杭州大学学报 1989年 此重复传接3-5轮次 超薄切片与放射自显影术 1.2.1从病毒接种后的0分开始、↓冫3 」20分钟,6、12、24、48、72、1 小时,分别收集培养细胞,经戊二醛固定,1%锇酸重固定,Epon812包埋,切片经 酷酸双氧铂一佇模酸铅双璪色.对照材料不经病援种侵,收集细及制片方法相同 1.2.2选生长良好的细胞堵养物,经详接种后,邡入含放线磁素D0.05g/ml的培 养基.在接种后1和24小时计,H—嘧定(〔31-Uzd,比度20Ci/mM 浓度1mCi/ml终浓度1c0 mci/l)冰;标10分钟,立闺冲洗胞并固定.接种 6小时时卯入〔31-11(终浓度1:i/m)作持续标记,分别在12、24、48和72 小时时取材固定 另一部份细胞培齐讫,在病毒接种后,加入〔11一胸院脱氧核苷(3H-dT 比度41ci/mM,浓度1mCi/ml,终浓度1mCi/m)作持续标记,分别在12、24 48和72小时时取材定 上述固定材料,常规制成b00-800A切片,喷涂40-60A厚醭膜,涂布约1:1稀 释的HW核子乳胶(中国科学院原子能研究所),“曝光”45-60天,D1g-b显影剂 显影,30%硫代硫酸钠定影,制成放肘自显影标本,H-300、H--600电镜观察 果 2.1细胞经呼肠孤病接种后,CPE出现较迟,光学显做镜观察到感染120小时后的 培养细胞发生不均等收缩,出觐丝状突起,细胞质内颗粒性物质增多,色泽变暗,随后 细胞解体,从培养瓶壁脫落.少数残留瓶壁的细胞培养物萎缩呈破网状(图版Ⅱ,1) 受小RNA病毒感斗的细胞,48小时后即出现CP.细胞拉长,色泽变暗,随后也解 体而脱落,整个单层细出现明显的空斑(图版Ⅱ,2).电镜观察,病变细胞的结构 受损,如核周控肿胀,核孔扩大,内质网扩张或产生大量空泡,线粒体变态以及出现较 多的层板膜结构.病变细胞的最后结果是细胞解体,解体肘疠淼颗粒随之释放扩散 (图版五,3) 病毒致房的毒力,随在细胞中芗次传代而增强.用初从病鱼组织分离提纯的病毒接 种绷胞,仅50%左右的细胞出现CPE,细胞中病芗颗粒的效量也少,而经在细胞中传 代5轮后的病毒感染细胞,则几乎全部细胞发生典型的CPE,病毒颗粒增多,细胞大 量解体 22呼肠孤病毒分布于细胞核时近的细驰质中,有的被包围在囊泡中,病海颗粒呈六 边形,平均直径71m,可见心和内外双层衣壳,核心部份电子密度致密,直径52m, 病毒核壳体裸露无包膜,有部份病毒颗粒仅见衣壳而无核心部份(图版Ⅱ,4) 小RNA病毒近球形,但有些可辨出六边形,可见电子密度较高的核心,大小仅 24-30nm直径,无包膜.碳熟的病动出现于细抱质的囊泡内或聚集于细胞质的一定区 域(图版Ⅱ,5) 2.3从感染肠后收卬削:切片中可以看到开始时病痄吸附于细胞膜 上,继而细胞产生吞呱动诈,肟进八胞,在3-120分钟匀细题内部见到大小不等此 重 复 传 接 3一 s轮 次 杭 州 大 学 学 报 i989每 1．2 超 薄 切 片 与放 射 自显 影 术 1．2．1 从 病毒 接种 后 的 0分 开 始 ，每 ％ ：0、60、 120分 钟 ， 6、 i2、 24、48、 72、 120 小 时，分 别收集培养 细胞，经戊二醛 固定， 1 锇酸重 固定，Epon 812包埋， 切片 经 醋酸 双氧 铀一柠檬酸铅 双染 色 ．对照材料不经 病毒 接种侵染 ，收集绍 匏及制片方法相同 ． 1．