《自然基金》2005国家自然科学基金申报书：出血性血小板病凝血酶受体及益气活血方的治疗作用.pdf_大学文库

国家自然科学基金申请基本信息名/沈霖性别男年月952年12月民族汉族申请者位学士职称教授主要研究领域|中西医结合临床基础研究话027-85726395 电子邮件|shenlinhbeyahod.com.cn 信传真个人网页无息工作单位华中科技大学/同济医学院在研项目批准号名称|华中科技大学代码43007402 单联系人张婷姣电子邮件|kjcjcb@hust.edu.cn 话|027-87543437 网站地址www.husteducn 单位名称代码单[在此录入修改位信「[在此录入修改项目名称出血性血小板病凝血酶受体研究及益气活血方的治疗作用项目基本资助类别面上项目亚类说明自由申请项目附注说明 03050402:中西医结合临床基申请代码础研究信基地类别息预计研究年限200年1月-2008年12月研究属性|应用基础研究申请经费26.0000万元项目研究内容和意义简介(限400字):出血性血小板病是以反复发作性皮肤粘膜出血、月经过多、鼻衄或眼底、球结膜出血为主症,血小板计数正常,但血小板聚集功能存在缺陷摘|的出血性疾病。其发病因未明,西医药疗效不甚理想。理论上任何途径的血小板聚集过程都涉及血小板活化,最终归之于血小板膜糖蛋白(GP)Ⅲb/Ⅲa复合物。凝血酶在其中占有重要地位。凝血酶是最强的血小板活化剂。其活化血小板主要是通过一个G蛋白偶联七个穿膜区受体和GPIb-Ⅺ-V两种途径。新近发现人类血小板表达的PAR1和PAR4受体,激活其中任何一种,都可以诱导血小板活化。本项目拟采用单克隆抗体、流式细胞仪及分子要生物学技术,在受体及分子水平上研究出血性血小板病凝血酶受体功能与活性,以探讨该病的发病机理;在此基础上,运用益气活血方治疗,并重点观察中药对凝血酶受体的影响为中医药治疗受体性疾病提供临床及理论依据。关键词(用分号分开,最多5个)出血性血小板病:凝血酶受体;益气活血方第2页版本1003.094

国家自然科学基金申请书第 2 页版本 1.003.094 基本信息 wpPIYr6r/9B 姓名沈霖性别男出生年月 1952 年 12 月民族汉族学位学士职称教授主要研究领域中西医结合临床基础研究电话 027－85726395 电子邮件 shenlinhb@yahoo.com.cn 传真个人网页无工作单位华中科技大学 /同济医学院申请者信息在研项目批准号名称华中科技大学代码 43007402 联系人张婷姣电子邮件 kjcjcb@hust.edu.cn 依托单位信息电话 027-87543437 网站地址 www.hust.edu.cn 单位名称代码 [在此录入修改] 合作单位信息 [在此录入修改] 项目名称出血性血小板病凝血酶受体研究及益气活血方的治疗作用资助类别面上项目亚类说明自由申请项目附注说明申请代码 C03050402:中西医结合临床基础研究基地类别预计研究年限 2006 年 1 月 — 2008 年 12 月研究属性应用基础研究项目基本信息申请经费 26.0000 万元摘要项目研究内容和意义简介（限 400 字）：出血性血小板病是以反复发作性皮肤粘膜出血、月经过多、鼻衄或眼底、球结膜出血为主症，血小板计数正常，但血小板聚集功能存在缺陷的出血性疾病。其发病因未明，西医药疗效不甚理想。理论上任何途径的血小板聚集过程都涉及血小板活化，最终归之于血小板膜糖蛋白（GP）Ⅱb／Ⅲa 复合物。凝血酶在其中占有重要地位。凝血酶是最强的血小板活化剂。其活化血小板主要是通过一个 G 蛋白偶联七个穿膜区受体和 GPⅠb-Ⅺ-Ⅴ两种途径。新近发现人类血小板表达的 PARl 和 PAR4 受体，激活其中任何一种，都可以诱导血小板活化。本项目拟采用单克隆抗体、流式细胞仪及分子生物学技术，在受体及分子水平上研究出血性血小板病凝血酶受体功能与活性，以探讨该病的发病机理；在此基础上，运用益气活血方治疗，并重点观察中药对凝血酶受体的影响，为中医药治疗受体性疾病提供临床及理论依据。关键词(用分号分开，最多 5 个) 出血性血小板病；凝血酶受体；益气活血方

