申请代码 C030306 受理部门 收件日期: 受理编号 解除保护 国家自然科学基金 申请书 资助类别:面上项目 亚类说明:地区科学基金项目 附注说明: 项目名称:广西平果、大化两县壮族儿童原发性肾病综合征相关基因表达 谱的绘制 申请者:刘运广 电话:0776-2848023 依托单位:右江民族医学院 通讯地址:广西百色市城乡路98号 邮政编码:533000 单位电话:0776-2846532 电子邮件:lyg92260163.com 申报日期: 200年3月20日 国家自然科学基金委员会
申请代码： C030306 受理部门： 收件日期： 受理编号： 解除保护 国家自然科学基金 申 请 书 资助类别：面上项目 亚类说明：地区科学基金项目 附注说明： 项目名称：广西平果、大化两县壮族儿童原发性肾病综合征相关基因表达 谱的绘制 申 请 者：刘运广 电话： 0776-2848023 依托单位：右江民族医学院 通讯地址：广西百色市城乡路 98 号 邮政编码：533000 单位电话：0776-2846532 电子邮件：lyg9226@163.com 申报日期： 2004 年 3 月 20 日 国家自然科学基金委员会
国家自然科学基金申请书 基本信息 姓名刘运广 性别|男年月192年7月民族汉族 申请者 位硕士 职称教授 主要研究领域|小儿肾脏疾病 话|0776-2848023 电子邮件1yg92260163.com 真0776-2848653 个人网页 信 息工作单位右江民族医学院 在研项目批准号 名称有江民族医学院 代码5330001 位 联系人梁丽艳 电子邮件yehxwgf229@sina.com 信息一合作单位 电话|07762846532 网站地址Ihttp://www.ymcn.gx.cn 单位名称 代码 单中南大学 41008301 信「[在此录入修改 项目名称西平果、大化两县壮族儿童原发性肾病综合征相关基因表达谱的绘制 项目基本 资助类别面上项目 亚类说明地区科学基金项目 附注说明 申请代码c030306:儿科学 信 基地类别 惠[预计研究年限2051年1月-20701月研究属性基础研究 申请经费25.5000万元 项目研究内容和意义简介(限400字):利用基因芯片技术检测广西平果、大化两县壮族儿 童原发性肾病综合征(PNS)外周血单个核细胞(PBMC)及肾组织基因表达谱的变化,观察 摘其与正常壮族儿童及不同地区汉族PS儿童基因表达谱的差异,探讨壮族儿童PS致病相 关基因在PNS发生、发展、病理改变以及对激素的治疗反应中的作用。为建立肾脏相关基 因表达数据库和绘制肾脏相关基因作用通路或网图进一步寻找各种病理条件下的基因标志 提供资料,并为探讨在PNS发生发展中起关键作用的基因予以特异性治疗提供理论依据。 关键词(用分号分开,最多5个)原发性肾病综合征:儿童:壮族:;基因芯片:汉族 版本1014348
国家自然科学基金申请书 第 2 页 版本 1.014.348 基本信息 yoKWT/OQ 申 请 者 信 息 姓 名 刘运广 xingming 性别 男 出生 年月 1962 年 7 月 民 族 汉族 学 位 硕士 职称 教授 主要研究领域 小儿肾脏疾病 电 话 0776-2848023 电子邮件 lyg9226@163.com 传 真 0776-2848653 个 人 网 页 工 作 单 位 右江民族医学院 在研项目批准号 依 托 单 位 信 息 名 称 右江民族医学院 代 码 53300001 联 系 人 梁丽艳 电子邮件 yehxwgf2229@sina.com 电 话 0776-2846532 网站地址 http://www.ymcn.gx.cn 合 作 单 位 信 息 单 位 名 称 代 码 中南大学 41008301 [在此录入修改] 项 目 基 本 信 息 项目名称 广西平果、大化两县壮族儿童原发性肾病综合征相关基因表达谱的绘制 资助类别 面上项目 亚 类 说 明 地区科学基金项目 附注说明 申请代码 C030306:儿科学 基地类别 预计研究年限 2005 年 1 月 — 2007 年 12 月 研究属性 基础研究 申请经费 25.5000 万元 摘 要 项目研究内容和意义简介（限 400 字）：利用基因芯片技术检测广西平果、大化两县壮族儿 童原发性肾病综合征（PNS）外周血单个核细胞（PBMC）及肾组织基因表达谱的变化，观察 其与正常壮族儿童及不同地区汉族 PNS 儿童基因表达谱的差异，探讨壮族儿童 PNS 致病相 关基因在 PNS 发生、发展、病理改变以及对激素的治疗反应中的作用。为建立肾脏相关基 因表达数据库和绘制肾脏相关基因作用通路或网图进一步寻找各种病理条件下的基因标志 提供资料，并为探讨在 PNS 发生发展中起关键作用的基因予以特异性治疗提供理论依据。 关 键 词(用分号分开，最多 5 个) 原发性肾病综合征；儿童；壮族；基因芯片；汉族
