项目类别申报学科代码1科学部编号 C C03030310 国家自然科学基金 申 请 书 项目名称:MSC对先天性巨结肠症肠道神经组织重建的实验研究 申请者: 所在单位: 邮政编码 410016 通讯地址: 重庆市渝中区医学院路1号 电传 话真 申请日期: 2000年12月 国家自然科学基金委员会 九九七年制
项目类别 申报学科代码 1 科学部编号 C C03030310 国家自然科学基金 申 请 书 项目名称：MSC 对先天性巨结肠症肠道神经组织重建的实验研究 申 请 者： 所在单位： 邮政编码： 410016 通讯地址： 重庆市渝中区医学院路１号 电 话： 4 传 真： 6 申请日期： 2000 年 12 月 国 家 自 然 科 学 基 金 委 员 会 一九九七年制
填报说明 、填写申请书前,请先査阅国家自然科学基金有关项目申请办 法及规定。申请书各项内容,要实事求是,逐条认真填写。表达要明 确、严谨,字迹要清晰易辨。外来语要同时用原文和中文表达。第一 次出现的缩写词,须注出全称。 二、申请书为十六开本,复印时用B5复印纸,于左侧装订成册。 第三页起各栏空格不够时,请自行加页。一式六份(至少一份为原件), 由所在单位审查签署意见后,按申报学科投送国家自然科学基金委员 会对口科学部。地区科学基金项目,申请书另报送省(自治区)科委 份原件。 三、封面右上角“科学部编号”由对口科学部填写,项目类别和 申报学科代码1由申请者填写。 四、下列人员不得作为申请项目的负责人提出申请,但可作为项 目组成员参加研究: -在读(含在职)研究生 已离退休的科研人员 申请单位的兼职科研人员 五、申请者和项目组中具有高级专业技术职务的主要成员申请 (含参加)的项目数,连同在研的国家自然科学基金项目数(不含重 点项目、重大项目),不得超过两项。 六、同一项目组研究内容相近的项目,只允许报送一个学科 七、申请者可因同类项目竞争等原因,提出不宜评议本项目的专 家名单(姓名与单位,3人以内),密封于信封中,钉在申请书原件封 面,或另专函相关学科,供科学部选择同行评议人时参考。科学部将 对此信息保密。 八、国家自然科学基金委员会通讯地址:北京市海淀区花园北路 35号东门 邮政编码:100083
填 报 说 明 一、填写申请书前，请先查阅国家自然科学基金有关项目申请办 法及规定。申请书各项内容，要实事求是，逐条认真填写。表达要明 确、严谨，字迹要清晰易辨。外来语要同时用原文和中文表达。第一 次出现的缩写词，须注出全称。 二、申请书为十六开本，复印时用 B5 复印纸，于左侧装订成册。 第三页起各栏空格不够时，请自行加页。一式六份（至少一份为原件）， 由所在单位审查签署意见后，按申报学科投送国家自然科学基金委员 会对口科学部。地区科学基金项目，申请书另报送省（自治区）科委 一份原件。 三、封面右上角“科学部编号”由对口科学部填写，项目类别和 申报学科代码 1 由申请者填写。 四、下列人员不得作为申请项目的负责人提出申请，但可作为项 目组成员参加研究： —在读（含在职）研究生 —已离退休的科研人员 —申请单位的兼职科研人员 五、申请者和项目组中具有高级专业技术职务的主要成员申请 （含参加）的项目数，连同在研的国家自然科学基金项目数（不含重 点项目、重大项目），不得超过两项。 六、同一项目组研究内容相近的项目，只允许报送一个学科。 七、申请者可因同类项目竞争等原因，提出不宜评议本项目的专 家名单（姓名与单位，3 人以内），密封于信封中，钉在申请书原件封 面，或另专函相关学科，供科学部选择同行评议人时参考。科学部将 对此信息保密。 八、国家自然科学基金委员会通讯地址：北京市海淀区花园北路 35 号东门 邮政编码：100083
