您现在不能检查保护文档或打印文档, 请根据以下三个步骤操作: 1)如果您是Word2000或以上版本用户, 请把Wod宏的安全性设为中” 六社,1A的、T目、中中A 检查保护 国家自然科学基金 申请书 资助类别: 亚类说明: 附注说明: 项目名称 申请者: 电话 依托单位: 通讯地址 邮政编码: 单位电话 电子邮件: 申报日期 2004年3月9日 国家自然科学基金委员会
申请代码： 受理部门： 收件日期： 受理编号： 检查保护 国家自然科学基金 申 请 书 资助类别： 亚类说明： 附注说明： 项目名称： 申 请 者： 电话： 依托单位： 通讯地址： 邮政编码： 单位电话： 电子邮件： 申报日期： 2004 年 3 月 9 日 国家自然科学基金委员会 您现在不能检查保护文档或打印文档， 请根据以下三个步骤操作： 1)如果您是 Word2000 或以上版本用户， 请把 Word 宏的安全性设为:"中" 方法: Word 菜单->工具->宏->安全性
国家自然科学基金申请书 基本信息 姓名阵此录入修性别 出生年月 年月 民族 申请者 职称 主要研究领域 位话真 电子邮件 个人网页 信 息工作单位 在研项目批准号 名称华中科技大学 代码43007402 位 联系人张婷姣 电子邮件 kjc jcbehust. edu. cn 信息一合作单位 电话|027-87543437 网站地址|w.hust.edu.cn 单位名称 代码 单美国华盛顿大学 00000000 信「[在此录入修改 项目名称 T- cadherin基因失活与原发性肝癌恶性生物学特征的关系及其临床意义 项目基本 资助类别面上项目 亚类说明自由申请项 附注说明 申请代码c03030303:普通外科学 C03031901:实验肿瘤学 信 基地类别 惠[预计研究年限2051年1月207年1月研究属性应用基础研究 项目研究内容和意义简介(限400字):细胞粘附分子 T-cadherin(Tcad)基因在肝癌 肺癌、乳腺癌等多种肿瘤中因启动子甲基化而失活,其表达显著下降或缺失,推测其可能 摘为一新的肿宿抑制基因。中请人首次证实Tcd基因在脑胶质母细胞C细胞中的肿瘤抑 制基因功能,并揭示其分子机制。本研究将在肝癌细胞株进一步研究T-cad基因失活与肝 癌细胞的增殖及侵袭等恶性生物学特征的关系,并调查其分子机制:在临床切除的肝癌标 本中研究T-cad基因失活与肝癌恶性分化程度、转移及复发等恶性生物学特征的关系,明 确T-cad基因失活与临床肝癌预后的关系:在肝癌细胞株和肝癌裸鼠模型上证实去甲基化 要|物是否能重新诱导Tcad分子表达并抑制肝癌细胞的增殖、侵袭等恶性生物学特征,探 索去甲基化药物对肝癌的治疗价值。该研究对进一步揭示肝癌发病的分子机制、设计合理 的治疗药物及判断预后,提高我国肝癌的治疗水平具有重要意义。 关键词用分号分开,最多5个)| T-cadherin;肿瘤抑制基因:肝癌 版本1009485
国家自然科学基金申请书 第 2 页 版本 1.009.485 基本信息 yEKHuo0AOsK 申 请 者 信 息 姓 名 [在此录入修 改] 性别 出生 年月 年 月 民 族 学 位 职称 主要研究领域 电 话 电子邮件 传 真 个 人 网 页 工 作 单 位 在研项目批准号 依 托 单 位 信 息 名 称 华中科技大学 代 码 43007402 联 系 人 张婷姣 电子邮件 kjcjcb@hust.edu.cn 电 话 027-87543437 网站地址 www.hust.edu.cn 合 作 单 位 信 息 单 位 名 称 代 码 美国华盛顿大学 00000000 [在此录入修改] 项 目 基 本 信 息 项目名称 T-cadherin基因失活与原发性肝癌恶性生物学特征的关系及其临床意义 资助类别 面上项目 亚 类 说 明 自由申请项目 附注说明 申请代码 C03030303:普通外科学 C03031901:实验肿瘤学 基地类别 预计研究年限 2005 年 1 月 — 2007 年 12 月 研究属性 应用基础研究 摘 要 项目研究内容和意义简介（限 400 字）：细胞粘附分子 T-cadherin（T-cad）基因在肝癌、 肺癌、乳腺癌等多种肿瘤中因启动子甲基化而失活，其表达显著下降或缺失，推测其可能 为一新的肿瘤抑制基因。申请人首次证实 T-cad 基因在脑胶质母细胞瘤 C6 细胞中的肿瘤抑 制基因功能，并揭示其分子机制。本研究将在肝癌细胞株进一步研究 T-cad 基因失活与肝 癌细胞的增殖及侵袭等恶性生物学特征的关系，并调查其分子机制；在临床切除的肝癌标 本中研究 T-cad 基因失活与肝癌恶性分化程度、转移及复发等恶性生物学特征的关系，明 确 T-cad 基因失活与临床肝癌预后的关系；在肝癌细胞株和肝癌裸鼠模型上证实去甲基化 药物是否能重新诱导 T-cad 分子表达并抑制肝癌细胞的增殖、侵袭等恶性生物学特征，探 索去甲基化药物对肝癌的治疗价值。该研究对进一步揭示肝癌发病的分子机制、设计合理 的治疗药物及判断预后，提高我国肝癌的治疗水平具有重要意义。 关 键 词(用分号分开，最多 5 个) T-cadherin；肿瘤抑制基因；肝癌
国家自然科学基金申请书 项目组主要成员(杰出青年科学基金不填此栏 出生年月性别职称学位 单位名称 电话 电子邮件 项目分工作时间 (月) 1在此录入修改 2[在此录入修改 在此录入修改] 在此录入修改] 在此录入修改] 6[在此录入修改 7[在此录入修改 8【在此录入修改 9[在此录入修改 总人数 高级 中级 初级 博士后 博士生 硕士生 说明:1.高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生人员数由申请者负责填报,总人数自动生成。 2.项目组主要成员不包括项目申请者
国家自然科学基金申请书 第 3 页 版本 1.009.485 项目组主要成员(杰出青年科学基金不填此栏) 编号 姓 名 出生年月 性别 职 称 学 位 单位名称 电话 电子邮件 项目分工 每年工 作时间 （月） 1 [在此录入修改] 2 [在此录入修改] 3 [在此录入修改] 4 [在此录入修改] 5 [在此录入修改] 6 [在此录入修改] 7 [在此录入修改] 8 [在此录入修改] 9 [在此录入修改] 总人数 高级 中级 初级 博士后 博士生 硕士生 10 3 2 1 1 2 1 说明: 1. 高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生人员数由申请者负责填报，总人数自动生成。 说明: 2. 项目组主要成员不包括项目申请者
