《自然基金》国家自然科学基金申请书.doc_大学文库

国家自然科学基金申请书基本信息名/沈继龙性别|男年月1938年2月民族汉族申请者位博士职称教授主要研究领域|病原生物学话0551-5161057 电子邮件jlshen@ahmu.edu.cn 真0551-5161057 个人网页信息工作单位安徽医科大学/基础医学院在研项目批准号30170841 名称安徽医科大学代码23003201 位联系人孙斐电子邮件 kyc(ahmu. edu. cn 信息一合作单位电话|05-5161056 网站地址|w.ahm.edu.cn 单位名称代码单[在此录入修改信「[在此录入修改项目名称芍药苷对血吸虫病肝肉芽肿及纤维化细胞信号转导的干预项仁资助类别面上项日亚类说明自由申请项附注说明基本/甲请代码03012:寄生虫学(含寄生虫病 C03011403:传染病的预防与治疗研究信基地类别息预计研究年限200年1月-2009年12月研究属性基础研究项目研究内容和意义简介(限400字):血吸虫病仍是严重危害人民健康的重大寄生虫病全球每年死于血吸虫病性肝纤维化及其并发症的患者达50-100万。我国是世界上日本血吸摘/虫病流行最严重的国家。该病的主要死因是肝脏虫卵肉芽肿及其继发的肝纤维化。研究显示,在有效杀虫治疗之后肝脏的肉芽肿炎性反应和纤维化仍可继续发展。如何在肉芽肿形成阶段和肝纤维化早期,用药物干预以控制其发展,是杀虫治疗后第二个控制疾病发展的关键。然而至今无高效低毒的药物用于血吸虫性肝病的治疗。本项目在研究肉芽肿炎性反应及肝纤维化早期细胞信号转导通路的基础上,用中药有效成分芍药苷,体内和体外探讨要|药物对性肉芽肿和肝星状细胞在肝纤维化的发生发展的作用,观察肝星状细胞的激话要有效成分,其对血吸虫病肝纤维化影响的研究,国内外未见报道关键词用分号分开,最多5个)肝星状细胞:芍药苷:肝纤维化;血吸虫虫卵肉芽肿:信号转导版本1009.626

国家自然科学基金申请书第 2 页版本 1.009.626 基本信息 yoKWT/OQ 申请者信息姓名沈继龙性别男出生年月 1953 年 2 月民族汉族学位博士职称教授主要研究领域病原生物学电话 0551-5161057 电子邮件 jlshen@ahmu.edu.cn 传真 0551-5161057 个人网页工作单位安徽医科大学 /基础医学院在研项目批准号 30170841 依托单位信息名称安徽医科大学代码 23003201 联系人孙斐电子邮件 kyc@ahmu.edu.cn 电话 0551-5161056 网站地址 www.ahmu.edu.cn 合作单位信息单位名称代码 [在此录入修改] [在此录入修改] 项目基本信息项目名称芍药苷对血吸虫病肝肉芽肿及纤维化细胞信号转导的干预资助类别面上项目亚类说明自由申请项目附注说明申请代码 C030112:寄生虫学(含寄生虫病学) C03011403:传染病的预防与治疗研究基地类别预计研究年限 2006 年 1 月 — 2008 年 12 月研究属性基础研究摘要项目研究内容和意义简介（限 400 字）：血吸虫病仍是严重危害人民健康的重大寄生虫病，全球每年死于血吸虫病性肝纤维化及其并发症的患者达 50-100 万。我国是世界上日本血吸虫病流行最严重的国家。该病的主要死因是肝脏虫卵肉芽肿及其继发的肝纤维化。研究显示，在有效杀虫治疗之后肝脏的肉芽肿炎性反应和纤维化仍可继续发展。如何在肉芽肿形成阶段和肝纤维化早期，用药物干预以控制其发展，是杀虫治疗后第二个控制疾病发展的关键。然而至今无高效低毒的药物用于血吸虫性肝病的治疗。本项目在研究肉芽肿炎性反应及肝纤维化早期细胞信号转导通路的基础上，用中药有效成分芍药苷，体内和体外探讨药物对炎性肉芽肿和肝星状细胞在肝纤维化的发生发展的作用，观察肝星状细胞的激活、凋亡、细胞内信号转导以及 MMPs、TIMPs、胶原Ⅰ、Ⅲ型表达。芍药苷是从白芍中提取的主要有效成分，其对血吸虫病肝纤维化影响的研究，国内外未见报道。关键词(用分号分开，最多 5 个) 肝星状细胞；芍药苷；肝纤维化；血吸虫虫卵肉芽肿；信号转导

