活化过程的形态改变、聚集以及凝血酶受体的 动态变化过程,并分析这些活化过程中细胞骨架蛋白的改变,拟进一步从分子和受体水 平丰富出血性血小板病的病理实质及中药治疗的疗效机理。 主要参考文献 1. Shen di, Wei Wenning, Wang Ailian;etal. A new variant of沈迪,魏文宁,王辨明,等.一组 新型血小板聚集功能缺陷的初步研究.中华内科杂志.1984,23(11):669-670 2.沈迪,朱闽,王爱莲,等未明原因多部位出血者血小板聚集功能的硏究.血栓与止血学杂 1996,3(4):145-146 3.沈迪,沈霖,王爱莲,等脾不统血证146例血小板聚集功能的硏究.中国中西医结合消化杂 志,2001,9(2):68-70 4.沈迪,沈霖,王爱莲,等.消瘀片治疗新型血小板聚集功能缺陷的临床硏究中国中西医结合 杂志1994,14(10):589-591 5. Shen Di, Shen Lin, Wang A L, et al. Clinical observation on effect of Xiaoyu Zhixue tablet on 104 patients with idiopathic multifocal bleeding and platelet aggregation defect. CJIM. 1998, 4(4): 247-250 6. Shen Lin, Shen Lin, Gao Lan, et al. Effect of Xiaoyu Zhixue tablet on expression of platelet membrane glycoproteins in patients with hemorrhageic thrombopathy. CJIM. 2004, 10(3): 170-174 7.沈霖,沈迪,杨胜兰,等.健脾益气活血方治疗脾不统血併血小板聚集缺陷症疗效观察.中国 中西医结合消化杂志.2005,13(2):80-82 8. Soslau G, Class R, Morgan DA, et al. Unique pathway of thrombin-induced platelet aggregation mediated by glycoprotein Ib. J Biol Chem, 2001, 276: 21173-83 9. Skip Brass. Platelets and proteases. Nature. 2001, 413: 26-7 10.Sambrano GR, Weiss E I, Zheng YW et al. Role of thrombin signaling in platelets in haemostasis and thrombosis. Nature, 2001, 413: 74-8 11. Coughlin SR. Thrombin signaling and protease-activated receptors Nature. 2001 407: 258-64 12. Chung AWY, Jurasz Paul, Hollenberg MD, et al. Mechanisms of action of proteinase activated receptor agonists on humanplatelets. Br. J. Pharmacol, 2002, 135: 1123-32 13. Kim S, Foster C, Lecchi A, et al. Protease activated receptors l and 4 do not stimulate Gi signaling pathways in the absence of secreted ADP and cause human platelet aggregation independently of gi ignaling. Blood, 2002, 99: 3629-36 第7页 版本1003.094