国家自然科学基金申请书查看报告正文撰写提纲报告正文 )立项依据与研究内容(40008000字) 1.项目的立项依据出血性血小板病是一组反复发作性出血性疾病。患者常有轻重不等的肢体瘀斑,月经过多,鼻衄,齿龈出血或眼底、球结膜等出血倾向,血小板计数、血小板形态、出凝血时间及凝血象均属正常,且除外其它原因所致的出血,但血小板聚集功能存在缺陷。在本病的发病原因及治疗方面虽有不少论点,但其确切的发病机制至今未明;西医药用强的松、氨肽素、安络血及维生素C、P等治疗,疗效也不甚理想。关于皮肤粘膜出血和月经过多症状与血小板聚集功能缺陷的关系,是我们在临床上研究类似出血性疾病时所见到的。早在1984年,同济医科大学沈迪等人发现一组血小板计数正常而对刺参粘多糖诱导的血小板聚集反应明显减低或缺如的皮肤粘膜出血或伴月经过多患者,当时称为“新型血小板聚集功能缺陷症”,并经国内部分血液学家的复制和证实。然而其中有些出血者的血小板被腺苷二磷酸(ADP)、花生四烯酸(AA)、血小板活化因子(PAF)、肾上腺素和胶原等诱导,也可出现血小板聚集缺陷,其缺陷率在752例中约占316%,称为“未明原因血小板病”。这两组出血性血小板病的研究均曾受国家自然科学基金的资助(编号3870716和39370322),研究结果共发表论文40 余篇,他人重复试验和证实的发表论文37篇。 90年代初,在湖北省卫生厅资助下,研究组开始运用中医药辩证治疗本病。本病的出血症状属中医“血证”。在临床辩证中,发现上述两种血小板病患者中有“气虚”者占78.1%,提示该病中医病机多属“气不摄血证”。根据中医“活血止血”的理论,经体外筛选及临床摸索,自拟益气活血方治疗本病。方中黄芪、党参益气,当归活血补血黄芪、当归含有当归补血汤之意。赤芍、桃仁活血化瘀,甘草和中。经临床验证467 例,中药组在控制出血,改善气虚症状,对血小板聚集缺陷的纠正及停药1年后复发率等疗效方面均明显优于西药氨肽素、安络血、维生素C、P对照组。但其确切的药理作用有待深入研究第5页版本1003.094

国家自然科学基金申请书第 5 页版本 1.003.094 查看报告正文撰写提纲报告正文（一）立项依据与研究内容（4000-8000 字）： 1. 项目的立项依据出血性血小板病是一组反复发作性出血性疾病。患者常有轻重不等的肢体瘀斑，月经过多，鼻衄，齿龈出血或眼底、球结膜等出血倾向，血小板计数、血小板形态、出凝血时间及凝血象均属正常，且除外其它原因所致的出血，但血小板聚集功能存在缺陷。在本病的发病原因及治疗方面虽有不少论点，但其确切的发病机制至今未明；西医药用强的松、氨肽素、安络血及维生素 C、P 等治疗，疗效也不甚理想。关于皮肤粘膜出血和月经过多症状与血小板聚集功能缺陷的关系，是我们在临床上研究类似出血性疾病时所见到的。早在 1984 年,同济医科大学沈迪等人发现一组血小板计数正常而对刺参粘多糖诱导的血小板聚集反应明显减低或缺如的皮肤粘膜出血或伴月经过多患者，当时称为“新型血小板聚集功能缺陷症”，并经国内部分血液学家的复制和证实。然而其中有些出血者的血小板被腺苷二磷酸（ADP）、花生四烯酸（AA）、血小板活化因子（PAF）、肾上腺素和胶原等诱导，也可出现血小板聚集缺陷，其缺陷率在 752 例中约占 31.6%，称为“未明原因血小板病”。这两组出血性血小板病的研究均曾受国家自然科学基金的资助（编号 3870716 和 39370322），研究结果共发表论文 40 余篇，他人重复试验和证实的发表论文 37 篇。 90 年代初，在湖北省卫生厅资助下，研究组开始运用中医药辩证治疗本病。本病的出血症状属中医“血证”。在临床辩证中，发现上述两种血小板病患者中有“气虚”者占 78.1%，提示该病中医病机多属“气不摄血证”。根据中医“活血止血”的理论，经体外筛选及临床摸索，自拟益气活血方治疗本病。方中黄芪、党参益气，当归活血补血，黄芪、当归含有当归补血汤之意。赤芍、桃仁活血化瘀，甘草和中。经临床验证 467 例，中药组在控制出血，改善气虚症状，对血小板聚集缺陷的纠正及停药 1 年后复发率等疗效方面均明显优于西药氨肽素、安络血、维生素 C、P 对照组。但其确切的药理作用有待深入研究