、简表 通过MS|C体外增养转化为神经干细胞 而基因转染,体内移|植|,诱导分化等方法探|索 对先天性巨结肠症动物无神经节细胞 闔支配建的逾径和效□本研究的成将图采 究内容和意义 要 用细胞工程原理和方法代替手术方法,从根 上改进先天性巨结肠症的治疗及预后,丰富临 国经生物学的发 主题词1.主题词数量不多于三个:2.主题词之间空一格(英文用/分隔)。 中文MSc□神经干细胞□先天性巨结肠 MEX mesenchymal stem cell neuronal stem cell/aganglionic bowel 简表填写要求 简表内容将输入计算机,必须逐项认真填写,采用国家公布的标准简化汉字。简表中所有代码以最新 发布的《国家自然科学基金申请项目分类目录及代码》为准填写。高技术探索课题主题号按《高技术 新概念新构思探索课题项目指南》中主题号填写,申请其重点项目时项目类别也填写B,并在申请书 封面右上角加注“高技术探索课题重点项目 凡选择性栏目,将相应提示符A、B等之一填入该栏的右下角。 三、部分栏目填写要求 项目名称——应确切反映研究内容和范围,最多不超过25个汉字(包括标点符号)。 基础研究——指以认识自然现象、探索自然规律为目的,不直接考虑应用目标的研究活动 应用基础研究——指有广泛应用前景,但以获取新原理、新技术、新方法为主要目的的研究 申报学科——申请项目所属的最基础学科。如涉及多学科可填写两个,先填为主学科 申请金额—以万元为单位,用阿拉伯数字表示,注意小数点。 起止年月——起始时间从申请的次年1月算起。终止时间为完成年度的12月 所用实验室——系指研究项目将利用的实验室,仅填写国家计委批准的国家重点实验室或部门批准的 放实验室 所在单位名称及代码—按单位公章填写全称。例如“中国科学院西安光学精密机械研究所”不得填 “中科院西安光机所”或“西安光机所”。全称中的数字,一律写中文,例如: 中国航天工业总公司第七O一所。首次申请国家自然科学基金的单位,尚未 编入单位代码,其代码暂不填写 参加单位数—指研究项目组主要成员所在单位数,包括主持单位和合作单位(合作者所在单位),以阿 拉伯数字表示 项目组主要成员—指在项目组内对学术思想、技术路线的制订与理论分析及对项目的完成起重要作 用的人员,本人应在申请书上亲自签名。本栏双线右侧内容不输入计算机 研究内容和意义—摘要与主题词均录入软盘
一、简表 －1－ 研 究 内 容 和 意 义 摘 要 通 过 M S C 体 外 培 养 ， 转 化 为 神 经 干 细 胞 ， 进 而 基 因 转 染 ， 体 内 移 植 ， 诱 导 分 化 等 方 法 探 索 对 先 天 性 巨 结 肠 症 动 物 无 神 经 节 细 胞 段 进 行 神 经 支 配 重 建 的 途 径 和 效 果 。 本 研 究 的 完 成 将 采 用 细 胞 工 程 原 理 和 方 法 代 替 手 术 方 法 , 从 根 本 上 改 进 先 天 性 巨 结 肠 症 的 治 疗 及 预 后 ， 丰 富 临 床 神 经 生 物 学 的 发 展 。 主题词 1. 主题词数量不多于三个；2. 主题词之间空一格（英文用/分隔）。 中文 M S C 神 经 干 细 胞 先 天 性 巨 结 肠 症 英文 mesenchymal stem cell / neuronal stem cell / aganglionic bowel 简 表 填 写 要 求 一、简表内容将输入计算机，必须逐项认真填写，采用国家公布的标准简化汉字。简表中所有代码以最新 发布的《国家自然科学基金申请项目分类目录及代码》为准填写。高技术探索课题主题号按《高技术 新概念新构思探索课题项目指南》中主题号填写，申请其重点项目时项目类别也填写 B，并在申请书 封面右上角加注“高技术探索课题重点项目”。 二、凡选择性栏目，将相应提示符 A、B 等之一填入该栏的右下角。 三、部分栏目填写要求： 项目名称——应确切反映研究内容和范围，最多不超过 25 个汉字 (包括标点符号）。 基础研究——指以认识自然现象、探索自然规律为目的，不直接考虑应用目标的研究活动。 应用基础研究——指有广泛应用前景，但以获取新原理、新技术、新方法为主要目的的研究。 申报学科——申请项目所属的最基础学科。如涉及多学科可填写两个，先填为主学科。 申请金额——以万元为单位，用阿拉伯数字表示，注意小数点。 起止年月——起始时间从申请的次年 1 月算起。终止时间为完成年度的 12 月。 