国家自然科学基金申请书 项目组主要成员(杰出青年科学基金不填此栏 出生年月性别职称学位 单位名称 电话 电子邮件 项目分工作时间 (月) 黄瑞雅 1951-1-25男|教授 学士右江民族医学院 077284819216cm 参与课题设 计实验测试 张建江 19男博土生学中南太学22(y8 3林娜 1969-12-12女主治医师硕士右江民族医学院 lyg92260163.com 收集标本 耿文茂 1978-10- 男硕士生学士中南大学 5陈霞静 1966-10-8女主治医师学士右江民族医学院 0776-28371y89226163.com 收集标本 6黄月艳 1970-2-26女主治医师硕士右江民族医学院 0776-283671y89226163.com 收集标本 7汤茜 1975-2-13女主治医师学士右江民族医学院 712836719163m0 收集标本 8陆小婶 1969-4-12女主管技师学士右江民族医学院 0776-284071yg9226163.com 实验测试 9何印蕾 1971-9-15女主管技师学士右江民族医学院 0776-2840 lyg9226@163.com 实验测试 总人数 高级 中级 初级 博士后 博士生 硕士生 说明:1.高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生人员数由申请者负责填报,总人数自动生成。 2.项目组主要成员不包括项目申请者
国家自然科学基金申请书 第 3 页 版本 1.014.348 项目组主要成员(杰出青年科学基金不填此栏) 编号 姓 名 出生年月 性别 职 称 学 位 单位名称 电话 电子邮件 项目分工 每年工 作时间 （月） 1 黄瑞雅 1951-11-25 男 教授 学士 右江民族医学院 0776-28488 02 lyg9226@163.com 参与课题设 计实验测试 8 2 张建江 1972-10-13 男 博士生 学士 中南大学 0731-55242 22-2261 csuxyyzw@hotmail.com 收集标本与 实验测试 8 3 林娜 1969-12-12 女 主治医师 硕士 右江民族医学院 0776-28367 45 lyg9226@163.com 收集标本 8 4 耿文茂 1978-10-30 男 硕士生 学士 中南大学 0731-55242 22-2261 csuxyyzw@hotmail.com 收集标本与 实验测试 8 5 陈霞静 1966-10-8 女 主治医师 学士 右江民族医学院 0776-28367 45 lyg9226@163.com 收集标本 7 6 黄月艳 1970-2-26 女 主治医师 硕士 右江民族医学院 0776-28367 45 lyg9226@163.com 收集标本 7 7 汤茜 1975-2-13 女 主治医师 学士 右江民族医学院 0776-28367 45 lyg9226@163.com 收集标本 7 8 陆小婵 1969-4-12 女 主管技师 学士 右江民族医学院 0776-28407 03 lyg9226@163.com 实验测试 7 9 何印蕾 1971-9-15 女 主管技师 学士 右江民族医学院 0776-28407 03 lyg9226@163.com 实验测试 7 总人数 高级 中级 初级 博士后 博士生 硕士生 11 2 6 1 1 1 说明: 1. 高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生人员数由申请者负责填报，总人数自动生成。 说明: 2. 项目组主要成员不包括项目申请者
国家自然科学基金申请书 经费申请表 (金额单位:万元) 科目 申请经费 备注(计算依据与说明) 研究经费 23.5000 1.科研业务费 4.5000 (1)测试/计算/分析费 1.5000大型仪器使用费 (2)能源/动力费 (3)会议费/差旅费 2500于出席学术交流会 (4)出版物/文献/信息传播费 0.5000论文发表 (5)其它 2.实验材料费 16.0000 (1)原材料/试剂/药品购置费 14.500购试剂盒、基因芯片,RNM提取 (2)其它 1.5000正常儿童标本采集费 3.仪器设备费 0.0000 (1)购置 0.0000 (2)试制 4.实验室改装费 0.0000 5.协作费 3.0000科研合作相关费用 因际合作与交流费 0.0000 1.项目组成员出国合作交流 2.境外专家来华合作交流 劳务费 1.0000科研劳务补贴费 四.管理费 1.0000科研管理费 合计 25.5000 国家其他计划资助经费 与本项目相关的 其他经费资助(含部门匹配) 其他经费来源 其他经费来源合计 0.0000 版本1014348
国家自然科学基金申请书 第 4 页 版本 1.014.348 经费申请表 （金额单位：万元） 科目 申请经费 备注（计算依据与说明） 一.研究经费 23.5000 1.科研业务费 4.5000 （1）测试/计算/分析费 1.5000 大型仪器使用费 （2）能源/动力费 （3）会议费/差旅费 2.5000 用于出席学术交流会 （4）出版物/文献/信息传播费 0.5000 论文发表 （5）其它 2.实验材料费 16.0000 （1）原材料/试剂/药品购置费 14.5000 购试剂盒、基因芯片，RNA 提取 （2）其它 1.5000 正常儿童标本采集费 3.仪器设备费 0.0000 （1）购置 0.0000 （2）试制 4.实验室改装费 0.0000 5.协作费 3.0000 科研合作相关费用 二.国际合作与交流费 0.0000 1.项目组成员出国合作交流 2.境外专家来华合作交流 三.劳务费 1.0000 科研劳务补贴费 四.管理费 1.0000 科研管理费 合 计 25.5000 与本项目相关的 其他经费来源 国家其他计划资助经费 其他经费资助（含部门匹配） 其他经费来源合计 0.0000