国家自然科学基金申请书杳看报告正文撰写提纲报告正文 (一)立项依据与研究内容(4000-8000字) 项目的立项依据(研究意义、国内外研究现状及分析,附主要参考文献目录。) 血吸虫病是热带亚热带发展中国家的严重寄生虫病。据世界卫生组织(WHO)报道该病在全世界74个国家中流行,6亿多人口受到威胁,2亿多人受到感染,其中1.2亿伴有临床症状,2000万伴有严重后遗症;全世界每年死于血吸虫病性肝纤维化及其并发症的患者达50万-100万;血吸虫病在14岁以下的儿童中发病率之高,严重影响了儿童的智力发育和身心健康。现已发现有6种血吸虫引起人类疾病,我国是日本血吸虫病流行最严重的国家。该病主要分布于我国长江流域及其南部的12个省(区、市),受威胁的人群达1亿以上,感染人数超过1000万。目前,我国日本血吸虫病的流行尚未得到有效控制,湖区患病人数急剧增加。该病已成为严重影响我国人民身心健康和国民经济、社会发展和稳定的主要疾病之一血吸虫病是一种虫卵肉芽肿引起的慢性免疫性疾病,其病理基础是沉积于组织内大量的成熟虫卵对机体的刺激、宿主对活毛蚴分泌的可溶性抗原产生的病理性免疫应答, 并形成虫卵肉芽肿和继发肝纤维化的形成。肝纤维化是血吸虫病严重的后果,它可进 ˉ步导致门静脉髙压症如食管胃底静脉曲张、脾肿大和脾功能亢进,最后引发上消化道大出血导致死亡回。日本血吸虫病肝纤维化/肝硬化及其并发症是血吸虫病惠者死亡的主要原因。根据以上的发病机理和病理进程,针对日本血吸虫病的治疗应包括杀虫,抑制虫卵肉芽肿,减轻、延缓甚至阻止纤维化形成等三个关键环节。目前国内外治疗血吸虫病主要采用杀虫疗法(即第一环节),尤其是首选吡喹酮为抗血吸虫病药物,因此, 这就产生了以下问题:第一,吡喹酮只对童虫、成虫和组织内成熟虫卵具有杀灭作用, 所以,杀虫治疗后肝脏及肠壁组织内未成熟虫卵仍可继续发育,组织虫卵肉芽肿反应仍在继续;第二,由于慢性患者(此类患者在血吸虫感染者中占大多数)临床上多无症状或只表现为慢性腹泻而易延误诊断,结果往往不能及时使用杀虫药,导致肝肉芽肿和纤维化的形成;第三,近年国外已从经有效剂量吡喹酮治疗曼氏血吸虫病未愈的感染者中分离出抗药株。由于药物压力,日本血吸虫同样存在抗药株产生的可能性;第四,对于已形成的虫卵或纤维化,杀虫疗法也无能为力;此外,有报道,日本血吸虫第5页版本1009.626

国家自然科学基金申请书第 5 页版本 1.009.626 查看报告正文撰写提纲报告正文（一）立项依据与研究内容（4000-8000 字）： 1. 项目的立项依据（研究意义、国内外研究现状及分析，附主要参考文献目录。）血吸虫病是热带亚热带发展中国家的严重寄生虫病。据世界卫生组织（WHO）报道，该病在全世界 74 个国家中流行，6 亿多人口受到威胁，2 亿多人受到感染，其中 1.2 亿伴有临床症状，2000 万伴有严重后遗症；全世界每年死于血吸虫病性肝纤维化及其并发症的患者达 50 万-100 万；血吸虫病在 14 岁以下的儿童中发病率之高，严重影响了儿童的智力发育和身心健康 [1]。现已发现有 6 种血吸虫引起人类疾病，我国是日本血吸虫病流行最严重的国家 [2]。该病主要分布于我国长江流域及其南部的 12 个省（区、市），受威胁的人群达 1 亿以上，感染人数超过 1000 万[2]。目前，我国日本血吸虫病的流行尚未得到有效控制，湖区患病人数急剧增加。该病已成为严重影响我国人民身心健康和国民经济、社会发展和稳定的主要疾病之一 [2]。血吸虫病是一种虫卵肉芽肿引起的慢性免疫性疾病，其病理基础是沉积于组织内大量的成熟虫卵对机体的刺激、宿主对活毛蚴分泌的可溶性抗原产生的病理性免疫应答，并形成虫卵肉芽肿和继发肝纤维化的形成 [2]。肝纤维化是血吸虫病严重的后果，它可进一步导致门静脉高压症如食管胃底静脉曲张、脾肿大和脾功能亢进，最后引发上消化道大出血导致死亡 [2]。日本血吸虫病肝纤维化/肝硬化及其并发症是血吸虫病患者死亡的主要原因 [3]。