国家自然科学基金申请书 第 7 页 版本 1.003.094 结合国内、外专家理论，认为不论何种诱导剂引起血小板聚集反应的途径如何，其前提 是血小板活化，凝血酶是最强的血小板活化剂，其可以调节血小板聚集、释放与内皮细 胞活化。因此研究血小板表面凝血酶受体功能对于出血与止血研究至关重要。而我们所 见的病例中多有 GPIb-I 复合物含量减低的，故初步推想这类出血性疾病可能是一组凝 血酶受体功能异常所致。而益气活血中药治疗该病的疗效机理之一，可能与调节凝血酶 受体存在一定关联。因此本课题拟用相应的单克隆抗体，流式细胞术及分子生物学等现 代新技术，研究本病中药治疗前后血小板活化过程的形态改变、聚集以及凝血酶受体的 动态变化过程，并分析这些活化过程中细胞骨架蛋白的改变，拟进一步从分子和受体水 平丰富出血性血小板病的病理实质及中药治疗的疗效机理。 主要参考文献 1. Shen Di, Wei Wenning , Wang Ailian,et al. A new variant of 沈迪，魏文宁，王辨明，等.一组 新型血小板聚集功能缺陷的初步研究. 中华内科杂志.1984，23（11）：669-670 2 . 沈迪，朱闽，王爱莲，等.未明原因多部位出血者血小板聚集功能的研究. 血栓与止血学杂 志.1996，3（4）：145-146 3. 沈迪，沈霖，王爱莲，等.脾不统血证 146 例血小板聚集功能的研究. 中国中西医结合消化杂 志，2001，9（2）：68-70 4. 沈迪，沈霖，王爱莲，等.消瘀片治疗新型血小板聚集功能缺陷的临床研究.中国中西医结合 杂志.1994,14(10):589-591 5. Shen Di, Shen Lin,Wang A L,et al. Clinical observation on effect of Xiaoyu Zhixue tablet on 104 patients with idiopathic multifocal bleeding and platelet aggregation defect.CJIM.1998,4(4):247-250 6. Shen Lin, Shen Lin, Gao Lan, et al. Effect of Xiaoyu Zhixue tablet on expression of platelet membrane glycoproteins in patients with hemorrhageic thrombopathy. CJIM.2004, 10(3):170-174 7. 沈霖，沈迪，杨胜兰，等. 健脾益气活血方治疗脾不统血併血小板聚集缺陷症疗效观察. 中国 中西医结合消化杂志. 2005，13（2）:80-82 8. Soslau G，Class R，Morgan DA，et a1．Unique pathway of thrombin-induced platelet aggregation mediated by glycoprotein lb. J Biol Chem，2001，276：21173-83 9. Skip Brass．Platelets and proteases．Nature．2001，413：26-7 10.Sambrano GR，Weiss E 了，Zheng YW et a1．Role of thrombin signaling in platelets in haemostasis and thrombosis．Nature，2001，413：74-8 11. Coughlin SR．Thrombin signaling and protease- activated receptors Nature．2001 407：258-64． 12.Chung AWY，Jurasz Paul，Hollenberg MD，et a1．Mechanisms of action of proteinase activated receptor agonists on humanplatelets．Br．J．Pharmacol，2002，135：1123-32． 13. Kim S，Foster C，Lecchi A，et a1．Protease activated receptors 1 and 4 do not stimulate Gi signaling pathways in the absence of secreted ADP and cause human platelet aggregation independently of Gi signaling. Blood，2002，99：3629-36