国家自然科学基金申请书 经费申请表 (金额单位:万元) 科目 申请经费 备注(计算依据与说明) 研究经费 17.5000 1.科研业务费 2.9000 (1)测试/计算/分析费 0.5000统计分析及数据处理费 (2)能源/动力费 0.4000水电费 (3)会议费/差旅费 1.0000参加国内学术会议4-5人次 (4)出版物/文献/信息传播费 1.000论文准备及发表 (5)其它 2.实验材料费 5.5000 (1)原材料/试剂/药品购置费 4000购置各种抗体、脂质体 (2)其它 1.5000购买氚标胸腺嘧啶、去甲基化试剂、合成引物 3.仪器设备费 4.5000 (1)购置 3000购买小型冰冻切片机、动物解剖器材及消耗性器材 (2)试制 1.5000各种常规试剂 4.实验室改装费 2.000建立动物解剖工作台及同位素实验专区 5.协作费 2.600委托动物中心维持约100裸鼠约1年的饲养及管 里;流试细胞仪分析 因际合作与交流费 3.5000 1.项目组成员出国合作交流 1.000参加国际会议一次 2.境外专家来华合作交流 2.5000请Gum教投授来院指导课题进展及专题讲座 劳务费 四.管理费 1.0000 合计 22.0000 国家其他计划资助经费 与本项目相关的 其他经费资助(含部门匹配) 其他经费来源 其他经费来源合计 0.0000 版本1009485
国家自然科学基金申请书 第 4 页 版本 1.009.485 经费申请表 （金额单位：万元） 科目 申请经费 备注（计算依据与说明） 一.研究经费 17.5000 1.科研业务费 2.9000 （1）测试/计算/分析费 0.5000 统计分析及数据处理费 （2）能源/动力费 0.4000 水电费 （3）会议费/差旅费 1.0000 参加国内学术会议 4-5 人次 （4）出版物/文献/信息传播费 1.0000 论文准备及发表 （5）其它 2.实验材料费 5.5000 （1）原材料/试剂/药品购置费 4.0000 购置各种抗体、脂质体 （2）其它 1.5000 购买氚标胸腺嘧啶、去甲基化试剂、合成引物 3.仪器设备费 4.5000 （1）购置 3.0000 购买小型冰冻切片机、动物解剖器材及消耗性器材 （2）试制 1.5000 各种常规试剂 4.实验室改装费 2.0000 建立动物解剖工作台及同位素实验专区 5.协作费 2.6000 委托动物中心维持约 100 只裸鼠约 1 年的饲养及管 理；流试细胞仪分析 二.国际合作与交流费 3.5000 1.项目组成员出国合作交流 1.0000 参加国际会议一次 2.境外专家来华合作交流 2.5000 邀请 Gutmann 教授来院指导课题进展及专题讲座 2-3 次 三.劳务费 四.管理费 1.0000 合 计 22.0000 与本项目相关的 其他经费来源 国家其他计划资助经费 其他经费资助（含部门匹配） 其他经费来源合计 0.0000
国家自然科学基金申请书 杳看报告正文撰写提纲 报告正文 (一)立项依据与研究内容 项目的立项依据 原发性肝癌是高度恶性的肿瘤,尽管采取积极手术治疗,但绝大多数病人仍难免死 于肿瘤复发及转移,其死亡率髙居我国肿瘤死亡率的第二位。研究已表明肝癌的发生乙 肝、丙肝感染及摄入黄曲霉素污染的食物有密切关系,其发生发展与多种癌基因过度表 达,以及肿瘤抑制基因失活密切相关。但目前对其发生发展的精确分子机制尚不完全清 楚。因此,进一步探索研究新的基因功能改变与肝癌发生发展及其恶性特征的关系,对 揭示其发生发展的精确分子机制、设计合理的治疗药物及判断预后,进一步提高我国 肝癌的治疗水平具有重要意义 T- cadherin分子属细胞粘附分子 cadherin超家族。 Cadherin超家族分子为细胞 表面糖蛋白,其功能主要包括调节钙介导的细胞粘附、细胞极性及形态形成,以及参与 细胞间的识别和信号传导机制(1,2,3,4)。经典的 Cadherin分子如E- cadherin和 N- cadherin由细胞外钙结合区及跨膜区两部分组成,而T- cadherin因缺失经典 Cadherin分子所具有的跨膜区而经糖基磷脂酰肌醇分子附着于细胞膜上(5),故而命名 truncated- cadherin(即T- cadherin,又称CDH13或H- cadherin)。近年来对经典的 Cadherin分子的深入研究发现,E-,N- cadherin分子缺失或突变与多种肿瘤如肝癌 胃癌、乳腺癌、肺癌的发生及转移特征密切相关(6,7,8,9,10。将E- cadherin分子 重新导入缺失E- cadherin分子表达的肿瘤细胞,则肿瘤细胞的增殖及侵犯能力显著受 抑(11)。近年已开始有T- cadherin分子在肝癌、乳腺癌、肺癌、结直肠癌、卵巢癌及 皮肤鳞癌中表达显著下降、缺失的报导(12,13,14,15,16,17,18),推测T- cadherin 分子在这些肿瘤中可能扮演肿瘤抑制基因角色,但尚无人对其在不同肿瘤中的基因功能 及其分子机制进行研究。2003年,申请人(黄志勇)最新研究表明,将T- cadherin基 因导入缺失表达T- cadherin分子的大鼠脑胶质母细胞瘤C6细胞使其过度表达 T- cadherin分子,C6细胞的增殖及侵袭能力显著受抑,首次证实T- cadherin在大鼠脑 胶质母细胞瘤中的肿瘤抑制基因功能,并进一步揭示其抑制机制是T- cadherin分子通 过诱导P2ICIP1/wAFI表达致使肿瘤细胞于细胞周期G2期阻滞。该文发表于 Molecular and Cellular biology2003,23:566-578(19)。这一研究发现为进一步研究T- cadherin 第5页 版本1009485
