DNA重组与细胞转化及重组 DNA的提取和酶切鉴定 实验组员:王晨辰,王嘐嘐,宋杨 指导老师:潘鸾凤,王松梅 实验时间:2012.09.14.2012.0921 实验目的 学习DNA克隆技术和细胞转化的概念及其在分子生物学研究中的意义,掌握氯化钙制备大 肠杆菌感受态细胞和外源质粒DNA转入受体菌并筛选转化的方法;学习和掌握质粒的快速 提取纯化、限制性内切酶酶切及琼脂糖凝胶电泳等方法和技术。 实验原理 DNA重组与细胞转化 将用EcoR和Ca出来的14 kb c-myc DNA片段在T4DNA连接酶的作用下,连接入同样 经EcOR和Ca切开的pBR322质粒载体上,以 E coli HB101菌株为受体细胞,用CaC处 理受体菌使其处于感受态,然后与pBR322质粒共保温,实现转化。pBR322质粒谢带有抗 氨苄青霉素的基因,因而使接受了该质粒的受体菌具有抗氨苄青霉素的特性,用Amp表 示。将经过转化后的受体细胞在含氨苄青霉素的平板培养基上培养,只有转化体才能存 活,而未受转化的受体细胞则因无抵抗氨苄青霉素的能力而死亡。 重组质粒的提取及酶切鉴定 因质粒在细胞内具有高拷贝数,本实验用小量制备法抽提质粒DNA即可获得足量DNA用于 基因操作。本实验采用碱变性法抽提质粒,其原理是基于染色体DNA和质粒DNA的变性与 复性的差异而达到分离目的。在pH高达126的碱性条件下,染色体DNA的氢键断裂,染 色体DNA的氢键断裂,双螺旋解构变性,而质粒DNA超螺旋共价闭合环状的两条互补链不 会完全分离,用pH4.8NaAc高盐缓冲液重新调节pH至中性时,质粒DNA复性,而染色体 DNA不能复性,通过离心,与不稳定的大分子RNA、蛋白质SDS复合物等一起沉淀下来 而被除去。分离质粒DNA的方法包括三个基本步骤:(1)培养细菌使质粒扩增;(2)收 集和裂解细菌;(3)分离和纯化质粒DNA。十二烷基硫酸钠(SDS)可使细胞壁裂解, 细菌染色体DNA缠绕附着在细胞壁碎片上,离心时易被沉淀出来,而质粒DNA则留在上清 王晨辰·复旦大学上海医学院临床医学八年制·06301010250