所用实验室——系指研究项目将利用的实验室，仅填写国家计委批准的国家重点实验室或部门批准的 开放实验室。 所在单位名称及代码——按单位公章填写全称。例如“中国科学院西安光学精密机械研究所”不得填 “中科院西安光机所”或“西安光机所”。全称中的数字，一律写中文，例如： 中国航天工业总公司第七○一所。首次申请国家自然科学基金的单位，尚未 编入单位代码，其代码暂不填写。 参加单位数——指研究项目组主要成员所在单位数，包括主持单位和合作单位(合作者所在单位)，以阿 拉伯数字表示。 项目组主要成员——指在项目组内对学术思想、技术路线的制订与理论分析及对项目的完成起重要作 用的人员，本人应在申请书上亲自签名。本栏双线右侧内容不输入计算机。 研究内容和意义——摘要与主题词均录入软盘
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二、立论依据 (包括项目的研究意义、国内外研究现状分析,并附主要参考文献及出处) 对基础研究,着重结合国际科学发展趋势,论述项目的科学意义 对应用基础研究,着重结合学科前沿、围绕国民经济和社会发展中的重要科技问题,论 述其应用前景 先天性巨结肠症( Hirschsprung' s disease,HD)是小儿外科领域内的一种常见性疾病 发病率为12000-1/5000对HD临床及基础研究一直是小儿外科研究的热点之一。此疾 的发生是由于多种原因使胚胎期神经嵴细胞在消化道移行受阻,结肠壁肌间神经节细胞缺 如,病变结肠痉挛收缩,肠内容物排出受阻,近端肠管继发性扩张形成巨结肠,影响儿童 健康成长。自发现HD的病因以来,HD的治疗主要依靠手术切除远端无神经节细胞段,手 术方式较多,由于各种术式固有缺陷,目前仍存在各种并发症,影响HD患儿术后恢复 寻求更为有效及安全的针对HD的治疗方法,一直是国内外小儿外科工作者努力的方向 在临床及科研工作中我们注意到细胞疗法( cell therapy)近年来已成为治疗多种疾 新策略,在替代,修复或加强受损的组织或器官的生物学功能方面有巨大作用。细胞 法中应用的靶细胞之一,神经干细胞,目前己成为研究热点。传统的发生生物学认为人 神经细胞一经受损就永远不能再生新的神经元。然而随着神经干细胞的发现,受损神经细 胞不能恢复的观点正在发生变化。神经干细胞是一种终身具有自我更新能力的细胞,其子 细胞能分化产生神经系统的各类细胞,干细胞通过不对称分裂产生一个祖细胞和另一个 细胞,祖细胞具有有限的自我更新能力,并自发分化产生成神经元细胞和成胶质细胞等, 从而生成神经元及神经胶质细胞。已有研究表明神经干细胞具有潜在多向分化能力,能在 定条件下定向分化,具有较强的增殖能力,移植入成体神经组织后易于存活,目前神经 干细胞在损伤神经组织,细胞的修复方面己显示出良好的应用前景21 HD病因为胚胎早期神经嵴细胞移行受阻的结果,以往我们对HD的研究中也发现HD 病变肠段不仅存在神经节细胞异常,神经胶质细胞也表现出异常,进一步支持了HD病因 系胚胎早期神经嵴细胞移行异常的结果。对于这种病变肠段无神经节的异常神经支配可否 通过神经干细胞进行移植修复呢?结论是肯定的, Natara jan等在体外实验中观察到正 常鼠的神经嵴细胞可在体外修复培养中的RETK突变鼠(一种田D动物模型)病变肠段神经 支配,且前瞻性地指出了神经嵴细胞移植可能成为今后先天性巨结肠症的治疗手段 目前的问题是在临床实践中诊断的HD患儿均在出生后,此刻神经嵴细胞分化成熟
二、立论依据 （包括项目的研究意义、国内外研究现状分析，并附主要参考文献及出处） 对基础研究，着重结合国际科学发展趋势，论述项目的科学意义； 对应用基础研究，着重结合学科前沿、围绕国民经济和社会发展中的重要科技问题，论 述其应用前景。 先天性巨结肠症（Hirschsprung’s disease，HD）是小儿外科领域内的一种常见性疾病， 发病率为 1/2000~1/5000。对 HD 临床及基础研究一直是小儿外科研究的热点之一。此疾病 的发生是由于多种原因使胚胎期神经嵴细胞在消化道移行受阻，结肠壁肌间神经节细胞缺 如，病变结肠痉挛收缩，肠内容物排出受阻，近端肠管继发性扩张形成巨结肠，影响儿童 健康成长。