国家自然科学基金申请书 202年本项研究继续获得国家自然科学基金资助(项目批准号30171194),重点研究了出血性血小板病膜糖蛋白受体变化及中药对其的影响。归纳研究的重点内容: ELSA检测膜糖蛋白( Membrane Glycoprateins,GP)Ⅱb、Ⅲa含量减低,洗涤血小板后又可恢复正常范围;流式细胞术测GPIb/ⅨX、GPIb/Ia、GPIb、GPIa及p-选择素表达荧光强度均低于正常人(P005)而明显优于西药组(P<005)。提示益气活血方在受体蛋白水平上调节血小板膜糖蛋白的表达是其治疗出血性血小板病的疗效机理之一。值得指出的是,由于GPIb为血小板高亲和力凝血酶受体,而我们的研究发现出血性血小板病患者GPIb低下,这就进一步启迪我们,该病发病机理可能与凝血酶受体异常有关。凝血酶是一个多功能血浆丝氨酸蛋白酶,它能活化血小板使之发生聚集。GPIb/Ⅸ Ⅴ复合物是血小板表面的重要膜糖蛋白,能与凝血酶结合,在血小板粘附及聚集过程中起重要作用,长期以来被普遍认为是凝血酶受体。GPIb/Ⅸ/V包括4种成分:GP Iba、GPIbβ、GPⅨ、GPV。很多资料表明,凝血酶高亲和力结合位点于GPIb a,GPⅤ对凝血酶高亲和力结合位点形成有重要作用。近年来研究发现血小板表面还存在一类重要的凝血酶受体,即PARs( protease-activated receptors),凝血酶的细胞反应可部分地通过这一个G蛋白偶连受体的小家族介导进行信号传递,这一家族包括PARl PAR2、PAR3与PAR4四大成员。通常凝血酶反应由一个以上PARs受体介导,切割其特定位点暴露新的氨基末端,从而形成一个固定配基与受体进行分子内结合,影响跨膜信号传导。人类血小板表达PAR与PAR4受体,它们都能与G12/13、Gq家族偶连,并通过分泌ADP引起P2Y12受体活化而间接激活Gi信号途径,引起血小板聚集、释放以及膜糖蛋白的一系列改变。PARI具有高亲和力,低浓度凝血酶即诱导其活化,产生快速、强劲的血小板反应。PAR4则亲和力较低,作用弱于PARl,由高浓度凝血酶活化, 可以成为PAR途径的补充。 PARs受体的研究在国内尚刚起步,而国际上正成为热点因此进行凝血酶与血小板相互作用的研究,对于深刻了解出血性疾病的发病机制的机理非常重要本项目根据我们十余年来对出血性血小板病研究的初步结果及中医药治疗的疗效, 第6页版本1003.094

国家自然科学基金申请书第 6 页版本 1.003.094 2002 年本项研究继续获得国家自然科学基金资助（项目批准号 30171194），重点研究了出血性血小板病膜糖蛋白受体变化及中药对其的影响。归纳研究的重点内容： ELISA 检测膜糖蛋白（ Membrane Glycoprateins，GP）Ⅱb、Ⅲa 含量减低，洗涤血小板后又可恢复正常范围；流式细胞术测 GPⅠb/Ⅸ、GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb、GPⅢa 及 p-选择素表达荧光强度均低于正常人（P0.05）而明显优于西药组（P<0.05）。提示益气活血方在受体蛋白水平上调节血小板膜糖蛋白的表达是其治疗出血性血小板病的疗效机理之一。值得指出的是，由于 GPⅠb 为血小板高亲和力凝血酶受体，而我们的研究发现出血性血小板病患者 GPⅠb 低下，这就进一步启迪我们，该病发病机理可能与凝血酶受体异常有关。凝血酶是一个多功能血浆丝氨酸蛋白酶，它能活化血小板使之发生聚集。