根据以上的发病机理和病理进程，针对日本血吸虫病的治疗应包括杀虫，抑制虫卵肉芽肿，减轻、延缓甚至阻止纤维化形成等三个关键环节。目前国内外治疗血吸虫病主要采用杀虫疗法（即第一环节），尤其是首选吡喹酮为抗血吸虫病药物 [2, 4]，因此，这就产生了以下问题：第一，吡喹酮只对童虫、成虫和组织内成熟虫卵具有杀灭作用，所以，杀虫治疗后肝脏及肠壁组织内未成熟虫卵仍可继续发育，组织虫卵肉芽肿反应仍在继续 [5, 6] ；第二，由于慢性患者（此类患者在血吸虫感染者中占大多数）临床上多无症状或只表现为慢性腹泻而易延误诊断 [2]，结果往往不能及时使用杀虫药，导致肝肉芽肿和纤维化的形成；第三，近年国外已从经有效剂量吡喹酮治疗曼氏血吸虫病未愈的感染者中分离出抗药株 [7]。由于药物压力，日本血吸虫同样存在抗药株产生的可能性；第四，对于已形成的虫卵或纤维化，杀虫疗法也无能为力 [4] ；此外，有报道，日本血吸虫

国家自然科学基金申请书病患者在彻底杀虫治疗后肝纤维化仍可继续发展。因此,杀虫治疗后,使用针对肉芽肿免疫调节和抗纤维化的药物治疗显得更加迫切。但因为目前对虫卵肉芽肿形成以及由此引起纤维化的机制了解很少,所以,尚未成功研发出针对这两个环节、疗效确切、副作用少的化学药物2。研究虫卵肉芽肿形成以及由其引起纤维化的机制,研发疗效明确、副作用少,能直接抑制血吸虫虫卵肉芽肿形成、减轻或延缓纤维化的药物对降低血吸虫病发病率、提高生存质量、治疗病人、降低死亡率都具有十分重要的意义。日本血吸虫虫卵肉芽肿的形成与细胞及体液免疫有关,尤其是前者在肉芽肿形成早期起主要作用。血吸虫尾蚴通过疫水经皮肤感染人体,先后经过童虫、成虫阶段,最后主要移行于肝门静脉和肠系膜静脉并寄生、产卵。虫卵随血流主要沉积于门静脉分支、肝血窦前,在此,虫卵内成熟的毛蚴分泌可溶性虫卵抗原( soluble egg antigen,SEA) 并经卵壳上的微孔渗入肝周围组织。SEA被周围组织中的巨噬细胞吞噬处理,经过处理的抗原被递呈到辅助性的T淋巴细胞(Th)。同时,摄取了抗原的巨噬细胞释放白细胞介素1(I-1),激活TH,后者产生多种细胞因子,其中促进肉芽肿形成的有IL-1、IL-2 IL-4、IL-5、IL-13等;抑制肉芽肿形成的有IL-10、IL-2、IFN-γ等;还有各类细胞趋化因子、移动抑制因子等。在上述各种细胞因子的共同参与下,大量巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、浆细胞、成纤维细胞和嗜酸粒细胞等聚集到虫卵周围形成炎性肉芽肿,随后肉芽肿中心坏死,形成嗜酸性脓肿,卵内毛蚴逐渐死亡,SEA分泌量减少,最终停止,肉芽肿退化并开始局部纤维化,由此可引出严重临床症状2。在这些细胞因子中,IL-4、IFNy在日本血吸虫肉芽肿的形成和发展中起重要作用10。I-4由Th2 细胞产生,能促进Th2细胞自身的增殖、分化并刺激自身和其它Th2细胞分泌IL-5,而 IL-5通过刺激嗜酸粒细胞(EOS)增殖、分化而促进肉芽肿的炎性反应;IL-4能诱导单核细胞分泌克隆刺激因子、促进巨噬细胞分化、促进淋巴细胞侵润而增强肉芽肿炎性反应;I-4通过刺激B淋巴细胞增殖分化并产生IgE、IgG,而介导肉芽肿形成;此外, IL-4可抑制Th1细胞增殖,并下调Th1细胞在肉芽肿炎性反应中的作用。IFN-Y由Th1 细胞产生,能抑制Th2细胞增殖和IL-4、IL-5产生,从而减轻肉芽肿炎症,此外IFN-y 还抑制Ⅰ、Ⅱ型胶原转录而减轻纤维化等。总之,在血吸虫感染早期,肉芽肿形成过程中,多种细胞因子均有增加,它们之间相互作用形成一个及其复杂的网络。这些细胞因子的综合作用调控着肉芽肿形成及以后纤维化的发生、发展。下调促进肉芽肿形成细胞因子和/或上调抑制肉芽肿形成细胞因子的表达,是控制肉芽肿形成的一个理想途径。版本1009.626