国家自然科学基金申请书 2.项目的研究内容、研究目标以及拟解决的关键问题 2.1研究内容 (1)出血性血小板病的凝血酶受体研究: ①受体水平 A:出血性血小板病的GPIb-XV、GPba蛋白的表达及功能部位; B:出血性血小板病的PARI、PAR4的表达及功能部位。 C:在此基础上,研究患者血小板被PAR1、PAR4活化肽刺激过程中细胞骨架蛋白成 分肌球蛋白、肌动蛋白、肌动连接蛋白以及 GPIb a水平的动态变化,了解本病发病过 程中两类凝血酶受体对血小板活化的影响程度与途径,以揭示本病皮肤粘膜出血的部 分机制。 ②分子水平 对明显异常者,进行相应受体蛋白基因检测等后续分子生物学研究。包括出血性 血小板病的血小板 GPIb a、PARI、PAR4、mRNA的表达;出血性血小板病的血小 板GPba、PARⅠPAR4的转录水平 (2)益气活血方对出血性血小板病膜凝血酶受体的影响。 重点观察治疗前后患者GPIb-IX-V、 GPIb a蛋白的表达变化以及细胞骨架蛋白的 变化,以部分阐明中药治疗的疗效机理。 2.2研究目标 研究出血性血小板病的凝血酶受体的功能与活性等,拟从分子和受体水平探索该病 的发病机理,在此基础上运用益气活血方治疗,并重点观察中药对凝血酶受体的影响, 为中药治疗“受体性疾病”提供临床和理论依据 2.3拟解决的关键问题 (1)拟解决凝血酶受体的改变与出血性血小板病的发病关系。尤其是该病患者的凝血 酶受体是功能异常或是分子结构异常 (2)拟解决中药治疗本病的作用环节,是否与调节凝血酶受体的功能有关 3、拟采取的研究方案及可行性分析 3.1研究方案 (1)病例选择:临床上选择符合出血性血小板病诊断标准患者及对照者,分为4组: ①出血伴血小板聚集缺陷组 第8页 版本1003.094
国家自然科学基金申请书 第 8 页 版本 1.003.094 2. 项目的研究内容、研究目标以及拟解决的关键问题 2.1 研究内容 （1）出血性血小板病的凝血酶受体研究： ① 受体水平 ： A：出血性血小板病的 GPIb-IX-Ⅴ、GPIbα蛋白的表达及功能部位； B：出血性血小板病的 PAR1、PAR4 的表达及功能部位。 C：在此基础上，研究患者血小板被 PAR1、PAR4 活化肽刺激过程中细胞骨架蛋白成 分肌球蛋白、肌动蛋白、肌动连接蛋白以及 GPIbα水平的动态变化，了解本病发病过 程中两类凝血酶受体对血小板活化的影响程度与途径，以揭示本病皮肤粘膜出血的部 分机制。 ② 分子水平 A：对明显异常者，进行相应受体蛋白基因检测等后续分子生物学研究。包括出血性 血小板病的血小板 GPIbα 、PARⅠ、PAR4、mRNA 的表达；出血性血小板病的血小 板 GPIbα、PARⅠPAR4 的转录水平。 （2）益气活血方对出血性血小板病膜凝血酶受体的影响。 重点观察治疗前后患者 GPIb-IX-Ⅴ、GPIbα蛋白的表达变化以及细胞骨架蛋白的 变化，以部分阐明中药治疗的疗效机理。 2.2 研究目标 研究出血性血小板病的凝血酶受体的功能与活性等，拟从分子和受体水平探索该病 的发病机理，在此基础上运用益气活血方治疗，并重点观察中药对凝血酶受体的影响， 为中药治疗“受体性疾病”提供临床和理论依据。 2.3 拟解决的关键问题 （1）拟解决凝血酶受体的改变与出血性血小板病的发病关系。尤其是该病患者的凝血 酶受体是功能异常或是分子结构异常。 （2）拟解决中药治疗本病的作用环节，是否与调节凝血酶受体的功能有关。 3、拟采取的研究方案及可行性分析 3.1 研究方案 （1）病例选择：临床上选择符合出血性血小板病诊断标准患者及对照者，分为 4 组： ①出血伴血小板聚集缺陷组