GPⅠb/ Ⅸ / Ⅴ复合物是血小板表面的重要膜糖蛋白，能与凝血酶结合，在血小板粘附及聚集过程中起重要作用，长期以来被普遍认为是凝血酶受体。GPⅠb/ Ⅸ/ Ⅴ包括 4 种成分：GP Ⅰbα、GPⅠbβ、GP Ⅸ、GPⅤ。很多资料表明，凝血酶高亲和力结合位点于 GPⅠb α，GPⅤ对凝血酶高亲和力结合位点形成有重要作用。近年来研究发现血小板表面还存在一类重要的凝血酶受体，即 PARs (protease-activated receptors)，凝血酶的细胞反应可部分地通过这一个 G 蛋白偶连受体的小家族介导进行信号传递，这一家族包括 PARl、 PAR2、PAR3 与 PAR4 四大成员。通常凝血酶反应由一个以上 PARs 受体介导，切割其特定位点暴露新的氨基末端，从而形成一个固定配基与受体进行分子内结合，影响跨膜信号传导。人类血小板表达 PARl 与 PAR4 受体，它们都能与 G12/13、Gq 家族偶连，并通过分泌 ADP 引起 P2Y12 受体活化而间接激活 Gi 信号途径，引起血小板聚集、释放以及膜糖蛋白的一系列改变。PARl 具有高亲和力，低浓度凝血酶即诱导其活化，产生快速、强劲的血小板反应。PAR4 则亲和力较低，作用弱于 PARl，由高浓度凝血酶活化，可以成为 PARl 途径的补充。PARs 受体的研究在国内尚刚起步，而国际上正成为热点。因此进行凝血酶与血小板相互作用的研究，对于深刻了解出血性疾病的发病机制的机理非常重要。本项目根据我们十余年来对出血性血小板病研究的初步结果及中医药治疗的疗效

国家自然科学基金申请结合国内、外专家理论,认为不论何种诱导剂引起血小板聚集反应的途径如何,其前提是血小板活化,凝血酶是最强的血小板活化剂,其可以调节血小板聚集、释放与内皮细胞活化。因此研究血小板表面凝血酶受体功能对于出血与止血研究至关重要。而我们所见的病例中多有GPIb-I复合物含量减低的,故初步推想这类出血性疾病可能是一组凝血酶受体功能异常所致。而益气活血中药治疗该病的疗效机理之一,可能与调节凝血酶受体存在一定关联。因此本课题拟用相应的单克隆抗体,流式细胞术及分子生物学等现代新技术,研究本病中药治疗前后血小板活化过程的形态改变、聚集以及凝血酶受体的动态变化过程,并分析这些活化过程中细胞骨架蛋白的改变,拟进一步从分子和受体水平丰富出血性血小板病的病理实质及中药治疗的疗效机理。主要参考文献 1. Shen di, Wei Wenning, Wang Ailian;etal. A new variant of沈迪,魏文宁,王辨明,等.一组新型血小板聚集功能缺陷的初步研究.中华内科杂志.1984,23(11):669-670 2.沈迪,朱闽,王爱莲,等未明原因多部位出血者血小板聚集功能的硏究.血栓与止血学杂 1996,3(4):145-146 3.沈迪,沈霖,王爱莲,等脾不统血证146例血小板聚集功能的硏究.中国中西医结合消化杂志,2001,9(2):68-70 4.沈迪,沈霖,王爱莲,等.消瘀片治疗新型血小板聚集功能缺陷的临床硏究中国中西医结合杂志1994,14(10):589-591 5. Shen Di, Shen Lin, Wang A L, et al. Clinical observation on effect of Xiaoyu Zhixue tablet on 104 patients with idiopathic multifocal bleeding and platelet aggregation defect. CJIM. 1998, 4(4): 247-250 6. Shen Lin, Shen Lin, Gao Lan, et al. Effect of Xiaoyu Zhixue tablet on expression of platelet membrane glycoproteins in patients with hemorrhageic thrombopathy. CJIM. 2004, 10(3): 170-174 7.