国家自然科学基金申请书 第 5 页 版本 1.009.485 查看报告正文撰写提纲 报告正文 （一）立项依据与研究内容 1、项目的立项依据 原发性肝癌是高度恶性的肿瘤，尽管采取积极手术治疗，但绝大多数病人仍难免死 于肿瘤复发及转移，其死亡率高居我国肿瘤死亡率的第二位。研究已表明肝癌的发生乙 肝、丙肝感染及摄入黄曲霉素污染的食物有密切关系, 其发生发展与多种癌基因过度表 达，以及肿瘤抑制基因失活密切相关。但目前对其发生发展的精确分子机制尚不完全清 楚。因此, 进一步探索研究新的基因功能改变与肝癌发生发展及其恶性特征的关系，对 揭示其发生发展的精确分子机制、设计合理的治疗药物及判断预后， 进一步提高我国 肝癌的治疗水平具有重要意义。 T-cadherin 分子属细胞粘附分子 cadherin 超家族。 Cadherin 超家族分子为细胞 表面糖蛋白，其功能主要包括调节钙介导的细胞粘附、细胞极性及形态形成，以及参与 细胞间的识别和信号传导机制(1,2,3,4)。经典的 Cadherin 分子如 E-cadherin 和 N-cadherin 由细胞外钙结合区及跨膜区两部分组成，而 T-cadherin 因缺失经典 Cadherin 分子所具有的跨膜区而经糖基磷脂酰肌醇分子附着于细胞膜上（5）,故而命名 truncated-cadherin（即 T-cadherin，又称 CDH13 或 H-cadherin）。近年来对经典的 Cadherin 分子的深入研究发现，E-，N-cadherin 分子缺失或突变与多种肿瘤如肝癌、 胃癌、乳腺癌、肺癌的发生及转移特征密切相关（6，7，8,9,10）。将 E-cadherin 分子 重新导入缺失 E-cadherin 分子表达的肿瘤细胞，则肿瘤细胞的增殖及侵犯能力显著受 抑（11）。近年已开始有 T-cadherin 分子在肝癌、乳腺癌、肺癌、结直肠癌、卵巢癌及 皮肤鳞癌中表达显著下降、缺失的报导（12，13，14，15,16,17,18），推测 T-cadherin 分子在这些肿瘤中可能扮演肿瘤抑制基因角色,但尚无人对其在不同肿瘤中的基因功能 及其分子机制进行研究。2003 年，申请人（黄志勇）最新研究表明，将 T-cadherin 基 因导入缺失表达 T-cadherin 分子的大鼠脑胶质母细胞瘤 C6 细胞使其过度表达 T-cadherin 分子，C6 细胞的增殖及侵袭能力显著受抑，首次证实 T-cadherin 在大鼠脑 胶质母细胞瘤中的肿瘤抑制基因功能，并进一步揭示其抑制机制是 T-cadherin 分子通 过诱导 P21 CIP1/WAF1 表达致使肿瘤细胞于细胞周期 G2 期阻滞。该文发表于 Molecular and Cellular Biology 2003,23:566-578（19）。这一研究发现为进一步研究 T-cadherin
国家自然科学基金申请书 分子在肝癌中的功能、分子机制及临床意义奠定了坚实的基础。 肿瘤抑制基因启动子甲基化导致基因失活在肿瘤的发病机制中起着重要作用(20, 21,22,23)。 T-cadherin基因在乳腺癌、结直肠癌及肺癌中并未发生缺失突变,但由于 其启动子异常甲基化导致 T-cadherin基因失活,进而导致其蛋白表达水平显著下降或缺 失(13,16,24)。 T-cadherin基因位于染色体16q24,肝癌的发生与染色体16q24的缺失、 突变密切相关(25)。Riou(2002)对位于染色体16q24的13个常常在肝癌中缺失表达 的基因的转录研究发现, T-cadherin mrNA在HepG2, PLC/PRE/C,TONG和HA22INGH 四种肝癌细胞株中缺失表达,但 T-cadherin基因本身并未发生缺失突变(12)。Yu(2002) 进一步研究显示 T-cadherin基因启动子在肝癌中高度甲基化,而 E-cadherin基因启动子 在肝癌中不发生甲基化,表明在 Cadherin细胞粘附分子超家族中 T-cadherin基因启动子 甲基化在肝癌中具有高度特异性,且 T-cadherin基因启动子甲基化与 T-cadherin基因失活 密切相关(26)。这些研究表明 T-cadherin基因启动子甲基化是 T-cadherin基因在肝癌中 失活的主要机制。 Takeuchi在对皮肤鳞癌细胞株的研究中发现,与2ug/ml去甲基化药 物5-aza-2'- deoxycytidine共孵6天能使皮肤鳞癌细胞株恢复T- cadherin分子表达(17)。 但目前对T- cadherin基因失活与肝癌恶性分化程度、肝内转移及复发等恶性生物学特征 的关系,以及应用去甲基化药物是否能诱导T- cadherin分子在肝癌细胞株中重新表达, 并抑制肝癌细胞的增殖、侵袭及转移等恶性特征全世界尚无研究报道。 本研究将进一步研究 T-cadherin在肝癌中的基因功能,调查缺失表达T- cadherin的 肝癌细胞株重新表达T- cadherin是否能抑制肝癌细胞的增殖、侵袭及转移等恶性生物学 特征,并在裸鼠肝癌模型上加以证实。同时,进一步研究其基因功能的分子机制。在临 床切除的肝癌标本中研究T- cadherin基因失活与肝癌恶性分化程度、转移及复发等恶性 生物学特征的关系,进一步揭示 T-cadherin基因失活与临床肝癌预后的关系。在肝癌细 胞株及裸鼠肝癌模型上证实是否去甲基化药物能重新诱导 T-cadherin分子表达,并抑制 肝癌细胞的增殖、侵袭及转移等恶性生物学特征,观察其潜在的治疗作用和可能的毒副 作用。由于国内外尚无类似研究报道,申请人具有研究 T-cadherin基因与C6细胞恶性 生物学特征的关系及其分子机制的丰富经验,预期该研究成果能达国际先进水平。 主要参考文献: Angst BD, Marcozzi C and Magee Al. The cadherin superfamily: diversity in form and function. J Cell Sci. 2001.114: 629-641 版本1009485