国家自然科学基金申请书 杳看报告正文撰写提纲 报告正文 (一)立项依据与研究内容(4000-8000字): 1.项目的立项依据(研究意义、国内外研究现状及分析,附主要参考文献目录。) 原发性肾病综合征( Primary Nephrotic Syndrome,PNS)是一组以大量蛋白尿、低蛋白血症、 高脂血症及不同程度的水肿为特征的临床症候群,是小儿最常见的泌尿系统疾病之一,国外有资料 报告,16岁以下人口中每年有2-7/10万新病例发生,1968年 Schlesinger自美国报告16岁以下人 口中PN年发生率为2/10万,累积结果为每10万小儿中有15.7例或相当于每6000小儿中有1名 患者,我国尚缺乏类似报告。 PS的病因和发病机制尚不清楚,使其治疗缺乏特异性和明确的方向。近年来,随着人类基因 组计划的进行,人们越来越多地认识到PNS的发生发展及治疗反应和预后与遗传背景相关,PNS的 发生涉及一个以上的基因以及基因与环境因素的相互作用,肾脏致病基因的研究已成为当今的热 点,筛选PNS的发生发展中起关键作用的基因,并给予特异性干预,对于治疗PNS具有重要意义 肾脏在不同的生理条件下都有多个基因表达,这些基因作为一个统一的整体进行调节,各基因 在细胞分化、个体发育过程中保持高度时间、空间、表达量的协调性,并可能按照一定的时间顺序 组成基因表达通路或基因调节网络,在这条通路或网络上可能有一条或数条起关键作用的基因,利 用基因芯片高通量、平行分析的优点可以帮助我们绘制肾脏相关基因作用通路或网图,并可进一步 分析病理条件下此通路或网图的变化及其中几个起关键作用的异常基因,而其他基因的异常表达是 继发于关键基因的异常表达,这有助于从基因水平揭示疾病的发生本质。 在PNS研究较多的是人类的白细胞抗原(HA)基因,由于不同人种间HA抗原分布有差异,有 些抗原具有人种特异性,因此与PNS有关的HA基因在不同人种检出情况不同。利用PCR和特异性 的寡核苷酸方法研究表明,上海地区小儿激素敏感型PNS与HA-DRB107明显相关,而HA-DRB1 09与该病的频复发相关,日本小儿激素敏感型PNS与 HLA-DQB1“0302明显相关,而0QA10103等位 基因频率明显下降,埃及小儿激素敏感型PN与HA-DQB1*0601和DRB101明显相关,法国和德 国则与HLA-DQA10201和DQB10201明显相关,而DQA10102和DQB10602等位基因频率明显下降, 而且频复发患儿与之相关性较非频复发、无复发患儿更明显。提示不同地区PN儿童对激素效应 存在基因表达的差异 血管紧张素转换酶(ACE)在肾脏疾病的发生发展中占有重要地位。血管紧张素Ⅱ被认为是肾内 的生长激素,它参与调节肾小球内血液动力学的变化,同时还可引起肾小球系膜细胞的增生和细胞 外基质的增多,这些均是导致肾小球硬化的关键因素。血管紧张素Ⅱ主要是由血管紧张素I在ACE 作用下生成。ACE在血中水平较为稳定,甚至认为与环境、代谢、激素水平及年龄无关,但却存在 个体间差异,体内50%的ACE水平变化取决于ACE基因插入(I)/缺失(D)多态性的调控,ACE基 因位于17q23,由26个外显子和25个内含子组成,ACE基因依据第16号内含子内-287碱基对的缺 失或插入而在人群中表现为D型、DI型和Ⅱ型的遗传多态性。DD型者血循环ACE水平最高,血管 紧张素Ⅱ生成最多,D型次之,而Ⅱ型者水平最低。Lee等对PNS不同病理类型患者ACE基因I/D 多态性的研究表明,微小病变组各基因型分布与正常对照组无明显差异,而局灶性节段性肾小球硬 化组D型频率显著高于微小病变组和正常对照组,而Ⅱ型频率显著降低,并且在局灶性节段性肾小 球硬化组中,DD型与DI型和Ⅱ型相比,起病年龄小,对糖皮质激素疗效差,慢性肾功能不全发生 率高。 血小板活化因子(PAF)由炎症细胞、内皮细胞和肾小球系膜细胞产生,具有广泛的生物学活性, 第5页 版本1014348
国家自然科学基金申请书 第 5 页 版本 1.014.348 查看报告正文撰写提纲 报告正文 （一）立项依据与研究内容（4000-8000 字）： 1. 项目的立项依据（研究意义、国内外研究现状及分析，附主要参考文献目录。） 原发性肾病综合征（Primary Nephrotic Syndrome , PNS）是一组以大量蛋白尿、低蛋白血症、 高脂血症及不同程度的水肿为特征的临床症候群，是小儿最常见的泌尿系统疾病之一，国外有资料 报告，16 岁以下人口中每年有 2-7/10 万新病例发生，1968 年 Sohlesinger 自美国报告 16 岁以下人 口中 PNS 年发生率为 2/10 万，累积结果为每 10 万小儿中有 15.7 例或相当于每 6000 小儿中有 1 名 患者，我国尚缺乏类似报告 [1]。 PNS 的病因和发病机制尚不清楚，使其治疗缺乏特异性和明确的方向。近年来，随着人类基因 组计划的进行，人们越来越多地认识到 PNS 的发生发展及治疗反应和预后与遗传背景相关，PNS 的 发生涉及一个以上的基因以及基因与环境因素的相互作用 [2，3]，肾脏致病基因的研究已成为当今的热 点 [4]，筛选 PNS 的发生发展中起关键作用的基因，并给予特异性干预，对于治疗 PNS 具有重要意义。 肾脏在不同的生理条件下都有多个基因表达，这些基因作为一个统一的整体进行调节，各基因 在细胞分化、个体发育过程中保持高度时间、空间、表达量的协调性，并可能按照一定的时间顺序 组成基因表达通路或基因调节网络，在这条通路或网络上可能有一条或数条起关键作用的基因，利 用基因芯片高通量、平行分析的优点可以帮助我们绘制肾脏相关基因作用通路或网图，并可进一步 分析病理条件下此通路或网图的变化及其中几个起关键作用的异常基因，而其他基因的异常表达是 继发于关键基因的异常表达，这有助于从基因水平揭示疾病的发生本质。 