自发现 HD 的病因以来，HD 的治疗主要依靠手术切除远端无神经节细胞段，手 术方式较多，由于各种术式固有缺陷，目前仍存在各种并发症，影响 HD 患儿术后恢复［１］。 寻求更为有效及安全的针对 HD 的治疗方法，一直是国内外小儿外科工作者努力的方向。 在临床及科研工作中我们注意到细胞疗法（cell therapy）近年来已成为治疗多种疾病 的新策略，在替代，修复或加强受损的组织或器官的生物学功能方面有巨大作用。细胞疗 法中应用的靶细胞之一，神经干细胞，目前已成为研究热点。传统的发生生物学认为人体 神经细胞一经受损就永远不能再生新的神经元。然而随着神经干细胞的发现，受损神经细 胞不能恢复的观点正在发生变化。神经干细胞是一种终身具有自我更新能力的细胞，其子 细胞能分化产生神经系统的各类细胞，干细胞通过不对称分裂产生一个祖细胞和另一个干 细胞，祖细胞具有有限的自我更新能力，并自发分化产生成神经元细胞和成胶质细胞等， 从而生成神经元及神经胶质细胞。已有研究表明神经干细胞具有潜在多向分化能力，能在 一定条件下定向分化，具有较强的增殖能力，移植入成体神经组织后易于存活，目前神经 干细胞在损伤神经组织，细胞的修复方面已显示出良好的应用前景[2]。 HD 病因为胚胎早期神经嵴细胞移行受阻的结果，以往我们对 HD 的研究中也发现 HD 病变肠段不仅存在神经节细胞异常，神经胶质细胞也表现出异常，进一步支持了 HD 病因 系胚胎早期神经嵴细胞移行异常的结果。对于这种病变肠段无神经节的异常神经支配可否 通过神经干细胞进行移植修复呢？ 结论是肯定的，Natarajan 等在体外实验中观察到正 常鼠的神经嵴细胞可在体外修复培养中的RET.K–突变鼠(一种HD动物模型)病变肠段神经 支配，且前瞻性地指出了神经嵴细胞移植可能成为今后先天性巨结肠症的治疗手段[3] 。 目前的问题是在临床实践中诊断的 HD 患儿均在出生后，此刻神经嵴细胞分化成熟， －3-1－
且些类患儿病变肠段不仅有神经节异常,尚有肠道平滑肌,结缔组织的增生等细胞外基 质变化,单纯的神经崤细胞移植一方面神经嵴细胞来源受限,另一方面能否在体內改造 病变肠段的病理变化,仍需进一步研究。 近年来干细胞的基因修饰治疗发展较快,国外有人发现将表达神经营养因子的神经 干细胞直接种植于受伤的脑组织中,能促进神经功能的恢复。神经干细胞在受到碱性成 纤维细胞因子(FGF-2)和上皮细胞生长因子(EGF)刺激时可分化出神经元和胶质细胞 EGF可维持神经干细胞的生成,FGF-2对干细胞的分化起重要作用;有很多神经因子(如 血小板生长因子,转化生长因子等)对神经干细胞的分化起着协同作用。诱导分化剂维 甲酸对神经干细胞也有诱导分化作用。对于HD病变肠段不仅有神经节异常,尚有肠道 平滑肌,结缔组织的增生等变化的现象,我们注意到纤溶酶原激活因子(PA)能激活纤 溶酶原,水解纤维蛋白,及细胞外基质中的纤连蛋白( fibronectin,Fn),层粘连蛋白( laminin Ln),基质金属蛋白酶(matiⅸ metalloproteinase enzyme,MMP)能分解周围组织一细胞外 基质,如将PA,MMP的cDNA转染修饰神经干细胞将有可能对HD病变段的病理变化 进行改造,有利于神经干细胞生长,发育。通过探索影响神经干细胞移植,生长,分化 的分子机制,结合基因工程技术,将可为神经干细胞移植治疗成功创造条件。 鉴于神经干细胞的多向分化潜能,在大脑,脊髓中的损伤修复研究中令人鼓舞的发 现,自体造血干细胞等分化为神经干细胞可能性的提出4(此将为神经干细胞自体移植 提供一个很好的来源),以及神经干细胞目前被认为是一种更优于成纤维细胞的基因治疗 的载体细胞,针对上面的问题我们提出如下假说:如同神经干细胞移植在恢复受损大脑 脊髓神经功能上具有良好的应用前景—样,通过眢种人工方法修饰后,神经干细胞移植 有恢复HD病变肠段的正常神经支配的可能 细胞移植虽然已被认为对于修复神经组织是有效的治疗方法,但目前使用的细胞 多取自胚胎,这样一方面细胞来源有限,另一方面存在异体免疫排斥作用。神经干细胞 可以在体外大量增殖,但目前主要在海马和室管膜下层发现有神经干细胞分布,这样造 成了神经干细胞来源困难。骨髓中有两类干细胞,即造血干细胞和间充质干细胞 ( mesenchymal stem cell,MsC)。前者的移植已成功用于临床治疗白血病,但其移植需 要获得足够数量的造血干细胞,并且造血干细胞体外扩增存在困难。MSC易于从骨髓中分 离,体外扩增简单,长期培养过程中能保持多向分化潜能。近期美国学者 Woodbury等在 3-2