国家自然科学基金申请书 第 6 页 版本 1.009.485 分子在肝癌中的功能、分子机制及临床意义奠定了坚实的基础。 肿瘤抑制基因启动子甲基化导致基因失活在肿瘤的发病机制中起着重要作用（20， 21，22，23）。T-cadherin 基因在乳腺癌、结直肠癌及肺癌中并未发生缺失突变，但由于 其启动子异常甲基化导致 T-cadherin 基因失活，进而导致其蛋白表达水平显著下降或缺 失（13,16,24）。T-cadherin 基因位于染色体 16q24，肝癌的发生与染色体 16q24 的缺失、 突变密切相关(25)。 Riou （2002）对位于染色体 16q24 的 13 个常常在肝癌中缺失表达 的基因的转录研究发现，T-cadherin mRNA 在 HepG2, PLC/PRF/C, TONG 和 HA22TNGH 四种肝癌细胞株中缺失表达，但 T-cadherin 基因本身并未发生缺失突变（12）。Yu（2002） 进一步研究显示 T-cadherin 基因启动子在肝癌中高度甲基化，而 E-cadherin 基因启动子 在肝癌中不发生甲基化，表明在 Cadherin 细胞粘附分子超家族中 T-cadherin 基因启动子 甲基化在肝癌中具有高度特异性,且 T-cadherin 基因启动子甲基化与 T-cadherin 基因失活 密切相关（26）。这些研究表明 T-cadherin 基因启动子甲基化是 T-cadherin 基因在肝癌中 失活的主要机制。Takeuchi 在对皮肤鳞癌细胞株的研究中发现，与 2ug/ml 去甲基化药 物 5-aza-2’-deoxycytidine 共孵 6 天能使皮肤鳞癌细胞株恢复 T-cadherin 分子表达（17）。 但目前对 T-cadherin 基因失活与肝癌恶性分化程度、肝内转移及复发等恶性生物学特征 的关系，以及应用去甲基化药物是否能诱导 T-cadherin 分子在肝癌细胞株中重新表达， 并抑制肝癌细胞的增殖、侵袭及转移等恶性特征全世界尚无研究报道。 本研究将进一步研究 T-cadherin 在肝癌中的基因功能，调查缺失表达 T-cadherin 的 肝癌细胞株重新表达 T-cadherin 是否能抑制肝癌细胞的增殖、侵袭及转移等恶性生物学 特征，并在裸鼠肝癌模型上加以证实。同时，进一步研究其基因功能的分子机制。在临 床切除的肝癌标本中研究 T-cadherin 基因失活与肝癌恶性分化程度、转移及复发等恶性 生物学特征的关系，进一步揭示 T-cadherin 基因失活与临床肝癌预后的关系。在肝癌细 胞株及裸鼠肝癌模型上证实是否去甲基化药物能重新诱导 T-cadherin 分子表达，并抑制 肝癌细胞的增殖、侵袭及转移等恶性生物学特征，观察其潜在的治疗作用和可能的毒副 作用。由于国内外尚无类似研究报道，申请人具有研究 T-cadherin 基因与 C6 细胞恶性 生物学特征的关系及其分子机制的丰富经验，预期该研究成果能达国际先进水平。 主要参考文献： 1. Angst BD, Marcozzi C and Magee AI. The cadherin superfamily: diversity in form and function. J Cell Sci., 2001, 114:629-641
国家自然科学基金申请书 2. Kemler R. Classic cadherins. Semin. Cell Biol. 19923: 149-155 3. Koller E, Ransch B. Differential targeting of T-and N-cadherin in polarized epithelial cells j Biol che.,1996,271:30061-30067 4. Takeichi MCadherin cell adhesion receptor as a morphogenetic regulator. Science 1991,251:1451-1455 5. Angst, B D, Marcozzi, c, and Magee, A L. The T-cadherin superfamily: diversity in from and function J Cell Sci 2001. 114: 629-641 6. Berx, G, and. Van Roy, F. The E-cadherin/catenin complex: an important gatekeeper in breast cancer tumorigenesis and malignant progression. Breast Cancer Res. 2001 3:289-293. 7. Bremnes, R M, Veve R, Gabrielson, E. et al. High-throughput tissue microarray analysis used to evaluate biology and prognostic significance of the E-cadherin pathway in non-small-cell lung cancer. J. Clin. Oncol. 2002, 20: 2417-2428 8. Handschuh. G. Candidus s. Luber B. et al. Tumour-associated E-cadherin mutations alter cellular morphology, decrease cellular adhesion and increase cellular motility. Oncogene 1999.18:4301-4312 9. Levenberg, S, Yarden A, Kam Z, et al. p27 is involved in N-cadherin-mediated contact inhibition of cell growth and S-phase entry. Oncogene 1999, 18: 869-876 10. Altered expression of E-cadherin in hepatocellular carcinoma: correlation with alteration, beta-catenin expression, and