国家自然科学基金申请书第 6 页版本 1.009.626 病患者在彻底杀虫治疗后肝纤维化仍可继续发展 [8, 9]。因此，杀虫治疗后，使用针对肉芽肿免疫调节和抗纤维化的药物治疗显得更加迫切。但因为目前对虫卵肉芽肿形成以及由此引起纤维化的机制了解很少，所以，尚未成功研发出针对这两个环节、疗效确切、副作用少的化学药物 [2, 4]。研究虫卵肉芽肿形成以及由其引起纤维化的机制，研发疗效明确、副作用少，能直接抑制血吸虫虫卵肉芽肿形成、减轻或延缓纤维化的药物对降低血吸虫病发病率、提高生存质量、治疗病人、降低死亡率都具有十分重要的意义。日本血吸虫虫卵肉芽肿的形成与细胞及体液免疫有关，尤其是前者在肉芽肿形成早期起主要作用[2]。血吸虫尾蚴通过疫水经皮肤感染人体，先后经过童虫、成虫阶段，最后主要移行于肝门静脉和肠系膜静脉并寄生、产卵。虫卵随血流主要沉积于门静脉分支、肝血窦前，在此，虫卵内成熟的毛蚴分泌可溶性虫卵抗原（soluble egg antigen,SEA）并经卵壳上的微孔渗入肝周围组织。SEA 被周围组织中的巨噬细胞吞噬处理，经过处理的抗原被递呈到辅助性的 T 淋巴细胞（Th）。同时，摄取了抗原的巨噬细胞释放白细胞介素 1（IL-1），激活 TH，后者产生多种细胞因子，其中促进肉芽肿形成的有 IL-1、IL-2 、 IL-4 、IL-5、IL-13 等；抑制肉芽肿形成的有 IL-10、IL-2、IFN-γ等；还有各类细胞趋化因子、移动抑制因子等。在上述各种细胞因子的共同参与下，大量巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、浆细胞、成纤维细胞和嗜酸粒细胞等聚集到虫卵周围形成炎性肉芽肿，随后肉芽肿中心坏死，形成嗜酸性脓肿，卵内毛蚴逐渐死亡，SEA 分泌量减少，最终停止，肉芽肿退化并开始局部纤维化，由此可引出严重临床症状[2, 4]。在这些细胞因子中，IL-4、IFN-γ在日本血吸虫肉芽肿的形成和发展中起重要作用[2, 10]。IL-4 由 Th2 细胞产生，能促进 Th2细胞自身的增殖、分化并刺激自身和其它 Th2细胞分泌 IL-5，而 IL-5 通过刺激嗜酸粒细胞（EOS）增殖、分化而促进肉芽肿的炎性反应；IL-4 能诱导单核细胞分泌克隆刺激因子、促进巨噬细胞分化、促进淋巴细胞侵润而增强肉芽肿炎性反应； IL-4 通过刺激 B 淋巴细胞增殖分化并产生 IgE、IgG，而介导肉芽肿形成；此外， IL-4 可抑制 Th1细胞增殖，并下调 Th1细胞在肉芽肿炎性反应中的作用。IFN-γ由 Th1 细胞产生，能抑制 Th2细胞增殖和 IL-4、IL-5 产生，从而减轻肉芽肿炎症，此外 IFN-γ 还抑制Ⅰ、Ⅱ型胶原转录而减轻纤维化等。总之，在血吸虫感染早期，肉芽肿形成过程中，多种细胞因子均有增加，它们之间相互作用形成一个及其复杂的网络。这些细胞因子的综合作用调控着肉芽肿形成及以后纤维化的发生、发展。下调促进肉芽肿形成细胞因子和/或上调抑制肉芽肿形成细胞因子的表达，是控制肉芽肿形成的一个理想途径

国家自然科学基金申请书虽然目前对于血吸虫性肝纤维化的发生机制尚不清楚,但国际上对非血吸虫病性肝纤维化的发生机理研究较多,也较明确。肝纤维化是指肝脏纤维组织过度沉积,是纤维增生和分解不平衡的结果。反复或持续的慢性肝实质炎症、坏死,可使细胞外基质 ( extracellular matrix,ECM),主要为胶原纤维,合成过多而降解相对不足,从而形成肝纤维化,它是肝硬化的必经阶段。肝星状细胞( hepatic stellate cell,HsC) 目前被公认为是ECM的主要来源细胞,HSC的激活是肝纤维化形成初始的中心环节。所以,研究BSC的激活对探索血吸虫病肝纤维化发生机理及肝纤维化的有效预防均有特别重要的现实意义 HSC的激活是一个级联反应过程,其过程如下12:当肝脏受到各种损伤时,局部的肝细胞、枯否细胞(巨噬细胞)、窦内皮细胞、血小板、淋巴细胞、中性粒细胞等释放多种细胞因子,其中最主要的是血小板源性生长因子( platel et- derived growth factor,PDGF)和转化生长因子β( transforming growth factor-β1,TGFβ1)等, 它们共同作用于HSC,使其激活。