且此类患儿病变肠段不仅有神经节异常，尚有肠道平滑肌，结缔组织的增生等细胞外基 质变化，单纯的神经嵴细胞移植一方面神经嵴细胞来源受限，另一方面能否在体内改造 病变肠段的病理变化，仍需进一步研究。 近年来干细胞的基因修饰治疗发展较快，国外有人发现将表达神经营养因子的神经 干细胞直接种植于受伤的脑组织中，能促进神经功能的恢复。神经干细胞在受到碱性成 纤维细胞因子（FGF-2）和上皮细胞生长因子（EGF）刺激时可分化出神经元和胶质细胞， EGF 可维持神经干细胞的生成，FGF-2 对干细胞的分化起重要作用；有很多神经因子（如 血小板生长因子，转化生长因子等）对神经干细胞的分化起着协同作用。诱导分化剂维 甲酸对神经干细胞也有诱导分化作用[3]。对于 HD 病变肠段不仅有神经节异常，尚有肠道 平滑肌，结缔组织的增生等变化的现象，我们注意到纤溶酶原激活因子（PA）能激活纤 溶酶原，水解纤维蛋白，及细胞外基质中的纤连蛋白(fibronectin, Fn)，层粘连蛋白（laminin， Ln），基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase enzyme, MMP）能分解周围组织—细胞外 基质，如将 PA，MMP 的 cDNA 转染修饰神经干细胞将有可能对 HD 病变段的病理变化 进行改造，有利于神经干细胞生长，发育。通过探索影响神经干细胞移植，生长，分化 的分子机制，结合基因工程技术，将可为神经干细胞移植治疗成功创造条件。 鉴于神经干细胞的多向分化潜能，在大脑，脊髓中的损伤修复研究中令人鼓舞的发 现，自体造血干细胞等分化为神经干细胞可能性的提出[4] （此将为神经干细胞自体移植 提供一个很好的来源），以及神经干细胞目前被认为是一种更优于成纤维细胞的基因治疗 的载体细胞[5]，针对上面的问题我们提出如下假说：如同神经干细胞移植在恢复受损大脑， 脊髓神经功能上具有良好的应用前景一样，通过各种人工方法修饰后，神经干细胞移植 有恢复 HD 病变肠段的正常神经支配的可能。 细胞移植虽然已被认为对于修复神经组织是有效的治疗方法，但目前使用的细胞 多取自胚胎，这样一方面细胞来源有限，另一方面存在异体免疫排斥作用。神经干细胞 可以在体外大量增殖，但目前主要在海马和室管膜下层发现有神经干细胞分布，这样造 成了神经干细胞来源困难。骨髓中有两类干细胞，即造血干细胞和间充质干细胞 （mesenchymal stem cell, MSC）。前者的移植已成功用于临床治疗白血病，但其移植需 要获得足够数量的造血干细胞，并且造血干细胞体外扩增存在困难。MSC 易于从骨髓中分 离，体外扩增简单，长期培养过程中能保持多向分化潜能。近期美国学者 Woodbury 等在 —3-2—
体外实验中成功地将源于成年大鼠及人骨髓MSC转化为神经干细胞,并进而分化为神经 元。此研究结果很好地解决了神经干细胞来源困难的问题,为今后神经干细移植治疗多 种神经系统疾病打下了基础。 总之,随着当今干细胞研究的深入,探索通过MSC转化为神经干细胞恢复小儿外 科常见疾病(先天性巨结肠症)正常神经支配的方法具有重要现实性及可能性 美国《时代》周刊曾将人类胚胎干细胞(ES细胞)和胚胎生殖细胞(EG细胞)建系 研究成功列为20世纪末世界十大科技成就之首,并认为ES细胞和人类基因组将同时成 为新世纪最具发展和应用前景的领域。由此激发了人们对ES细胞,骨髓干细胞,神经 干细胞定向分化的研究。