沈霖,沈迪,杨胜兰,等.健脾益气活血方治疗脾不统血併血小板聚集缺陷症疗效观察.中国中西医结合消化杂志.2005,13(2):80-82 8. Soslau G, Class R, Morgan DA, et al. Unique pathway of thrombin-induced platelet aggregation mediated by glycoprotein Ib. J Biol Chem, 2001, 276: 21173-83 9. Skip Brass. Platelets and proteases. Nature. 2001, 413: 26-7 10.Sambrano GR, Weiss E I, Zheng YW et al. Role of thrombin signaling in platelets in haemostasis and thrombosis. Nature, 2001, 413: 74-8 11. Coughlin SR. Thrombin signaling and protease-activated receptors Nature. 2001 407: 258-64 12. Chung AWY, Jurasz Paul, Hollenberg MD, et al. Mechanisms of action of proteinase activated receptor agonists on humanplatelets. Br. J. Pharmacol, 2002, 135: 1123-32 13. Kim S, Foster C, Lecchi A, et al. Protease activated receptors l and 4 do not stimulate Gi signaling pathways in the absence of secreted ADP and cause human platelet aggregation independently of gi ignaling. Blood, 2002, 99: 3629-36 第7页版本1003.094

国家自然科学基金申请书第 7 页版本 1.003.094 结合国内、外专家理论，认为不论何种诱导剂引起血小板聚集反应的途径如何，其前提是血小板活化，凝血酶是最强的血小板活化剂，其可以调节血小板聚集、释放与内皮细胞活化。因此研究血小板表面凝血酶受体功能对于出血与止血研究至关重要。而我们所见的病例中多有 GPIb-I 复合物含量减低的，故初步推想这类出血性疾病可能是一组凝血酶受体功能异常所致。而益气活血中药治疗该病的疗效机理之一，可能与调节凝血酶受体存在一定关联。因此本课题拟用相应的单克隆抗体，流式细胞术及分子生物学等现代新技术，研究本病中药治疗前后血小板活化过程的形态改变、聚集以及凝血酶受体的动态变化过程，并分析这些活化过程中细胞骨架蛋白的改变，拟进一步从分子和受体水平丰富出血性血小板病的病理实质及中药治疗的疗效机理。主要参考文献 1. Shen Di, Wei Wenning , Wang Ailian,et al. A new variant of 沈迪，魏文宁，王辨明，等.一组新型血小板聚集功能缺陷的初步研究. 中华内科杂志.1984，23（11）：669-670 2 . 沈迪，朱闽，王爱莲，等.未明原因多部位出血者血小板聚集功能的研究. 血栓与止血学杂志.1996，3（4）：145-146 3. 沈迪，沈霖，王爱莲，等.脾不统血证 146 例血小板聚集功能的研究. 中国中西医结合消化杂志，2001，9（2）：68-70 4. 沈迪，沈霖，王爱莲，等.消瘀片治疗新型血小板聚集功能缺陷的临床研究.