国家自然科学基金申请书 ②出血而血小板聚集正常组 ③无出血症而血小板聚集缺陷组(对照组Ⅰ) ④无出血症而血小板聚集正常组(对照组Ⅱ) 这4组病例均参与实验研究和对比观察,争取积累足够病例及实验室资料。 (2)实验室检查:按血小板聚集途径分为3部分 ①血小板活化检测:采用免疫荧光单克隆抗体(CD63一异硫氰酸(FIT0,TSD一藻红蛋 白及CD62P-FITC)标记采凝血酶刺激后的血小板,应用流式细胞仪检测其阳性表达率。 ②GPI-X-V受体检测: A:采用CD42a-b-c(抗GPIb/GPⅨ/GPV)及CD49b或SZ-2单克隆抗体标记抗 凝全血,流式细胞仪下测定血小板GPIbα含量。实验过程按本室报道的方法进行。 B:采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及印痕转移( Western blot)法测定 血小板表面 GP I ba、GPⅨ、GPV及PARl、PAR4的蛋白表达及其之间的比例。并测 定PAR1与PAR4活化肽刺激血小板活化过程中细胞骨架蛋白成分肌球蛋白、肌动蛋 白、肌动连接蛋白以及 GPIb a的水平,实验过程按本室报道的方法进行。 C:在PARs肽刺激血小板活化同时,应用 Cytochalasin D肌动蛋白多聚化抑制剂) BAPTA/AM(螯合胞内Ca2)、 Wortmannin(抑制磷脂酰肌醇-3-激酶P13K及肌球蛋白轻 链激酶MLCK)、 Apyrase(低 ATP/ADP酶,促使ADP分解)、Ro-31-2220(蛋白激酶 C选择性抑制剂)及Y27632(抑制Rho激酶)等多种血小板抑制剂,比较它们对患者及 正常者血小板形态改变、聚集、释放、膜糖蛋白以及细胞骨架蛋白变化的影响,有利 于研究PARS受体活化与出血性血小板病发病的部分关系,并探讨其他可能存在的信 号传导途径。 D:采用 RT-PCR技术测定PARI、PAR4及 GP I b/GPⅨGPV、 GPI b a mRNA 的表达及转录水平。 E:根据 Genebank数据库已有的PARI、PAR4及 GPI b/GPⅨXGPV、 GPI ba cDNA或氨基酸序列进行蛋白质三维结构分析,确定上述凝血酶受体的结合部位及其 与配体结合区域的关键蛋白质,重点检测其氨基酸编码碱基有无突变 (2)益气活血方治疗:将拟定的益气活血方药物水煎醇沉,粗提物制成片剂(前期已 经药效学、长、急毒、质控标准、稳定性试验及临床验证,作为院内制剂应用达8年)。 6个月为一疗程。观察患者临床止血、血小板聚集功能恢复情况及疗效巩固情况,同时 版本1003.094
国家自然科学基金申请书 第 9 页 版本 1.003.094 ②出血而血小板聚集正常组 ③无出血症而血小板聚集缺陷组（对照组Ⅰ） ④无出血症而血小板聚集正常组（对照组Ⅱ） 这 4 组病例均参与实验研究和对比观察，争取积累足够病例及实验室资料。 （2）实验室检查：按血小板聚集途径分为 3 部分。 ①血小板活化检测：采用免疫荧光单克隆抗体（CD63－异硫氰酸（FITO，TSD－藻红蛋 白及 CD62P－FITC）标记采凝血酶刺激后的血小板，应用流式细胞仪检测其阳性表达率。 ② GPⅠ-Ⅸ-Ⅴ受体检测： A：采用 CD42a-b-c（抗 GPⅠb/GPⅨ/GPⅤ）及 CD49b 或 SZ-2 单克隆抗体标记抗 凝全血，流式细胞仪下测定血小板 GPⅠbα含量。实验过程按本室报道的方法进行。 B：采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）及印痕转移（ Western blot）法测定 血小板表面 GPⅠba、GPⅨ、GPⅤ及 PAR1、PAR4 的蛋白表达及其之间的比例。并测 定 PAR1 与 PAR4 活化肽刺激血小板活化过程中细胞骨架蛋白成分肌球蛋白、肌动蛋 白、肌动连接蛋白以及 GPIbα的水平，实验过程按本室报道的方法进行。 C：在 PARs 肽刺激血小板活化同时，应用 Cytochalasin D(肌动蛋白多聚化抑制剂)、 BAPTA/AM(螯合胞内 Ca2＋ )、Wortmannin(抑制磷脂酰肌醇-3-激酶 P13-K 及肌球蛋白轻 链激酶 MLCK)、ApyraseVII(低 ATP/ADP 酶，促使 ADP 分解)、Ro-31-2220(蛋白激酶 C 选择性抑制剂)及 Y27632(抑制 Rho 激酶)等多种血小板抑制剂， 比较它们对患者及 正常者血小板形态改变、聚集、释放、膜糖蛋白以及细胞骨架蛋白变化的影响， 有利 于研究 PARs 受体活化与出血性血小板病发病的部分关系，并探讨其他可能存在的信 号传导途径。 