在 PNS 研究较多的是人类的白细胞抗原（HLA）基因，由于不同人种间 HLA 抗原分布有差异，有 些抗原具有人种特异性，因此与 PNS 有关的 HLA 基因在不同人种检出情况不同。利用 PCR 和特异性 的寡核苷酸方法研究表明，上海地区小儿激素敏感型 PNS 与 HLA-DRB1※ 07 明显相关，而 HLA-DRB1※ 09 与该病的频复发相关，日本小儿激素敏感型 PNS 与 HLA-DQB1※ 0302 明显相关，而 OQA1※ 0103 等位 基因频率明显下降 [5]，埃及小儿激素敏感型 PNS 与 HLA-DQB1※ 0601 和 DRB1※ 01 明显相关 [6]，法国和德 国则与 HLA-DQA1※ 0201 和 DQB1※ 0201 明显相关，而 DQA1※ 0102 和 DQB1※ 0602 等位基因频率明显下降， 而且频复发患儿与之相关性较非频复发、无复发患儿更明显 [7]。提示不同地区 PNS 儿童对激素效应 存在基因表达的差异。 血管紧张素转换酶（ACE）在肾脏疾病的发生发展中占有重要地位。血管紧张素Ⅱ被认为是肾内 的生长激素，它参与调节肾小球内血液动力学的变化，同时还可引起肾小球系膜细胞的增生和细胞 外基质的增多，这些均是导致肾小球硬化的关键因素。血管紧张素Ⅱ主要是由血管紧张素Ⅰ在 ACE 作用下生成。ACE 在血中水平较为稳定，甚至认为与环境、代谢、激素水平及年龄无关，但却存在 个体间差异，体内 50%的 ACE 水平变化取决于 ACE 基因插入（I）/缺失（D）多态性的调控，ACE 基 因位于 17q23，由 26 个外显子和 25 个内含子组成，ACE 基因依据第 16 号内含子内-287 碱基对的缺 失或插入而在人群中表现为 DD 型、DI 型和Ⅱ型的遗传多态性。DD 型者血循环 ACE 水平最高，血管 紧张素Ⅱ生成最多，DI 型次之，而Ⅱ型者水平最低。Lee 等 [8]对 PNS 不同病理类型患者 ACE 基因 I/D 多态性的研究表明，微小病变组各基因型分布与正常对照组无明显差异，而局灶性节段性肾小球硬 化组 DD 型频率显著高于微小病变组和正常对照组，而Ⅱ型频率显著降低，并且在局灶性节段性肾小 球硬化组中，DD 型与 DI 型和Ⅱ型相比，起病年龄小，对糖皮质激素疗效差，慢性肾功能不全发生 率高。 血小板活化因子（PAF）由炎症细胞、内皮细胞和肾小球系膜细胞产生，具有广泛的生物学活性
国家自然科学基金申请书 是引起肾损害的一个重要炎症介质。PAF通过对白细胞及补体的激活、刺激肾小球系膜细胞产生前 列腺素和氧自由基等参与肾损伤、并通过增加血管通透性而引起蛋白尿。PAF分解酶基因位于第6 号染色体短臂,其依据第9号外显子的点突变(G994T)而在人群中表现为GG型、GT型和TT型的 遗传多态性。其中G型者血中PAF分解釀浓度最高,GT型者较GG型者下降50%,而T型者PAF分 解酶浓度几乎为零,对激素敏感型PN惠者的研究发现,虽然PAF分解酶的基因多态性与激素敏 感型PNs的易感性无明显关联,但GT型者临床上第一年复发次数明显高于GG型,因此认为进行PAF 分解酶基因多态性检测可预测激素敏感型PNS患者的复发情况 以上的研究提示,在人群中PNS某类基因多态性与其易感性、疾病的进展、病理类型、治疗反 应等有关,不同基因突变在不同种族或民族及地域之间差异性在PNS的发生发展中起重要作用。我 们的前期工作以PN患儿的PBMc为研究对象,利用基因芯片技术对10例汉族PNS患儿进行基因的 筛选,共发现418条差异表达基因与PNS发病有关,这些基因涉及到免疫、物质代谢、细胞信号传 递、周期调节、增殖、凋亡、细胞骨架和运动、DNA合成、修复、转录等多方面,认为PNs的发生 发展是具有不同功能的多个基因相互作用的结果。迄今不同民族PNs的基因筛选国内外未见有资 料报道,这些基因在不同民族PNS的发生发展中起何作用亦未明了,有进一步深入研究的必要。广 西是全国唯一的壮族人群聚居地,是国家西部大开发的省区,全区人口为4751.2万,壮族为15088 万,近年来我们对广西平果、大化两县儿童PNS的研究统计资料表明,两县儿童PN的发生率高, 平果县年发生率为28/10万,其中壮族儿童年发生率为27/10万,汉族年发生率为1/10万;大化县 年发生率为23/10万,壮族年发生率为23/10万,汉族年发生率为0,可见壮族儿盦PNs发生率明 显高于汉族儿童。两者发病率的差异是否预示某种或某类基因差异导致壮族儿童PNS的发病率显著 增高,目前尚无研究报道 综上所述,PS的发生、发展,转归及对激素效应存在民族与地区差异,而基因的突变、缺失 多态性及表达的差异则是导致此现象发生的根源。为此,本课题在我们前期研究的基础上,利用我 区丰富的少数民族儿童PN资源的优势,对广西平果、大化两县壮族儿童Ps患儿,运用基因芯片 技术,进行PBMC和肾组织的基因筛选,并与正常壮、汉儿童比较,探讨壮、汉两民族PNS患儿基因 表达谱的差异,为进一步探索壮族儿童PN的高发的原因、发病机制以及在PNs的发生发展中起关 键作用的基因,为建立肾脏相关基因表达数据库和绘制肾脏相关基因作用通路或网图进一步寻找各 种病理条件下的基因标志,从而为开发诊断基因芯片提供资料,下一步将研究其生活习俗、环境与 PNS的关系,为从根本上治疗PNS、保护儿童健康、提高人口素质具有重大意义,将产生广泛的社会 效益和经济效益 参考文献 1、杨霖文肾病综合征临床诊治及研究中的几点思考中华儿科杂志,2000,38(5):280-281. 2、王海燕,张宏遗传性肾小球疾病的分子遗传学研究进展及我们面临的机遇和挑战——欣闻人类 基因组计划完成后的思考.中华肾脏病杂志,2003,19(5):271-273 3、易著文,马祖祥,吴小川,等.原发性肾病综合征相关基因的筛选.中华儿科杂志,2002,40(12): 724-727 4、张建江,易著文试论小儿肾脏病研究的发展方向医学与哲学,2002,23(11):48-50 5. Abe KK, Michinaga I, Hiratsuka T, et al. Association of DQB1 0302 alloantigens in Japanese Pediatric Patients with Steroid-sensitive Nephrotic 版本1014348