中国中西医结合杂志.1994,14(10):589-591 5. Shen Di, Shen Lin,Wang A L,et al. Clinical observation on effect of Xiaoyu Zhixue tablet on 104 patients with idiopathic multifocal bleeding and platelet aggregation defect.CJIM.1998,4(4):247-250 6. Shen Lin, Shen Lin, Gao Lan, et al. Effect of Xiaoyu Zhixue tablet on expression of platelet membrane glycoproteins in patients with hemorrhageic thrombopathy. CJIM.2004, 10(3):170-174 7. 沈霖，沈迪，杨胜兰，等. 健脾益气活血方治疗脾不统血併血小板聚集缺陷症疗效观察. 中国中西医结合消化杂志. 2005，13（2）:80-82 8. Soslau G，Class R，Morgan DA，et a1．Unique pathway of thrombin-induced platelet aggregation mediated by glycoprotein lb. J Biol Chem，2001，276：21173-83 9. Skip Brass．Platelets and proteases．Nature．2001，413：26-7 10.Sambrano GR，Weiss E 了，Zheng YW et a1．Role of thrombin signaling in platelets in haemostasis and thrombosis．Nature，2001，413：74-8 11. Coughlin SR．Thrombin signaling and protease- activated receptors Nature．2001 407：258-64． 12.Chung AWY，Jurasz Paul，Hollenberg MD，et a1．Mechanisms of action of proteinase activated receptor agonists on humanplatelets．Br．J．Pharmacol，2002，135：1123-32． 13. Kim S，Foster C，Lecchi A，et a1．Protease activated receptors 1 and 4 do not stimulate Gi signaling pathways in the absence of secreted ADP and cause human platelet aggregation independently of Gi signaling. Blood，2002，99：3629-36

国家自然科学基金申请书第 8 页版本 1.003.094 2. 项目的研究内容、研究目标以及拟解决的关键问题 2.1 研究内容（1）出血性血小板病的凝血酶受体研究： ① 受体水平： A：出血性血小板病的 GPIb-IX-Ⅴ、GPIbα蛋白的表达及功能部位； B：出血性血小板病的 PAR1、PAR4 的表达及功能部位。 C：在此基础上，研究患者血小板被 PAR1、PAR4 活化肽刺激过程中细胞骨架蛋白成分肌球蛋白、肌动蛋白、肌动连接蛋白以及 GPIbα水平的动态变化，了解本病发病过程中两类凝血酶受体对血小板活化的影响程度与途径，以揭示本病皮肤粘膜出血的部分机制。 ② 分子水平 A：对明显异常者，进行相应受体蛋白基因检测等后续分子生物学研究。包括出血性血小板病的血小板 GPIbα 、PARⅠ、PAR4、mRNA 的表达；出血性血小板病的血小板 GPIbα、PARⅠPAR4 的转录水平。（2）益气活血方对出血性血小板病膜凝血酶受体的影响。