被激活的HSC向肌成纤维细胞( myofibroblast,MB) 转化,同时表达大量的平滑肌肌动蛋白(a- Smooth muscle actin,a-SMA)、多种细胞因子受体(例如PDGF受体和TGFβ1受体等)、以及Ⅰ、Ⅲ型胶原等ECM成分:并且被激活的HSC自身又激活κ基因结合核因子( nuclear factor-K-gene- binding, NFKB)、分泌TGFβ1等细胞因子。此外,ECM中的Ⅰ型胶原等成分也可激活HSC。因此, 旦HsC被激活,受细胞旁分泌、自分泌的直接作用及所处环境胶原的间接作用,HSC 活化将逐渐放大并持续存在,即使除去诱因,活化也将继续下去。 HSC的激活主要是因为某些细胞因子作用于该细胞的信号转导通路所致,在这些细胞因子中,研究的最多,也最重要的是PDGF和TGFB113因子 PDGF为HSC最强的促分裂剂。枯否细胞(巨噬细胞)是主要合成PDGF的细胞肝脏受损时,枯否细胞、血小板、窦内皮细胞及激活的HSC均可以分泌PDGF。当其与 PDGF受体(为酪氨酸蛋白激酶受体)结合时,促使受体形成二聚体而被激活,随后受体的酪氨酸残基发生自身磷酸化,继而先后激活Ras、Raf-1、MAPK( mitogen-activated protein kinase)激酶、ERK( extracellular signal- regulated kinase)。ERK向核内转位,促进有关转录因子磷酸化及基因表达而引起HSC的活化、增殖第7页版本1009.626

国家自然科学基金申请书第 7 页版本 1.009.626 虽然目前对于血吸虫性肝纤维化的发生机制尚不清楚，但国际上对非血吸虫病性肝纤维化的发生机理研究较多，也较明确。肝纤维化是指肝脏纤维组织过度沉积，是纤维增生和分解不平衡的结果。反复或持续的慢性肝实质炎症、坏死，可使细胞外基质（extracellular matrix, ECM），主要为胶原纤维，合成过多而降解相对不足，从而形成肝纤维化，它是肝硬化的必经阶段 [4]。肝星状细胞（hepatic stellate cell, HSC）目前被公认为是 ECM 的主要来源细胞，HSC 的激活是肝纤维化形成初始的中心环节 [4, 11]。所以，研究 HSC 的激活对探索血吸虫病肝纤维化发生机理及肝纤维化的有效预防均有特别重要的现实意义。 HSC 的激活是一个级联反应过程，其过程如下[4, 12]：当肝脏受到各种损伤时，局部的肝细胞、枯否细胞（巨噬细胞）、窦内皮细胞、血小板、淋巴细胞、中性粒细胞等释放多种细胞因子，其中最主要的是血小板源性生长因子（platel et-derived growth factor, PDGF）和转化生长因子β（transforming growth factor-β1 ,TGFβ1）等，它们共同作用于 HSC，使其激活。被激活的 HSC 向肌成纤维细胞（myofibroblast，MFB）转化，同时表达大量的平滑肌肌动蛋白（α-Smooth muscle actin,α-SMA）、多种细胞因子受体（例如 PDGF 受体和 TGFβ1受体等）、以及Ⅰ、Ⅲ型胶原等 ECM 成分；并且被激活的 HSC 自身又激活κ基因结合核因子（nuclear factor-κ-gene-binding, NFκB）、分泌 TGFβ1等细胞因子。此外，ECM 中的Ⅰ型胶原等成分也可激活 HSC。因此，一旦 HSC 被激活，受细胞旁分泌、自分泌的直接作用及所处环境胶原的间接作用，HSC 活化将逐渐放大并持续存在，即使除去诱因，活化也将继续下去[4]。 HSC 的激活主要是因为某些细胞因子作用于该细胞的信号转导通路所致，在这些细胞因子中，研究的最多，也最重要的是 PDGF 和 TGFβ1 [4, 13, 14]因子。 PDGF 为 HSC 最强的促分裂剂 [4]。枯否细胞（巨噬细胞）是主要合成 PDGF 的细胞。肝脏受损时，枯否细胞、血小板、窦内皮细胞及激活的 HSC 均可以分泌 PDGF [4]。当其与 PDGF 受体（为酪氨酸蛋白激酶受体）结合时，促使受体形成二聚体而被激活，随后受体的酪氨酸残基发生自身磷酸化，继而先后激活 Ras、Raf-1、MAPK(mitogen-activated protein kinase)激酶、ERK（extracellular signal-regulated kinase）。ERK 向核内转位，促进有关转录因子磷酸化及基因表达而引起 HSC 的活化、增殖[4]