国家自然科学基金申请书 第 6 页 版本 1.014.348 是引起肾损害的一个重要炎症介质。PAF 通过对白细胞及补体的激活、刺激肾小球系膜细胞产生前 列腺素和氧自由基等参与肾损伤、并通过增加血管通透性而引起蛋白尿。PAF 分解酶基因位于第 6 号染色体短臂，其依据第 9 号外显子的点突变（G994T）而在人群中表现为 GG 型、GT 型和 TT 型的 遗传多态性。其中 GG 型者血中 PAF 分解酶浓度最高，GT 型者较 GG 型者下降 50%，而 TT 型者 PAF 分 解酶浓度几乎为零，对激素敏感型 PNS 患者的研究发现 [8]，虽然 PAF 分解酶的基因多态性与激素敏 感型 PNS 的易感性无明显关联，但 GT 型者临床上第一年复发次数明显高于 GG 型，因此认为进行 PAF 分解酶基因多态性检测可预测激素敏感型 PNS 患者的复发情况。 以上的研究提示，在人群中 PNS 某类基因多态性与其易感性、疾病的进展、病理类型、治疗反 应等有关，不同基因突变在不同种族或民族及地域之间差异性在 PNS 的发生发展中起重要作用。我 们的前期工作以 PNS 患儿的 PBMC 为研究对象，利用基因芯片技术对 10 例汉族 PNS 患儿进行基因的 筛选，共发现 418 条差异表达基因与 PNS 发病有关，这些基因涉及到免疫、物质代谢、细胞信号传 递、周期调节、增殖、凋亡、细胞骨架和运动、DNA 合成、修复、转录等多方面，认为 PNS 的发生 发展是具有不同功能的多个基因相互作用的结果 [3]。迄今不同民族 PNS 的基因筛选国内外未见有资 料报道，这些基因在不同民族 PNS 的发生发展中起何作用亦未明了，有进一步深入研究的必要。广 西是全国唯一的壮族人群聚居地，是国家西部大开发的省区，全区人口为 4751.2 万，壮族为 1508.8 万，近年来我们对广西平果、大化两县儿童 PNS 的研究统计资料表明，两县儿童 PNS 的发生率高， 平果县年发生率为 28/10 万，其中壮族儿童年发生率为 27/10 万，汉族年发生率为 1/10 万；大化县 年发生率为 23/10 万，壮族年发生率为 23/10 万，汉族年发生率为 0，可见壮族儿童 PNS 发生率明 显高于汉族儿童。两者发病率的差异是否预示某种或某类基因差异导致壮族儿童 PNS 的发病率显著 增高，目前尚无研究报道。 综上所述，PNS 的发生、发展，转归及对激素效应存在民族与地区差异，而基因的突变、缺失、 多态性及表达的差异则是导致此现象发生的根源。为此，本课题在我们前期研究的基础上，利用我 区丰富的少数民族儿童 PNS 资源的优势，对广西平果、大化两县壮族儿童 PNS 患儿，运用基因芯片 技术，进行 PBMC 和肾组织的基因筛选，并与正常壮、汉儿童比较，探讨壮、汉两民族 PNS 患儿基因 表达谱的差异，为进一步探索壮族儿童 PNS 的高发的原因、发病机制以及在 PNS 的发生发展中起关 键作用的基因，为建立肾脏相关基因表达数据库和绘制肾脏相关基因作用通路或网图进一步寻找各 种病理条件下的基因标志，从而为开发诊断基因芯片提供资料，下一步将研究其生活习俗、环境与 PNS 的关系，为从根本上治疗 PNS、保护儿童健康、提高人口素质具有重大意义，将产生广泛的社会 效益和经济效益。 参考文献 1、杨霖文.肾病综合征临床诊治及研究中的几点思考.中华儿科杂志，2000，38（5）：280-281. 2、王海燕，张宏.遗传性肾小球疾病的分子遗传学研究进展及我们面临的机遇和挑战——欣闻人类 基因组计划完成后的思考.中华肾脏病杂志，2003，19（5）：271-273. 3、易著文，马祖祥，吴小川，等.原发性肾病综合征相关基因的筛选.中华儿科杂志，2002，40（12）： 724-727. 4、张建江，易著文.试论小儿肾脏病研究的发展方向.医学与哲学，2002，23（11）：48-50. 5、Abe KK , Michinaga I ,Hiratsuka T ,et al. Association of DQB1※ 0302 alloantigens in Japanese Pediatric Patients with Steroid-sensitive Nephrotic