将MSC,神经干细胞定向分化,移植的研究引入到HD这一小儿 外科常见病的治疗研究中,探索MSC,神经干细胞克隆、定向分化、移植对于HD治疗 方法,可为发育生物学积累宝贵的资料:采用细胞工程原理和方法,通过MC,神经干 细胞移植重建HD病变段的正常神经支配方法的研究成功,在临床上将可以让HD患儿 免于手术,使HD的治疗发生根本性的改观。该课题的完成除能为儿童的健康成长做出 巨大贡献,并能带动本地区整个小儿外科水平的发展,提高本地区小儿外科在国内及国 际上的地位,为祖国西部大开发战略的顺利进行贡献力量 参考文献 (1)陈雷玲,胡廷泽,朗诗明,等。320例先天性巨结肠症的诊断与治疗分析。华西医 科大学学报,2000,31(2):27427 (2)Kathryn S. Embryonic stem cells used to remyelinate injured rat spinal cord neurons Lancet,2000,355(9218):1890 (3)McCaffery P, Drager UC. Regulation of retinioc acid signaling in the embryonic nervous system: a master differentiation factor. Cytokine Growth Factor Rev. 2000, 11(3) 233-249 (4) Natarajan D, Grigoriou M, Marcos-Gutierrez CV, et al. Multipotential progenitors of themammalian enteric nervous system capable of colonizing aganglionic bowel in organ culture. Devel opment,1999,126:157-168 )刘平,卢亦成,朱诚。中枢神经干细胞。中华神经外科杂志。200016(3):196-198 (6)Woodbury D, Schwarz e, Prockop DJ, et al. Ault rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons. J Neurosci Res, 2000, 61(4): 364-370 3-3
体外实验中成功地将源于成年大鼠及人骨髓 MSC 转化为神经干细胞, 并进而分化为神经 元[6]。此研究结果很好地解决了神经干细胞来源困难的问题，为今后神经干细移植治疗多 种神经系统疾病打下了基础。 总之，随着当今干细胞研究的深入，探索通过 MSC 转化为神经干细胞恢复小儿外 科常见疾病（先天性巨结肠症）正常神经支配的方法具有重要现实性及可能性。 美国«时代»周刊曾将人类胚胎干细胞（ES 细胞）和胚胎生殖细胞（EG细胞）建系 研究成功列为 20 世纪末世界十大科技成就之首，并认为 ES 细胞和人类基因组将同时成 为新世纪最具发展和应用前景的领域。由此激发了人们对 ES 细胞，骨髓干细胞，神经 干细胞定向分化的研究。将 MSC,神经干细胞定向分化，移植的研究引入到 HD 这一小儿 外科常见病的治疗研究中，探索 MSC，神经干细胞克隆、定向分化、移植对于 HD 治疗 方法，可为发育生物学积累宝贵的资料；采用细胞工程原理和方法，通过 MSC，神经干 细胞移植重建 HD 病变段的正常神经支配方法的研究成功，在临床上将可以让 HD 患儿 免于手术，使 HD 的治疗发生根本性的改观。该课题的完成除能为儿童的健康成长做出 巨大贡献，并能带动本地区整个小儿外科水平的发展，提高本地区小儿外科在国内及国 际上的地位，为祖国西部大开发战略的顺利进行贡献力量。 参考文献 (1) 陈雷玲，胡廷泽，朗诗明，等。320 例先天性巨结肠症的诊断与治疗分析。