国家自然科学基金申请书 TGFβ1是一种对细胞生长、分化和多种生理、病理过程起重要调节作用的细胞因子。在肝受损时,TGFβ1由枯否细胞、淋巴细胞、窦内皮细胞及激活的HSC等合成,能促进 HSC的增殖和基因表达、抑制基质金属蛋白酶( matrix metalloproteinases,MPs) 合成、促进基质金属蛋白酶组织抑制因子( tissue inhibitors of mmps, TIMPs)合成、阻滞ECM的降解、促进ECM(例如,Ⅰ、Ⅲ型胶原)的生成。此外,TGFβ1还能增加PDGF 对HSC的增殖作用,故TGFβ1被认为是最强的促胶原生成因子,在肝纤维化的发生、发展过程中发挥关键作用。TGFβ1通过细胞内信号转导通路发挥作用,而 Smads是迄今为止发现的TGFB1惟一作用底物,故TGFβ1- Smads信号通路对HC激活、BCM产生的影响引起极大关注。 Smads是线虫Sma蛋白以及果蝇Mad蛋白具有同源性的蛋白家族,他们可以将TGFB 信号直接由细胞膜受体(为丝/苏氨酸受体)传导入细胞核内。根据 Smads功能不同分为三类:第一类是膜受体激活的Smad(R- Smads),包括Smad2、3等,它们可与TGFβ1 受体直接作用,并被磷酸化,之后与Smad4结合,转位入核以调节靶基因转录;第二类是通用Smad(co-Smad),目前只有Smad4;第三类是Smad7等,为TGFβ1-Smad信号转导通路的抑制因子,可与R- Smads竞争性地结合受体,阻止R- Smads的磷酸化,从而阻断TGFB1的效应。进入细胞核内的 Smads复合物可与不同的转录活化因子或转录抑制因子结合而调节TGFB1的生物效应1 总之,因为PDGF、TGFβ1Smad信号转导通路在肝纤维化发病中起着举足轻重的作用,干预这些信号通路就成为肝纤维化防治的理想选择如前所述,HSC活化时伴有NFKB激活,而NFKB是一种重要的抗凋亡基因转录因 151。当HSC处于静息状态时,NFKB与其抑制蛋白结合,不表现活性,当HSC被激活后,NFκB与其抑制蛋白解离而移位入核,诱导产生一组基因产物,它们的协同作用能抑制TNF-α诱发的 caspase-8激活从而抑制HSC的凋亡,使HSC持续活化。此外,B细胞淋巴瘤/白血病-2蛋白(B- cell lymphoma/ leukemia-2 protein,Bcl-2) 家族的成员是细胞凋亡的主要调节因子。Bc1-2蛋白家族细胞凋亡抑制因子有:Bc1-2、 Bcl-ⅪL等;细胞凋亡促进因子有:Bax等。有实验显示,给予抗肝纤维化的药物,可以使激活的HSC中的Bcl-2/Bax比率下调,从而促进HSC凋亡。所以,通过抑制NF-xB 活性以及下调Bc1-2/Bax比率来增加HSC凋亡可能成为肝纤维化治疗的新的靶点之第8页版本1009.626