国家自然科学基金申请书 Syndrome. Nephron, 1995, 70(1): 28-34. 6, Bakr AM, El-Chenawy F. HAL-DQBl and DQBl alleles in Eygptian Children with Steroidsensitive Nephrotic Syndrome. Pediatr Nephrol, 1998, 12( 3): 234-237. 7. Haeffner A, Abbal M, Mytilineosj, et al. oligotyping for HLA-DQB in idiopathic 8 Lee Dy, Kim W, Kang SK, eta l Angiotensin-converting enzyme gene polymorphism in patients with minimal-change nephritic syndrome and focal segmental glomerulosclerosis. Nephron. 1997,77(4):471-473 9, Xu H, Iijima K, Tanaka SSR, et al. Platelet-activating factor acety hydrolase gene mutation in Japanese nephrotic syndrome. Kidney Int, 1998, 54(6): 1867-1871. 2、项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键问题: (1)研究内容: ①比较壮族PNS患儿与汉族PN及正常壮、汉族儿童外周血单个核细胞(PBMC)及 肾组织的基因表达谱变化,筛选PNS相关基因; ②比较壮、汉两组民族PNS的相关基因与其病理类型、治疗反应的关系。 (2)研究目标 ①阐明壮族Ps患儿发病的相关基因及其在PNS发生发展中的作用 ②揭示壮、汉两民族PNs患儿基因表达谱的差异,绘制广西平果、大化两县壮族儿 童原发性肾病综合征相关基因的表达谱。 (3拟解决的关键问题 壮族PNS患儿致病相关基因在壮族儿童PNS发生发展中的作用及与其病理类型、治 疗反应的关系。 3、拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析 (1)研究方法: ①祖辈三代以上均为壮族的初治PNs患儿15例 ②祖辈三代以上均为壮族的健康儿童15例; ③祖辈三代以上均为汉族的初治PNs患儿15例; ④祖辈三代以上均为汉族的健康儿童15例; 第7页 版本1014348
国家自然科学基金申请书 第 7 页 版本 1.014.348 Syndrome.Nephron ,1995,70(1):28-34. 6 、 Bakr AM , El-Chenawy F. HAL-DQB1 and DQB1 alleles in Eygptian Children with Steroidsensitive Nephrotic Syndrome. Pediatr Nephrol ,1998,12(3):234-237. 7、Haeffner A , Abbal M, Mytilineos J , et al. Oligotyping for HLA-DQB in idiopathic Nephrotic Syndrome. Pediatr Nephrol , 1997 ,11(3):291-295. 8、Lee Dy, Kim W ,Kang SK,eta l.Angiotensin-converting enzyme gene polymorphism in patients with minimal-change nephritic syndrome and focal segmental glomerulosclerosis. Nephron. 1997 ,77(4):471-473. 9、Xu H , Iijima K , Tanaka SSR ,et al.Platelet-activating factor acetylhydrolase gene mutation in Japanese nephrotic syndrome. Kidney Int, 1998,54(6):1867-1871. 2、项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键问题： ⑴研究内容： ①比较壮族 PNS 患儿与汉族 PNS 及正常壮、汉族儿童外周血单个核细胞（PBMC）及 肾组织的基因表达谱变化，筛选 PNS 相关基因； ②比较壮、汉两组民族 PNS 的相关基因与其病理类型、治疗反应的关系。 ⑵研究目标 ①阐明壮族 PNS 患儿发病的相关基因及其在 PNS 发生发展中的作用； ②揭示壮、汉两民族 PNS 患儿基因表达谱的差异，绘制广西平果、大化两县壮族儿 童原发性肾病综合征相关基因的表达谱。 ⑶拟解决的关键问题 壮族 PNS 患儿致病相关基因在壮族儿童 PNS 发生发展中的作用及与其病理类型、治 疗反应的关系。 3、拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析 ⑴研究方法： ①祖辈三代以上均为壮族的初治 PNS 患儿 15 例； ②祖辈三代以上均为壮族的健康儿童 15 例； ③祖辈三代以上均为汉族的初治 PNS 患儿 15 例； ④祖辈三代以上均为汉族的健康儿童 15 例；
国家自然科学基金申请书 ⑤PNS患儿均在采取PBMC后行肾穿活检病理检查(包括电镜),明确病理类型,并 作相关基因检测; 无肾脏疾病史的肾脏意外伤患者肾组织基因检测(壮、汉族各15例); ⑦观察PNS相关基因与病理类型的关系; ⑧标准肾上腺皮质激素治疗反应与相关基因的关系 (2)技术路线 具体技术路线见下图: 平果、大化两县 湖南地区 壮族儿童 汉族儿童 正常儿童 PNS儿童 外周血及意外 伤患者肾组织静脉血 肾活检 病理改变 mRNA 比较病理改变、疗效 与基因表达谱改变的关系 基因芯片 RT-PCR 验证基因芯片的可靠性 (3)实验方案: ①PBM的分离:采用 Ficoll- Hypaque淋巴细胞分离液密度梯度离心法,分别分离 壮、汉两民族PN患儿和壮、汉两民族正常儿童的PBMC,并分别将分离出的PBMC和肾 版本1014348