华西医 科大学学报，2000，31(2)：274-27 (2) Kathryn S. Embryonic stem cells used to remyelinate injured rat spinal cord neurons. Lancet, 2000, 355 (9218): 1890 (3) McCaffery P, Drager UC. Regulation of retinioc acid signaling in the embryonic nervous system: a master differentiation factor. Cytokine Growth Factor Rev. 2000, 11(3): 233-249 (4) Natarajan D, Grigoriou M, Marcos-Gutierrez CV, et al. Multipotential progenitors of themammalian enteric nervous system capable of colonizing aganglionic bowel in organ culture. Development, 1999,126:157-168 (5) 刘平，卢亦成，朱诚。中枢神经干细胞。中华神经外科杂志。2000，16（3）：196-198 (6) Woodbury D, Schwarz EJ, Prockop DJ, et al. Ault rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons. J Neurosci Res, 2000, 61(4): 364-370 —3-3—
研究方案 研究目标、研究内容和拟解决的关键问题 研究目标 探索建立针对先天性巨结肠症的MSC,神经干细胞移植治疗方法。 研究内容: 1.MSC的分离,体外克隆 2.MSC向神经干细胞的转化 3.多种人工修饰条件下的神经干细胞在HD动物模型( lethal spotted rat, Is/ls)无神 经节细胞肠段移植,定向分化: 4.鉴定神经干细胞移植后HD动物模型的消化道神经系统形态及机能。 拟解决的关键问题 1.MSC向神经干细胞的转化 2.神经干细胞的基因修饰: 3.神经干细胞移植,定向分化的分子机制
三、研究方案 1. 研究目标、研究内容和拟解决的关键问题 研究目标： 探索建立针对先天性巨结肠症的 MSC，神经干细胞移植治疗方法。 研究内容： １．MSC 的分离，体外克隆； ２．MSC 向神经干细胞的转化； ３．多种人工修饰条件下的神经干细胞在 HD 动物模型（lethal spotted rat, ls/ls）无神 经节细胞肠段移植，定向分化； ４．鉴定神经干细胞移植后 HD 动物模型的消化道神经系统形态及机能。 拟解决的关键问题： １．MSC 向神经干细胞的转化； ２．神经干细胞的基因修饰； ３．神经干细胞移植，定向分化的分子机制。 －4－
拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析 研究方法: 1.无血清培养,单细胞克隆技术 2.mRNA差异消减显示技术 3.原位杂交: RT-PCR,免疫组化技术,透射电镜技术 4.基因转染技术。 技术路线 建立HD动物模型 MSC的分离及体外培养 MSC向神经干细胞的转化 神经干细胞体外培养,克隆(V-MYC,EGF等多种基因转染,修饰) 神经干细胞移植到HD动物无神经节细胞段 诱导分化(维甲酸等) mRNA差异消减显示技术显示神经干细胞移植分化的分子机制 观察无神经节细胞段肠神经系统形态及功能 获得通过MSC、神经干细胞移植对先天性巨结肠症肠道神经组织重建的方法
2. 拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析 研究方法： １．无血清培养，单细胞克隆技术； ２．mRNA 差异消减显示技术； ３．原位杂交；RT-PCR，免疫组化技术，透射电镜技术； ４．基因转染技术。 技术路线： 建立 HD 动物模型 MSC 的分离及体外培养 MSC 向神经干细胞的转化 神经干细胞体外培养，克隆（V-MYC，EGF 等多种基因转染，修饰） 神经干细胞移植到 HD 动物无神经节细胞段 诱导分化（维甲酸等） mRNA 差异消减显示技术显示神经干细胞移植分化的分子机制 观察无神经节细胞段肠神经系统形态及功能 获得通过 MSC、神经干细胞移植对先天性巨结肠症肠道神经组织重建的方法 －5-1－