国家自然科学基金申请书第 8 页版本 1.009.626 TGFβ1是一种对细胞生长、分化和多种生理、病理过程起重要调节作用的细胞因子。在肝受损时，TGFβ1由枯否细胞、淋巴细胞、窦内皮细胞及激活的 HSC 等合成，能促进 HSC 的增殖和基因表达、抑制基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases， MMPs）合成、促进基质金属蛋白酶组织抑制因子（tissue inhibitors of MMPs, TIMPs）合成、阻滞 ECM 的降解、促进 ECM（例如，Ⅰ、Ⅲ型胶原）的生成。此外，TGFβ1还能增加 PDGF 对 HSC 的增殖作用，故 TGFβ1被认为是最强的促胶原生成因子，在肝纤维化的发生、发展过程中发挥关键作用 [4, 13]。TGFβ1通过细胞内信号转导通路发挥作用，而 Smads 是迄今为止发现的 TGFβ1惟一作用底物 [4]，故 TGFβ1-Smads 信号通路对 HSC 激活、ECM 产生的影响引起极大关注。 Smads 是线虫 Sma 蛋白以及果蝇 Mad 蛋白具有同源性的蛋白家族，他们可以将 TGFβ1 信号直接由细胞膜受体（为丝/苏氨酸受体）传导入细胞核内。根据 Smads 功能不同分为三类：第一类是膜受体激活的 Smad (R-Smads)，包括 Smad2、3 等，它们可与 TGFβ1 受体直接作用，并被磷酸化，之后与 Smad4 结合，转位入核以调节靶基因转录；第二类是通用 Smad (co-Smad)，目前只有 Smad4；第三类是 Smad7 等，为 TGFβ1-Smad 信号转导通路的抑制因子，可与 R-Smads 竞争性地结合受体，阻止 R-Smads 的磷酸化，从而阻断 TGFβ1的效应。进入细胞核内的 Smads 复合物可与不同的转录活化因子或转录抑制因子结合而调节 TGFβ1的生物效应[4, 13]。总之，因为 PDGF、TGFβ1-Smad 信号转导通路在肝纤维化发病中起着举足轻重的作用，干预这些信号通路就成为肝纤维化防治的理想选择。如前所述，HSC 活化时伴有 NFκB 激活，而 NFκB 是一种重要的抗凋亡基因转录因子 [15, 16]。当 HSC 处于静息状态时，NFκB 与其抑制蛋白结合，不表现活性，当 HSC 被激活后，NFκB 与其抑制蛋白解离而移位入核，诱导产生一组基因产物，它们的协同作用能抑制 TNF-α诱发的 caspase-8 激活从而抑制 HSC 的凋亡，使 HSC 持续活化 [17, 18]。此外，B 细胞淋巴瘤/白血病-2 蛋白（B-cell lymphoma/leukemia-2protein，Bcl-2）家族的成员是细胞凋亡的主要调节因子[19]。Bcl-2 蛋白家族细胞凋亡抑制因子有:Bcl-2、 Bcl-XL 等；细胞凋亡促进因子有:Bax 等。有实验显示[20]，给予抗肝纤维化的药物，可以使激活的 HSC 中的 Bcl-2/Bax 比率下调，从而促进 HSC 凋亡。所以，通过抑制 NF-κB 活性以及下调 Bcl-2/Bax 比率来增加 HSC 凋亡,可能成为肝纤维化治疗的新的靶点之一

国家自然科学基金申请书 HSC活化后还表达多种MMPs、 TIMPS,从而调节ECM的成分和含量,使纤维化不断持续发展。MMPs是一组锌蛋白酶,共有5类不同的酶蛋白分子,包括胶原酶(MMPl、MP8、 MP13)、明胶酶(MMP2、MMP9)、基质分解素(MMP3、MMP10、MMPl1)等5类,它们能水解ECM中的多种成分,例如,其中的胶原酶水解ECM中的I、Ⅲ、Ⅲ型胶原:TMP 是MPs天然的体内抑制因子,包括TIMP-1~TIMP-4,它们与活化的MPs分子以1:1 的比例结合,抑制MPs活性,尤其是TMP-1在调节胶原水解中起重要作用2。此外, TIMP-1还能抑制活化的HSC凋亡四。显然,通过抑制TIMP-1即可以增加ECM中I、Ⅱl Ⅲ型胶原的水解,又可以促进HSC凋亡。所以,抑制TIMP-1将可能成为肝纤维化治疗的又一新的靶点。以上主要是关于血吸虫虫卵肉芽肿与细胞因子免疫调节的关系,以及非血吸虫病性肝纤维化发生的机理。但血吸虫病(尤其是日本血吸虫病)性肝纤维化发生机理如何, 至今知之甚少。例如,虫卵肉芽肿早期淋巴细胞、枯否细胞(巨噬细胞)、嗜酸粒细胞等分泌的细胞因子是否作为始动因子促进后续的肝纤维化的进程?是否也存在HSC的激活、增殖?从整体、细胞、蛋白质、和核酸分子水平上了解日本血吸虫病肝纤维化的发生机理是本项目研究内容之一。