国家自然科学基金申请书 第 8 页 版本 1.014.348 ⑤PNS 患儿均在采取 PBMC 后行肾穿活检病理检查（包括电镜），明确病理类型，并 作相关基因检测； ⑥无肾脏疾病史的肾脏意外伤患者肾组织基因检测（壮、汉族各 15 例）； ⑦观察 PNS 相关基因与病理类型的关系； ⑧标准肾上腺皮质激素治疗反应与相关基因的关系 。 ⑵技术路线 具体技术路线见下图： 平果、大化两县 湖南地区 壮族儿童 汉族儿童 正常儿童 PNS 儿童 外周血及意外 伤患者肾组织 静脉血 肾活检 病理改变 mRNA 比较病理改变、疗效 与基因表达谱改变的关系 基因芯片 RT-PCR 验证基因芯片的可靠性 ⑶实验方案： ①PBMC 的分离：采用 Ficoll-Hypaque 淋巴细胞分离液密度梯度离心法，分别分离 壮、汉两民族 PNS 患儿和壮、汉两民族正常儿童的 PBMC，并分别将分离出的 PBMC 和肾
国家自然科学基金申请书 活检组织立即置液氮中贮存备用; ②总RNA抽提及鉴定:采用Triz01一步法抽提PBMC和肾组织中的总RNA,抽提的总 RNA用分光光度法检测其量和纯度; ③cDNA探针标记按基因芯片说明书进行。分别取100g壮族和汉族PNs息儿及正 常壮族和汉族儿童总RNA,以Cy3-dCTP标记正常对照组(壮、汉)PBMC和肾活检组织 的mNA,Cy5dCTP标记壮汉族PNs患者PBMC和肾活检组织的mRNA,分别得到Cy3-cDMA 和Cy5-dDNA探针。 ④预杂交、杂交及洗涤,按照基因芯片杂交试剂盒说明书进行,先将经95℃变性的表达 谱芯片和预杂交液混合,在42℃下预杂交5-6h,以封闭一些非特异性信号,降低它们 的干扰,再将上述用Cy3和Cy5标记的 CDNA探针经95℃变性后,加到已预杂交的芯片 上,在42℃下杂交16-18h,然后按顺序用2×SSC+0.2%DS、0.1%XSSC+0.2%SDS、0.1% ×SSC洗涤10分钟,室温晾干。用Axon公司的 GenePix piX4000B扫描仪扫描芯片、 观察扫描结果。用Axon公司的 GenePix pro3.0软件分析Cy3、Cy5荧光信号强度,计 算Cy5/C3值,阳性结果判断:Cy5/Cy3≥3为该基因在PNS患者PBMC中表示增强 Cy5/Cy3≤0.3为该基因在PN者PBMC中表达减弱 (4)可行性分析 ①课题负责人及课题组多年从事儿童肾脏疾病的研究,有良好的科研素质和理论基 础 ②广西为全国唯一的壮族人群聚居地,平果、大化两县壮族儿童PNS发病率高(平果 县壮族儿童年发生率为27/10万,大化县为23/10万),我院所在地百色市的两所附属 医院均为三级甲等医院,每年收治来自平果、大化两县的壮族儿童PN有较多的病例数, 并常年开展肾穿活检术; ③合作单位中南大学湘雅二医院多年开展肾脏的分子生物学的研究、熟练掌握了实验 技术方法,所需仪器设备均已具备。 ④指导者中南大学湘雅二医院儿科易著文教授,为博士生导师,湖南省“十五”重点 学科儿科学学科带头人,湖南省小儿肾脏病临床中心主任、中华医学会儿科学会常务委 员、儿肾学组副组长、国际小儿肾脏病学会会员、《中华儿科杂志》《国外医学儿科学 分册》、《中国实用儿科杂志》、《临床儿科杂志》、《小儿急救医学》、《中国医师杂志》 《医学临床研究》《循证医学》等杂志常务编委,《中国当代儿科杂志》副主编,主持 过多项有关肾脏疾病国家自然科学基金、卫生部科研基金、湖南省自然科学基金课题、 近五年发表相关科研论文近60余篇,出版专著10部,获省级以上成果奖6项,具有丰 富的临床、教学、科研经验。本课题已取得易教授同意作为课题指导,以保证课题顺利 开展和完成。(附件1易教授指导同意书)。 4、本项目的特色与创新之处 ①首次运用基因芯片技术对壮族PNS患儿进行相关基因的筛选,并与汉族对比,探索 不同民族PNS的相关基因表达; 版本1014348
国家自然科学基金申请书 第 9 页 版本 1.014.348 活检组织立即置液氮中贮存备用； ②总 RNA 抽提及鉴定：采用 Trizol 一步法抽提 PBMC 和肾组织中的总 RNA，抽提的总 RNA 用分光光度法检测其量和纯度； ③cDNA 探针标记 按基因芯片说明书进行。分别取 100μg 壮族和汉族 PNS 患儿及正 常壮族和汉族儿童总 RNA，以 Cy3-dCTP 标记正常对照组（壮、汉）PBMC 和肾活检组织 的 mRNA，Cy5-dCTP 标记壮、汉族 PNS 患者 PBMC 和肾活检组织的 mRNA，分别得到 Cy3-cDNA 和 Cy5-dDNA 探针。 ④预杂交、杂交及洗涤,按照基因芯片杂交试剂盒说明书进行,先将经 95℃变性的表达 谱芯片和预杂交液混合，在 42℃下预杂交 5-6h，以封闭一些非特异性信号，降低它们 的干扰，再将上述用 Cy3 和 Cy5 标记的 cDNA 探针经 95℃变性后，加到已预杂交的芯片 上，在 42℃下杂交 16-18h，然后按顺序用 2×SSC+0.2%SDS、0.1%×SSC+0.2%SDS 、0.1% ×SSC 洗涤 10 分钟，室温晾干。用 Axon 公司的 GenePix PiX4000B 扫描仪扫描芯片、 观察扫描结果。用 Axon 公司的 GenePix Pro3.0 软件分析 Cy3、Cy5 荧光信号强度，计 算 Cy5/ Cy3 值，阳性结果判断：Cy5/ Cy3≥3 为该基因在 PNS 患者 PBMC 中表示增强， Cy5/ Cy3≤0.3 为该基因在 PNS 患者 PBMC 中表达减弱。 ⑷可行性分析 ①课题负责人及课题组多年从事儿童肾脏疾病的研究，有良好的科研素质和理论基 础； ②广西为全国唯一的壮族人群聚居地，平果、大化两县壮族儿童 PNS 发病率高（平果 县壮族儿童年发生率为 27/10 万，大化县为 23/10 万），我院所在地百色市的两所附属 医院均为三级甲等医院，每年收治来自平果、大化两县的壮族儿童 PNS 有较多的病例数， 并常年开展肾穿活检术； ③合作单位中南大学湘雅二医院多年开展肾脏的分子生物学的研究、熟练掌握了实验 技术方法，所需仪器设备均已具备。 ④指导者中南大学湘雅二医院儿科易著文教授，为博士生导师，湖南省“十五”重点 学科儿科学学科带头人，湖南省小儿肾脏病临床中心主任、中华医学会儿科学会常务委 员、儿肾学组副组长、国际小儿肾脏病学会会员、《中华儿科杂志》、《国外医学儿科学 分册》、《中国实用儿科杂志》、《临床儿科杂志》、《小儿急救医学》、《中国医师杂志》、 《医学临床研究》、《循证医学》等杂志常务编委，《中国当代儿科杂志》副主编，主持 过多项有关肾脏疾病国家自然科学基金、卫生部科研基金、湖南省自然科学基金课题、 近五年发表相关科研论文近 60 余篇，出版专著 10 部，获省级以上成果奖 6 项，具有丰 富的临床、教学、科研经验。本课题已取得易教授同意作为课题指导，以保证课题顺利 开展和完成。（附件 1 易教授指导同意书）。 4、本项目的特色与创新之处 ①首次运用基因芯片技术对壮族 PNS 患儿进行相关基因的筛选，并与汉族对比，探索 不同民族 PNS 的相关基因表达；
国家自然科学基金申请书 ②首次探讨壮族儿童PNS的相关基因在PNS的发生发展及与病理类型、治疗反应的关 系 ③为建立广西壮族儿童肾脏相关基因表达数据库和绘制肾脏相关基因作用通路或网 图进一步寻找各种病理条件下的基因标志,从而为开发诊断芯片提供资料。 5、年度研究计划及预期研究结果 (1)年度研究计划 2005年1月~2005年12月完成所有病例及对照组的标本收集 2006年1月~2006年12月完成所有的基因检测 2007年1月~2007年10月完成相关基因与治疗反应的观察 2007年10月~2007年12月完成结题报告 (2)预期研究成果 ①筛选出壮族儿童PS发病的相关基因; ②阐明壮族儿童PNS的相关基因在PNS的发生、发展、病理类型、治疗反应的关系; ③为广西壮族儿童PNS的基因诊断和治疗提供线索。 以上研究成果以论文形式在学术刊物公开发表 (二)研究基础与工作条件 1、工作基础 ①本项目组主要成员多年从事小儿肾脏疾病的研究,已熟练掌握了小儿肾脏疾病从 基础到临床的研究方法,依靠分子生物学技术对肾脏疾病的研究积累了丰富的工作经 验,共发表相关论文50多篇,内容包括PNS的临床治疗、发病机制的分子生物学研究、 激素和脂质以及骨代谢的紊乱,以及PNS导致的其他器官的损害等多方面内容。 ②课题负责人长期从事肾脏病的研究,近年来主持的广西卫生厅课题“免疫抑制因 子对肾小球疾病影响的研究”广西科技厅自然科学基金课题“IL-1及IL-1Ra拮抗剂与 肾小球疾病的研究”、“IL1Ra治疗肾小球疾病的安全性的研究”初步观察到IL-1是局 部和全身炎症反应中起核心作用的细胞因子,体现在诱导肾小球系膜细胞增殖和基质的 增生,是肾小球硬化的基础,应用IL-1Ra通过特异性的与IL-1受体结合从而阻断IL-1 的生物活性,取得良好效果。 第10页 版本1014.348
国家自然科学基金申请书 第 10 页 版本 1.014.348 ②首次探讨壮族儿童 PNS 的相关基因在 PNS 的发生发展及与病理类型、治疗反应的关 系。 ③为建立广西壮族儿童肾脏相关基因表达数据库和绘制肾脏相关基因作用通路或网 图进一步寻找各种病理条件下的基因标志，从而为开发诊断芯片提供资料。 5、年度研究计划及预期研究结果 ⑴年度研究计划 2005 年 1 月～2005 年 12 月 完成所有病例及对照组的标本收集 2006 年 1 月～2006 年 12 月 完成所有的基因检测 2007 年 1 月～2007 年 10 月 完成相关基因与治疗反应的观察 2007 年 10 月～2007 年 12 月 完成结题报告 ⑵预期研究成果 ①筛选出壮族儿童 PNS 发病的相关基因； ②阐明壮族儿童 PNS 的相关基因在 PNS 的发生、发展、病理类型、治疗反应的关系； ③为广西壮族儿童 PNS 的基因诊断和治疗提供线索。 以上研究成果以论文形式在学术刊物公开发表。 （二）研究基础与工作条件 1、工作基础 ①本项目组主要成员多年从事小儿肾脏疾病的研究，已熟练掌握了小儿肾脏疾病从 基础到临床的研究方法，依靠分子生物学技术对肾脏疾病的研究积累了丰富的工作经 验，共发表相关论文 50 多篇，内容包括 PNS 的临床治疗、发病机制的分子生物学研究、 激素和脂质以及骨代谢的紊乱，以及 PNS 导致的其他器官的损害等多方面内容。 ②课题负责人长期从事肾脏病的研究，近年来主持的广西卫生厅课题“免疫抑制因 子对肾小球疾病影响的研究”、广西科技厅自然科学基金课题“IL-1 及 IL-1Ra 拮抗剂与 肾小球疾病的研究”、“IL-1Ra 治疗肾小球疾病的安全性的研究”，初步观察到 IL-1 是局 部和全身炎症反应中起核心作用的细胞因子，体现在诱导肾小球系膜细胞增殖和基质的 增生，是肾小球硬化的基础，应用 IL-1Ra 通过特异性的与 IL-1 受体结合从而阻断 IL-1 的生物活性，取得良好效果