clinical features. Hepatology 2002, 36: 692-701 11. Vleminckx, K, Vakaet L, Mareel Jr. M, et al. Genetic manipulation of E-cadherin expression by epithelial tumor cells reveals an invasion suppressor role. Cell 1991, 66 107-119 12. Riou P, Saffroy R, Comoy J, et al. Investigation in liver tissues and cell lines of the transcription of 13 genes mapping to the 16q24 region that are frequently deleted in hepatocellular carcinoma. Clin Cancer Res 2002 Oct; 8(10): 3178-86 13. Sato, M, Mori, Y, Sakurada, A, et al. The H-cadherin(CDH13)gene is inactivated in human lung cancer. Hum Genet 1998.103: 96-101 14. Lee, S w.H-cadherin, a novel cadherin with growth inhibitory functions and diminished xpression in human breast cancer. Nat Med 1996.2: 776-782 5.Zhong, Y, Delgado, Y, Gomez, J, et al. Loss of H-cadherin protein expression in human non-small cell lung cancer is associated with tumorigenicity. Clin. Cancer Res 第7页 版本1009485
国家自然科学基金申请书 第 7 页 版本 1.009.485 2. Kemler R. Classic cadherins. Semin. Cell Biol., 1992,3:149-155 3. Koller E, Ransch B. Differential targeting of T- and N-cadherin in polarized epithelial cells. J Biol Chem.,1996,271:30061-30067 4. Takeichi M.Cadherin cell adhesion receptor as a morphogenetic regulator. Science 1991,251:1451-1455 5. Angst, B.D., Marcozzi, c., and Magee, A.L. The T-cadherin superfamily: diversity in from and function. J.Cell Sci 2001, 114:629-641 6. Berx, G., and. Van Roy, F.. The E-cadherin/catenin complex: an important gatekeeper in breast cancer tumorigenesis and malignant progression. Breast Cancer Res. 2001, 3:289-293. 7. Bremnes, R. M., Veve R., Gabrielson, E. et al. High-throughput tissue microarray analysis used to evaluate biology and prognostic significance of the E-cadherin pathway in non-small-cell lung cancer. J. Clin. Oncol. 2002,20: 2417-2428. 8. Handschuh, G., Candidus S., Luber B., et al. Tumour-associated E-cadherin mutations alter cellular morphology, decrease cellular adhesion and increase cellular motility. Oncogene 1999, 18:4301-4312. 9. Levenberg, S., Yarden A., Kam Z., et al. p27 is involved in N-cadherin-mediated contact inhibition of cell growth and S-phase entry. Oncogene 1999,18: 869-876. 10.Altered expression of E-cadherin in hepatocellular carcinoma : correlation with genetic alteration, beta-catenin expression, and clinical features. Hepatology 2002,36:692-701 11.Vleminckx, K., Vakaet L., Mareel Jr. M., et al. Genetic manipulation of E-cadherin expression by epithelial tumor cells reveals an invasion suppressor role. Cell 1991,66: 107-119. 