重点观察治疗前后患者 GPIb-IX-Ⅴ、GPIbα蛋白的表达变化以及细胞骨架蛋白的变化，以部分阐明中药治疗的疗效机理。 2.2 研究目标研究出血性血小板病的凝血酶受体的功能与活性等，拟从分子和受体水平探索该病的发病机理，在此基础上运用益气活血方治疗，并重点观察中药对凝血酶受体的影响，为中药治疗“受体性疾病”提供临床和理论依据。 2.3 拟解决的关键问题（1）拟解决凝血酶受体的改变与出血性血小板病的发病关系。尤其是该病患者的凝血酶受体是功能异常或是分子结构异常。（2）拟解决中药治疗本病的作用环节，是否与调节凝血酶受体的功能有关。 3、拟采取的研究方案及可行性分析 3.1 研究方案（1）病例选择：临床上选择符合出血性血小板病诊断标准患者及对照者，分为 4 组： ①出血伴血小板聚集缺陷组

国家自然科学基金申请书 ②出血而血小板聚集正常组 ③无出血症而血小板聚集缺陷组(对照组Ⅰ) ④无出血症而血小板聚集正常组(对照组Ⅱ) 这4组病例均参与实验研究和对比观察,争取积累足够病例及实验室资料。 (2)实验室检查:按血小板聚集途径分为3部分 ①血小板活化检测:采用免疫荧光单克隆抗体(CD63一异硫氰酸(FIT0,TSD一藻红蛋白及CD62P-FITC)标记采凝血酶刺激后的血小板,应用流式细胞仪检测其阳性表达率。 ②GPI-X-V受体检测: A:采用CD42a-b-c(抗GPIb/GPⅨ/GPV)及CD49b或SZ-2单克隆抗体标记抗凝全血,流式细胞仪下测定血小板GPIbα含量。实验过程按本室报道的方法进行。 B:采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及印痕转移( Western blot)法测定血小板表面 GP I ba、GPⅨ、GPV及PARl、PAR4的蛋白表达及其之间的比例。并测定PAR1与PAR4活化肽刺激血小板活化过程中细胞骨架蛋白成分肌球蛋白、肌动蛋白、肌动连接蛋白以及 GPIb a的水平,实验过程按本室报道的方法进行。 C:在PARs肽刺激血小板活化同时,应用 Cytochalasin D肌动蛋白多聚化抑制剂) BAPTA/AM(螯合胞内Ca2)、 Wortmannin(抑制磷脂酰肌醇-3-激酶P13K及肌球蛋白轻链激酶MLCK)、 Apyrase(低 ATP/ADP酶,促使ADP分解)、Ro-31-2220(蛋白激酶 C选择性抑制剂)及Y27632(抑制Rho激酶)等多种血小板抑制剂,比较它们对患者及正常者血小板形态改变、聚集、释放、膜糖蛋白以及细胞骨架蛋白变化的影响,有利于研究PARS受体活化与出血性血小板病发病的部分关系,并探讨其他可能存在的信号传导途径。 D:采用 RT-PCR技术测定PARI、PAR4及 GP I b/GPⅨGPV、 GPI b a mRNA 的表达及转录水平。 E:根据 Genebank数据库已有的PARI、PAR4及 GPI b/GPⅨXGPV、 GPI ba cDNA或氨基酸序列进行蛋白质三维结构分析,确定上述凝血酶受体的结合部位及其与配体结合区域的关键蛋白质,重点检测其氨基酸编码碱基有无突变 (2)益气活血方治疗:将拟定的益气活血方药物水煎醇沉,粗提物制成片剂(前期已经药效学、长、急毒、质控标准、稳定性试验及临床验证,作为院内制剂应用达8年)。 6个月为一疗程。观察患者临床止血、血小板聚集功能恢复情况及疗效巩固情况,同时版本1003.094