实验方案 第一部分:建立HD动物大鼠 参照文献进行大鼠选育,源于 Wistar- Imamichi ar系,HD大鼠均结 肠造瘘处理。 第二部分:MSC分离培养,向神经干细胞转化 1.MSC分离培养切取鼠一侧股骨,暴露骨髓腔,用注射器抽取细胞培 养液(DMM20%FBS),反复多次冲洗出骨髓细胞,用吸管反复抽吸 后, Ficoll分离液离心分离出有核细细胞,移入T75培养瓶,过夜培 养,第二日将悬浮细胞移去(贴壁细胞为较纯的基质干细胞),3-4天 更换培养液,当细胞融合时用胰岛素/DTA( trypsin/EDTA)处理,收 获贴壁细胞为MSC(MSC鉴定选用CD29,CD90,CD106等标记)。 2.MSC向神经干细胞转化参照文献在MSC培养液中加入脊索中胚层 浸出液,脊索中胚层条件培养液,星形胶质细胞上清液,多种神经生长 因子等。 3.鉴定A.光镜及电镜下观察转化细胞形态改变。 B.免疫组化或流式细胞仪检测细胞转化后的表面标志: nestin 波形蛋白,RC抗原。 第三部分:神经干细胞分离提取,体外培养,基因转染 1.神经干细胞的分离和传代分别取鼠纹状体和孕鼠皮层组织,吸管吹 打机械分离制成单细胞悬液,利用 DMEM/F2(11)加B27及bFGF无 血清培养基进行原代培养,具体参见文献。 2.体外基因转染对于以上两种来源的神经干细胞采用脂质体介导基 因转染技术,将VMYC,EGF,及FGF2,PA, MMP CDNA重组逆 转录病毒载体导入神经干细胞,包括双基因及单基因转染的多种形式。 逆转录病毒载体 pLNCXE由中国医学科学院分子生物学国家重点实验 室提供。E.coli质粒DNA大量制备、纯化和酶切参照 Sambrook等的 文献方法进行;按 Lipofectamine试剂盒说明进行转染实验 第四部分:神经干细胞在无神经节细胞段的移植,定向分化及检测
实验方案： 第一部分：建立 HD 动物大鼠 参照文献进行大鼠选育，源于 Wistar-Imamichi AR 系，HD 大鼠均结 肠造瘘处理。 第二部分：MSC 分离培养，向神经干细胞转化 1. MSC 分离培养 切取鼠一侧股骨，暴露骨髓腔，用注射器抽取细胞培 养液（DMEM/20FBS），反复多次冲洗出骨髓细胞，用吸管反复抽吸 后，Ficoll 分离液离心分离出有核细细胞，移入 T-75 培养瓶，过夜培 养，第二日将悬浮细胞移去（贴壁细胞为较纯的基质干细胞），3-4 天 更换培养液，当细胞融合时用胰岛素/EDTA（trypsin/EDTA）处理，收 获贴壁细胞为 MSC ( MSC 鉴定选用 CD29，CD90，CD106 等标记)。 2. MSC 向神经干细胞转化 参照文献在 MSC 培养液中加入脊索中胚层 浸出液，脊索中胚层条件培养液，星形胶质细胞上清液，多种神经生长 因子等。 3. 鉴定 A. 光镜及电镜下观察转化细胞形态改变。 B. 免疫组化或流式细胞仪检测细胞转化后的表面标志: nestin, 波形蛋白，RC 抗原。 第三部分：神经干细胞分离提取，体外培养，基因转染 1. 神经干细胞的分离和传代 分别取鼠纹状体和孕鼠皮层组织，吸管吹 打机械分离制成单细胞悬液，利用 DMEM/F12(1:1) 加 B27 及 bFGF 无 血清培养基进行原代培养，具体参见文献。 2. 体外基因转染 对于以上两种来源的神经干细胞采用脂质体介导基 因转染技术，将 V-MYC，EGF，及 FGF-2 ，PA，MMP cDNA 重组逆 转录病毒载体导入神经干细胞，包括双基因及单基因转染的多种形式。 逆转录病毒载体 pLNCXE 由中国医学科学院分子生物学国家重点实验 室提供。E. coli 质粒 DNA 大量制备、纯化和酶切参照 Sambrook 等的 文献方法进行；按 LipofectamineTM试剂盒说明进行转染实验。 第四部分：神经干细胞在无神经节细胞段的移植，定向分化及检测 —5-2—