2．2 选生长 良好 的缩胞培养 物 ，经病毒接种后 ，加^含放 线 菌 素 D O．0S~g／ml的培 养基 ．在 接 种 后 l2和 24小 时 对 ，削 [ H]一 尿 嘧淀 接 苷 ((。I{]一 Urd，比 度 2~?CUmM， 旅度 1mCi／ml，终浓度 l00mCJ／：mi)脉冲标记 】0分钟，立 即冲冼细胞 并固 定 ．接 种 6小时时加A (。H]-_u’d(终浓度 1：v．CU'm1)作持 续标 记，分 日4在 j2、24、d8和 72 小 时 时取 材 固定 ． 男一部份 细胞培养 物 ，在病毒按种后 ，加 ^ [II：一 胸腺嘧 啶脱氧核苷([。H]一dT， 比度 41Ci／mM，}农度 ln1Ci／ml，终浓度 lm Ci／m1)作持 续标记，分 别 在 12、24、 48和 72小 时 时 取 材 定 ． 上述固定材料 ，常规制成 600-800：,切片，喷涂 40—6O盖厚碳膜，涂 布 约 l：1稀 释的 Hw。核子 乳胶 (中国科学院原 子能研究所 )， “曝光”45— 60天 ，D 一 显影 荆 显影，30 硫代 硫酸钠定影 ，制成放 射 自显影标 本，H一3∞、H--600电镜观察 ． 2 结 果 2．1 细 胞 经 呼肠 孤 旃 毒 接种 后 ， CPE 出 现 较 迟 ， 光 学 显 微 镜 观察 到感 染 120小 时后 的 培 养细胞发生不均等收缩，出现丝状突起，细 胞质 内颗粒 性物质增多 ，色泽变暗 ，随后 细 胞解 体，从培葬瓶壁脱落 ．少数残 留瓶壁 的细 胞培养物 婪缩 呈破 网状 (圉版 Ⅱ，1)． 受小 RNA 病毒感 染的细 胞，48小 时后 即出现 CPE 细胞拉长，色泽变暗，随 后 也 解 体而脱 落，整个单 层细胞出现明显的空斑 (图版 Ⅱ， 2)．电镜观察，病变 细胞 的结构 受损，如梭 周腔肿胀，饺孔扩大， 内质网扩 张或 产生 大量空袍，线粒体变态 以及 出现较 多的层板膜结构 ．病变细胞 的最后结 果是细 胞解体 ，解体时病毒颗粒隧之 释 放 扩 散 ． (图版 Ⅱ，3) 病毒致病的毒力 ，随 在细 匏中多次传代 而增强 ．用 初从 病鱼组织分 离提纯的病毒接 种细胞，仅 sO％ 左右 的细胞 出现 CPE，细 胞中病毒颗粒的数量也少，而 经在细 胞中 传 代 S轮后的病毒感染细胞，则几乎全部细胞发生典型的 CPE，病毒 颗粒增 多，细 胞 大 量解体 ． 2．2 呼肠孤病毒分布 于细 胞核附近的细胞质中，有 的被包围在囊泡 中，病毒颗粒 呈 六 边形 ，平均直径 5'5nm，可 见棱心稻 内外 双层衣壳 ，核心部份电子密度致密 ，直 径 S2nm， 病 毒核 壳律裸露 无包膜 ，有部 份病 毒颗粒仅 见衣壳丽无核心部份 (图版 Ⅱ， 4 )． 小 RNA 病 毒 近 球形 ， 但 有 些 可 辨 出六 边 形 ， 可 见 电子 密度 较 高 的 核 心 ， 大 小 倥 24—3Onm 直径，无包膜 ．成熟 的病毒 出现于细 胞质的囊泡 内或聚集于细胞质的一定区 域 (图 版 Ⅱ 5 ，． 2．3 从感 染 呼肠 疆 瘩 一 看问 黼 收浆 州 蜘 饱 如片 中 可以看 到 开 始 时 病 毒 吸 附 于 细 胞 膜 上，继 而细胞产生吞噬动作，病埠进^湖 也 ．在 3u～ 讹0分钟 内 ，细胞 内部见到大小不等 维普资讯 http://www.cqvip.com