国家自然科学基金申请书第 9 页版本 1.003.094 ②出血而血小板聚集正常组 ③无出血症而血小板聚集缺陷组（对照组Ⅰ） ④无出血症而血小板聚集正常组（对照组Ⅱ）这 4 组病例均参与实验研究和对比观察，争取积累足够病例及实验室资料。（2）实验室检查：按血小板聚集途径分为 3 部分。 ①血小板活化检测：采用免疫荧光单克隆抗体（CD63－异硫氰酸（FITO，TSD－藻红蛋白及 CD62P－FITC）标记采凝血酶刺激后的血小板，应用流式细胞仪检测其阳性表达率。 ② GPⅠ-Ⅸ-Ⅴ受体检测： A：采用 CD42a-b-c（抗 GPⅠb/GPⅨ/GPⅤ）及 CD49b 或 SZ-2 单克隆抗体标记抗凝全血，流式细胞仪下测定血小板 GPⅠbα含量。实验过程按本室报道的方法进行。 B：采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）及印痕转移（ Western blot）法测定血小板表面 GPⅠba、GPⅨ、GPⅤ及 PAR1、PAR4 的蛋白表达及其之间的比例。并测定 PAR1 与 PAR4 活化肽刺激血小板活化过程中细胞骨架蛋白成分肌球蛋白、肌动蛋白、肌动连接蛋白以及 GPIbα的水平，实验过程按本室报道的方法进行。 C：在 PARs 肽刺激血小板活化同时，应用 Cytochalasin D(肌动蛋白多聚化抑制剂)、 BAPTA/AM(螯合胞内 Ca2＋ )、Wortmannin(抑制磷脂酰肌醇-3-激酶 P13-K 及肌球蛋白轻链激酶 MLCK)、ApyraseVII(低 ATP/ADP 酶，促使 ADP 分解)、Ro-31-2220(蛋白激酶 C 选择性抑制剂)及 Y27632(抑制 Rho 激酶)等多种血小板抑制剂，比较它们对患者及正常者血小板形态改变、聚集、释放、膜糖蛋白以及细胞骨架蛋白变化的影响，有利于研究 PARs 受体活化与出血性血小板病发病的部分关系，并探讨其他可能存在的信号传导途径。 D：采用 RT-PCR 技术测定 PARⅠ、PAR4 及 GPⅠb/GPⅨ/GPⅤ、GPⅠbα mRNA 的表达及转录水平。 E：根据 Genebank 数据库已有的 PARⅠ、PAR4 及 GPⅠb/GPⅨ/GPⅤ、GPⅠbα cDNA 或氨基酸序列进行蛋白质三维结构分析，确定上述凝血酶受体的结合部位及其与配体结合区域的关键蛋白质，重点检测其氨基酸编码碱基有无突变。（2）益气活血方治疗：将拟定的益气活血方药物水煎醇沉，粗提物制成片剂（前期已经药效学、长、急毒、质控标准、稳定性试验及临床验证，作为院内制剂应用达 8 年）。 6 个月为一疗程。观察患者临床止血、血小板聚集功能恢复情况及疗效巩固情况，同时

国家自然科学基金申请书第 10 页版本 1.003.094 重点研究该方对凝血酶受体的影响。 3.2 可行性分析（1）根据我们前期的初步实验，结合国内外专家的理论，出血性血小板病的发病极可能与凝血酶受体的异常有关。（2）结合我们运用益气活血中药治疗本病的经验和疗效，观察其对凝血酶受体的影响可能是探讨中药疗效机理的关键途径之一。（3）以上实验方法学及配套仪器的使用本实验室均已掌握。 4、本项目的特色与创新之处 4．1 本研究出血在二个部位以上併血小板聚集缺陷的出血性血小板病为对象，应用现代医学所发展的单克隆抗体、流式细胞术及分子生物学等新技术，拟从凝血酶受体方面研究本病血小板聚集缺陷的病因病机，目前尚未见于文献资料。 4．2 应用中药益气活血治疗本病而取效，系我们研究组的优势和创新。本项目在上述基础上，进一步探讨中药对凝血酶受体的影响，有利于发展中药治疗“受体异常性疾病”的理论和实践。 5、年度研究计划及预期研究结果 5.1 年度研究计划 2006．01～12 病例及对照组选择；实验室检测。积累足够的病例及实验室资料。 2007.01～12 （1）分析上述各组病例存在的差异，其中可能存在的出血、不出血与实验室指标之间的关系。（2）中药治疗使患者出血症和血小板聚集缺陷得以纠正，恢复健康。并设立西药对照组。各组均在治疗后每 3 个月复查 1 次实验指标，停药后 1 年观察其复发情况，并再次进行实验室检查。 2008.01～12 （1）继续进行实验研究及观察中药治疗的效果，以验证本研究总结发病机理及中药作用环节是否合于科学性和重复性。（2）整理资料，发表高质量论文，为下一步鉴定作准备；在总结中发现的存在问题，也可作进一步研究的方向。（3）接受结题验收