12. Riou P, Saffroy R, Comoy J, et al. Investigation in liver tissues and cell lines of the transcription of 13 genes mapping to the 16q24 region that are frequently deleted in hepatocellular carcinoma. Clin Cancer Res. 2002 Oct;8(10):3178-86. 13. Sato, M., Mori, Y., Sakurada, A., et al. The H-cadherin(CDH13)gene is inactivated in human lung cancer. Hum Genet 1998,103:96-101 14. Lee, S.W. H-cadherin, a novel cadherin with growth inhibitory functions and diminished expression in human breast cancer. Nat. Med 1996,2:776-782 15.Zhong,Y., Delgado, Y., Gomez, J., et al. Loss of H-cadherin protein expression in human non-small cell lung cancer is associated with tumorigenicity. Clin. Cancer Res
国家自然科学基金申请书 2001,7:1683-1687 16. Toyooka S, Toyooka KO, Harada K, et al. Aberrant methylation of the CDH13(H-cadherin) promoter region in colorectoral cancers and adenomas. Cancer Res 2002, 62: 3382-3386 17.Takeuchi T, Liang SB, Matsuyoshi N, et al. Loss of T-cadherin( CDH13, H-cadherin) expression in cutaneous squamous cell carcinoma. Laboratory Investigation 2002 82:1023-1029 18Kawakami M, Staub J, Cliby W, et al. Involvement of H-cadherin(CDH13)on 16q in the region of frequent deletion in ovarian cancer. Int J Oncol 1999, 15:715-720 19. Huang ZY, Wu,Y, Hedrick, N, and Gutmann, D H. 2003. T-cadherin-mediated cell regulation ivolves G2 phase arrest and requires p21 CIP1/WAFl expression. Molecular and cellular biology 2003, 23: 566-578 20. Yang B, Guo M, erman JG, et al. Aberrant promoter methylation profiles of tumor suppressor genes in hepatocellular carcinoma. Am J Pathol. 2003, 163: 1101-7 21. Baldwin, RL, Nemeth, E, Tran, H, et al. BRCal promoter region hypermethylation in ovarian carcinoma: a population-based study. Cancer Res 2000, 60: 53295333 22. Simpson, DJ, Hibberts, NA, McNicol, AM, et al. Loss of pRb expression in pituitary adenomas is associated with methylation of the RBl CpG island. Cancer Res 2000, 60 12111216 23 Wiencke, JK, Zheng, S, Lafuente, A, et al. Aberrant methylation of pl6iNK4a in anatomic and gender-specific subtypes of sporadic colorectal cancer. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev1999.8:501506 24. Toyooka, K D, Toyooka, S, Vimani, K, et al. Loss of expression and abrrent methylation of the CDH13 (H-cadherin)gene in breast and lung carcinomas, Cancer Res 200161:4556-4560 25 Marchio A. Meddeb M. Pineau p et al. Recurrent chromosomal abnormalities in hepatocellular carcinoma detected by comparative genomic hybridization 1997,18:59-65 26. Yu J, Ni M, Xu J, et al. Methylation profiling of twenty promoter-CpG islands of genes which may contribute to hepatocellular carcinogenesis. BMC Cancer 2002. 2: 29 2、项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键问题 、研究T- cadherin在肝癌中的基因功能 第8页 版本1009485