D：采用 RT-PCR 技术测定 PARⅠ、PAR4 及 GPⅠb/GPⅨ/GPⅤ、GPⅠbα mRNA 的表达及转录水平。 E：根据 Genebank 数据库已有的 PARⅠ、PAR4 及 GPⅠb/GPⅨ/GPⅤ、GPⅠbα cDNA 或氨基酸序列进行蛋白质三维结构分析，确定上述凝血酶受体的结合部位及其 与配体结合区域的关键蛋白质，重点检测其氨基酸编码碱基有无突变。 （2） 益气活血方治疗：将拟定的益气活血方药物水煎醇沉，粗提物制成片剂（前期已 经药效学、长、急毒、质控标准、稳定性试验及临床验证，作为院内制剂应用达 8 年）。 6 个月为一疗程。观察患者临床止血、血小板聚集功能恢复情况及疗效巩固情况，同时
国家自然科学基金申请书 重点研究该方对凝血酶受体的影响。 3.2可行性分析 (1)根据我们前期的初步实验,结合国内外专家的理论,出血性血小板病的发病极可 能与凝血酶受体的异常有关 (2)结合我们运用益气活血中药治疗本病的经验和疗效,观察其对凝血酶受体的影响 可能是探讨中药疗效机理的关键途径之 (3)以上实验方法学及配套仪器的使用本实验室均已掌握。 4、本项目的特色与创新之处 本研究出血在二个部位以上併血小板聚集缺陷的出血性血小板病为对象,应用 现代医学所发展的单克隆抗体、流式细胞术及分子生物学等新技术,拟从凝血酶受体 方面研究本病血小板聚集缺陷的病因病机,目前尚未见于文献资料。 4.2应用中药益气活血治疗本病而取效,系我们研究组的优势和创新。本项目在上 述基础上,进一步探讨中药对凝血酶受体的影响,有利于发展中药治疗“受体异常性 疾病”的理论和实践。 5、年度研究计划及预期研究结果 5.1年度研究计划 2006.01~1 病例及对照组选择;实验室检测。积累足够的病例及实验室资料。 2007.01~12 (1)分析上述各组病例存在的差异,其中可能存在的出血、不出血与实验室指标之间 的关系。 (2)中药治疗使患者出血症和血小板聚集缺陷得以纠正,恢复健康。并设立西药对照 组。各组均在治疗后每3个月复查1次实验指标,停药后1年观察其复发情况,并再次 进行实验室检查 2008.01~12 (1)继续进行实验研究及观察中药治疗的效果,以验证本研究总结发病机理及中药作 用环节是否合于科学性和重复性。 (2)整理资料,发表高质量论文,为下一步鉴定作准备;在总结中发现的存在问题, 也可作进一步研究的方向。 (3)接受结题验收。 第10页 版本1.003.094
国家自然科学基金申请书 第 10 页 版本 1.003.094 重点研究该方对凝血酶受体的影响。 3.2 可行性分析 （1）根据我们前期的初步实验，结合国内外专家的理论，出血性血小板病的发病极可 能与凝血酶受体的异常有关。 （2）结合我们运用益气活血中药治疗本病的经验和疗效，观察其对凝血酶受体的影响 可能是探讨中药疗效机理的关键途径之一。 （3）以上实验方法学及配套仪器的使用本实验室均已掌握。 4、 本项目的特色与创新之处 4．1 本研究出血在二个部位以上併血小板聚集缺陷的出血性血小板病为对象，应用 现代医学所发展的单克隆抗体、流式细胞术及分子生物学等新技术，拟从凝血酶受体 方面研究本病血小板聚集缺陷的病因病机，目前尚未见于文献资料。 4．2 应用中药益气活血治疗本病而取效，系我们研究组的优势和创新。本项目在上 述基础上，进一步探讨中药对凝血酶受体的影响，有利于发展中药治疗“受体异常性 疾病”的理论和实践。 5、年度研究计划及预期研究结果 5.1 年度研究计划 2006．01～12 病例及对照组选择；实验室检测。积累足够的病例及实验室资料。 2007.01～12 （1）分析上述各组病例存在的差异，其中可能存在的出血、不出血与实验室指标之间 的关系。 （2）中药治疗使患者出血症和血小板聚集缺陷得以纠正，恢复健康。 并设立西药对照 组。各组均在治疗后每 3 个月复查 1 次实验指标，停药后 1 年观察其复发情况，并再次 进行实验室检查。 2008.01～12 （1）继续进行实验研究及观察中药治疗的效果，以验证本研究总结发病机理及中药作 用环节是否合于科学性和重复性。 （2）整理资料，发表高质量论文，为下一步鉴定作准备；在总结中发现的存在问题， 也可作进一步研究的方向。 （3）接受结题验收