中医认为,肝纤维化主要因“气滞血瘀”所致,治疗上应以活血化瘀、疏肝理气抗炎保肝为主。而赤芍具有活血化瘀功效,白芍具有养血保肝、抗炎止痛等作用22, 所以,临床治疗肝纤维化中药方剂中,有不少含有赤芍、白芍成分。我们近年来研究发现,白芍总苷(为白芍的有效部位,其中芍药苷含量占70%以上)通过清除自由基及减少TGFβ1的生成,对抗人白蛋白所致的免疫性大鼠肝纤维化;此外,白芍总苷可以明显抑制佐剂性关节炎大鼠膝关节巨噬细胞样滑膜细胞的IL-1分泌,并且抑制成纤维样滑膜细胞内MAⅨK信号通路中ERK等的磷酸化、减弱成纤维样滑膜细胞的增殖。总之, 白芍总苷通过对T细胞、B细胞、巨噬细胞、滑膜成纤维细胞以及自由基、IL-1、IL-2 等的影响而发挥其抗炎、保肝、抗肝纤维化、以及双相免疫调节等作用赤芍( Radix paeoniae rubra)和白芍( Radix paeoniae alba)均取材于中药芍药( Paeonia lactiflora pall.)根圆。芍药苷( paeoniflorin)是芍药根的提取物, 也是白芍和赤芍的主要活性单体成分。芍药苷分子结构式为版本1009.626

国家自然科学基金申请书第 9 页版本 1.009.626 HSC 活化后还表达多种 MMPs、TIMPs，从而调节 ECM 的成分和含量，使纤维化不断持续发展。MMPs 是一组锌蛋白酶，共有 5 类不同的酶蛋白分子，包括胶原酶（MMP1、MMP8、 MMP13）、明胶酶（MMP2、MMP9）、基质分解素（MMP3、MMP10、MMP11）等 5 类，它们能水解 ECM 中的多种成分，例如，其中的胶原酶水解 ECM 中的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原；TIMPs 是 MMPs 天然的体内抑制因子，包括 TIMP-1～TIMP-4，它们与活化的 MMPs 分子以 1∶1 的比例结合，抑制 MMPs 活性 [4]，尤其是 TIMP-1 在调节胶原水解中起重要作用 [21]。此外， TIMP-1 还能抑制活化的 HSC 凋亡 [22]。显然，通过抑制 TIMP-1 即可以增加 ECM 中Ⅰ、Ⅱ、 Ⅲ型胶原的水解，又可以促进 HSC 凋亡。所以，抑制 TIMP-1 将可能成为肝纤维化治疗的又一新的靶点。以上主要是关于血吸虫虫卵肉芽肿与细胞因子免疫调节的关系，以及非血吸虫病性肝纤维化发生的机理。但血吸虫病（尤其是日本血吸虫病）性肝纤维化发生机理如何，至今知之甚少。例如，虫卵肉芽肿早期淋巴细胞、枯否细胞（巨噬细胞）、嗜酸粒细胞等分泌的细胞因子是否作为始动因子促进后续的肝纤维化的进程？是否也存在HSC的激活、增殖？从整体、细胞、蛋白质、和核酸分子水平上了解日本血吸虫病肝纤维化的发生机理是本项目研究内容之一。中医认为，肝纤维化主要因“气滞血瘀”所致，治疗上应以活血化瘀、疏肝理气、抗炎保肝为主 [4]。而赤芍具有活血化瘀功效，白芍具有养血保肝、抗炎止痛等作用 [23, 24]，所以，临床治疗肝纤维化中药方剂中，有不少含有赤芍、白芍成分 [4]。我们近年来研究发现，白芍总苷（为白芍的有效部位，其中芍药苷含量占 70%以上）通过清除自由基及减少 TGFβ1的生成，对抗人白蛋白所致的免疫性大鼠肝纤维化；此外，白芍总苷可以明显抑制佐剂性关节炎大鼠膝关节巨噬细胞样滑膜细胞的 IL-1 分泌，并且抑制成纤维样滑膜细胞内 MAPK 信号通路中 ERK 等的磷酸化、减弱成纤维样滑膜细胞的增殖。总之，白芍总苷通过对 T 细胞、B 细胞、巨噬细胞、滑膜成纤维细胞以及自由基、IL-1 、IL-2 等的影响而发挥其抗炎、保肝、抗肝纤维化、以及双相免疫调节等作用。赤芍（Radix Paeoniae Rubra）和白芍（Radix Paeoniae Alba）均取材于中药芍药（Paeonia lactiflora Pall.）根 [23]。芍药苷（paeoniflorin）是芍药根的提取物，也是白芍和赤芍的主要活性单体成分 [24]。芍药苷分子结构式为：