国家自然科学基金申请书 第 8 页 版本 1.009.485 2001,7:1683-1687 16.Toyooka S, Toyooka KO,Harada K, et al. Aberrant methylation of the CDH13(H-cadherin) promoter region in colorectoral cancers and adenomas. Cancer Res 2002,62:3382-3386 17.Takeuchi T, Liang SB, Matsuyoshi N, et al. Loss of T-cadherin(CDH13, H-cadherin) expression in cutaneous squamous cell carcinoma. Laboratory Investigation 2002, 82:1023-1029 18.Kawakami M,Staub J,Cliby W ,et al. Involvement of H-cadherin(CDH13) on 16q in the region of frequent deletion in ovarian cancer. Int J Oncol 1999,15:715-720 19.Huang ZY, Wu, Y., Hedrick, N., and Gutmann, D.H. 2003. T-cadherin-mediated cell regulation ivolves G2 phase arrest and requires p21 CIP1/WAF1 expression. Molecular and cellular Biology 2003,23:566-578 20.Yang B, Guo M, Herman JG, et al. Aberrant promoter methylation profiles of tumor suppressor genes in hepatocellular carcinoma.Am J Pathol. 2003 ,163:1101-7. 21.Baldwin, RL, Nemeth, E, Tran, H, et al. BRCA1 promoter region hypermethylation in ovarian carcinoma: a population-based study. Cancer Res 2000, 60: 53295333. 22.Simpson, DJ, Hibberts, NA, McNicol, AM, et al. Loss of pRb expression in pituitary adenomas is associated with methylation of the RB1 CpG island. Cancer Res 2000, 60: 12111216. 23.Wiencke, JK, Zheng, S, Lafuente, A, et al. Aberrant methylation of p16INK4a in anatomic and gender-specific subtypes of sporadic colorectal cancer. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 1999, 8: 501506. 24. Toyooka, K.D., Toyooka,S., Vimani, K., et al. Loss of expression and abrrent methylation of the CDH13 (H-cadherin)gene in breast and lung carcinomas., Cancer Res 2001,61:4556-4560 25.Marchio A, Meddeb M, Pineau P, et al. Recurrent chromosomal abnormalities in hepatocellular carcinoma detected by comparative genomic hybridization. Genes Chromosomes Cancer. 1997,18:59-65. 26.Yu J, Ni M, Xu J, et al. Methylation profiling of twenty promoter-CpG islands of genes which may contribute to hepatocellular carcinogenesis. BMC Cancer 2002, 2:29 2、项目的 研究内容、研究目标，以及拟解决的关键问题 一、研究 T-cadherin 在肝癌中的基因功能
国家自然科学基金申请书 1将 T-cadherin基因导入缺失表达 T-cadherin的肝癌细胞株HepG2,使其表达 T-cadherin 分子,研究表达T- cadherin分子的肝癌细胞的增殖、侵袭及转移等恶性生物学特征的 变化,证实是否T- cadherin重新表达能抑制肝癌细胞的增殖、侵袭及转移等恶性生物 学特征。 2将缺失表达 T-cadherin的HepG2细胞和转染后表达 T-cadherin的HepG2细胞于皮下接 种裸鼠,在裸鼠肝癌模型上进一步证实T- cadherin基因的肿瘤抑制基因功能 3.研究T- cadherin基因在肝癌中肿瘤抑制功能的分子机制。证实是否 T-cadherin在肝癌 细胞株存在与在C6细胞中一致的分子机制,即 T-cadherin分子通过诱导P21 CIPI/wAF1表达致使肝癌细胞于细胞周期G2期阻滞 二、在临床切除的肝癌标本中研究 T-cadherin基因失活与肝癌恶性分化程度、转移及复 发等恶性生物学特征的关系,在人肝癌中揭示 T-cadherin基因失活与肝癌的恶性生物学 特征及预后的关系。 1.研究50例临床手术切除的肝癌标本及癌周肝组织中 T-cadherin的表达,揭示 T-cadherin基因表达水平(失活)与肝癌恶性分化程度、肝内转移(包括合并门静脉癌 栓和卫星灶形成)的关系 2.结合临床病案记录,选择在临床分期、病理类型及治疗方法上具有可比性的肝癌 病例,分别选取肝癌切除术后半年内复发或肝外转移以及2年内未复发或肝外转移的肝 癌病例的石蜡标本各20例,研究T- cadherin基因的表达,揭示 T-cadherin基因表达水平 (失活)与肝癌复发和转移的关系 三、在肝癌细胞株和裸鼠肝癌种植模型上证实去甲基化药物5-aza-2- deoxycytidine是否 能重新诱导T- cadherin表达,并抑制肝癌细胞的增殖、侵袭及转移等恶性生物学特征, 观察其对肝癌的治疗价值和可能的毒副作用。 3、拟采取的研究方案及可行性分析 研究T- cadherin(T-cad)在肝癌中的基因功能的技术路线 1.构建T-cad表达载体 pCDNA3.T-cad 版本1009485
国家自然科学基金申请书 第 9 页 版本 1.009.485 1.将 T-cadherin 基因导入缺失表达 T-cadherin 的肝癌细胞株 HepG2，使其表达 T-cadherin 分子，研究表达 T-cadherin 分子的肝癌细胞的增殖、侵袭及转移等恶性生物学特征的 变化，证实是否 T-cadherin 重新表达能抑制肝癌细胞的增殖、侵袭及转移等恶性生物 学特征。 2.将缺失表达 T-cadherin 的 HepG2 细胞和转染后表达 T-cadherin 的 HepG2 细胞于皮下接 种裸鼠，在裸鼠肝癌模型上进一步证实 T-cadherin 基因的肿瘤抑制基因功能。 3．研究 T-cadherin 基因在肝癌中肿瘤抑制功能的分子机制。证实是否 T-cadherin 在肝癌 细胞株存在与在 C6 细胞中一致的分子机制，即 T-cadherin 分子通过诱导 P21 CIP1/WAF1 表达致使肝癌细胞于细胞周期 G2 期阻滞。 二、在临床切除的肝癌标本中研究 T-cadherin 基因失活与肝癌恶性分化程度、转移及复 发等恶性生物学特征的关系，在人肝癌中揭示 T-cadherin 基因失活与肝癌的恶性生物学 特征及预后的关系。 1.研究 50 例临床手术切除的肝癌标本及癌周肝组织中 T-cadherin 的表达，揭示 T-cadherin 基因表达水平（失活）与肝癌恶性分化程度、肝内转移（包括合并门静脉癌 栓和卫星灶形成）的关系。 2.结合临床病案记录，选择在临床分期、病理类型及治疗方法上具有可比性的肝癌 病例，分别选取肝癌切除术后半年内复发或肝外转移以及 2 年 内未复发或肝外转移的肝 癌病例的石蜡标本各 20 例，研究 T-cadherin 基因的表达，揭示 T-cadherin 基因表达水平 （失活）与肝癌复发和转移的关系。 三、在肝癌细胞株和裸鼠肝癌种植模型上证实去甲基化药物 5-aza-2’-deoxycytidine 是否 能重新诱导 T-cadherin 表达，并抑制肝癌细胞的增殖、侵袭及转移等恶性生物学特征， 观察其对肝癌的治疗价值和可能的毒副作用。 3、拟采取的研究方案及可行性分析 一、研究 T-cadherin（T-cad）在肝癌中的基因功能的技术路线 1.构建 T-cad 表达载体 pcDNA3.T-cad
国家自然科学基金申请书 以脂质体 lipofectin为载体转染肝癌细胞系HepG2细胞 以G418筛选表达T-cad分子的阳性克隆 Western blot鉴定转染后T-cad蛋白表达 比较表达T-cad的阳性克隆与不表达T-cad的肝癌细胞的生物学特征 细胞增殖计数 诅标胸腺嘧啶摄取率测定 克隆增殖试验 细胞粘附试验 细胞聚集试验 2.在裸鼠肝癌模型上观察T-cad阳性克隆与不表达T-cad的肝癌细胞的生 物学特征 a.裸鼠皮下分别接种10T- cadherin(+)或(-)的肝癌细胞(各 20只) b.观察:肿瘤生长速度 肿瘤转移发生的时间、累及积器官及频率 裸鼠的生存期 3.研究T- cadherin基因在肝癌中肿瘤抑制功能的分子机制 a.流式细胞仪检测表达T- cadherin阳性和阴性的肝癌细胞的细胞 周期变化 b. Western blot检测细胞周期调控蛋白p53,p21,p27, cyclin D的 表达变化 C.研究是否 T-cadherin分子在肝癌中同样存在诱导P2lCIP/WAF1 表达致使肝癌细胞于细胞周期G2期阻滞的分子机制。 研究T- cadherin基因失活与临床肝癌恶性分化程度、转移及复发等恶性生物学特征 的关系的技术路线 1.收集临床手术切除的肝癌标本及癌周肝组织各50例 第10页 版本1.009485
国家自然科学基金申请书 第 10 页 版本 1.009.485 ↓ 以脂质体 lipofectin 为载体转染肝癌细胞系 HepG2 细胞 ↓ 以 G418 筛选表达 T-cad 分子的阳性克隆 ↓ Western blot 鉴定转染后 T-cad 蛋白表达 ↓ 比较表达 T-cad 的阳性克隆与不表达 T-cad 的肝癌细胞的生物学特征: 细胞增殖计数 3H 标胸腺嘧啶摄取率测定 克隆增殖试验 细胞粘附试验 细胞聚集试验 2.在裸鼠肝癌模型上观察T-cad阳性克隆与不表达T-cad的肝癌细胞的生 物学特征 a.裸鼠皮下分别接种 10 7 T-cadherin（+）或（-）的肝癌细胞（各 20 只） b.观察：肿瘤生长速度 肿瘤转移发生的时间、累及积器官及频率 裸鼠的生存期 3.研究 T-cadherin 基因在肝癌中肿瘤抑制功能的分子机制 a.流式细胞仪检测表达 T-cadherin 阳性和阴性的肝癌细胞的细胞 周期变化 b.Western blot 检测细胞周期调控蛋白 p53,p21,p27,cyclin D 的 表达变化 c.研究是否 T-cadherin 分子在肝癌中同样存在诱导 P21 CIP1/WAF1 表达致使肝癌细胞于细胞周期 G2 期阻滞的分子机制。 二、研究 T-cadherin 基因失活与临床肝癌恶性分化程度、转移及复发等恶性生物学特征 的关系的技术路线 1.收集临床手术切除的肝癌标本及癌周肝组织各 50 例