液中。用乙醇沉淀、洗涤,可得到质粒DNA。将经限制性内切酶EXOR|和cla酶切的质粒 DNA进行琼脂糖凝胶电泳,将出现两条区带:43 kb pBr322质粒载体片段和14 kb c-myc 目的基因片段。 实验器材和试剂 器材 恒温摇床,电热恒温箱培养箱,无菌操作超净台,恒温振荡器,电热恒温水浴,台式离心 机,低温高速离心机,漩涡振荡器,电泳槽及电泳仪,紫外观察仪,移液枪和枪头,细 菌培养管,15 ml Eppendorf管,15m离心管,冰浴,接种环,长玻璃试管,滴管,刻度 吸管等。 试剂 用EcoR|和cal处理的pBR322线状DNA(20ng/仙;用EcoR|和cal处理的14 kb c-myc DNA片段(20ng/u);T4DNA连接酶(0Uu);10×连接酶缓冲液;6×凝胶加样缓冲 液;已经装有cmyc目的片断的pBR322质粒DNA(5ng/u);LB培养基;含琼脂的LB培 养基;0.1 mol/L CaC|2;氨苄青霉素储存液;提取重组质粒DMA试剂盒(包含LB培养基, Buffer s1, Buffer S2, Buffer S3, RNase A, 1xTAE: BufferW1, BufferW2 Eluent);10xmui- core buffer; EcoR I;cal;乙酰化BSA; gelLed; Agarose等。 实验步骤 DNA重组与细胞转化 DNA片段连接 1)向1.5 ml Eppendorf管中加入连接反应物如下 14kb目的基因片段(20ng/)2.5μ 4.3kb载体DNA(20ng小p)25 10x连接 Buffer dd h20 3.5 T4DNA连接酶 05μl 总体积 10 2)混匀并短暂离,置于16°水浴中温育2小时 王晨辰·复旦大学上海医学院临床医学八年制·06301010250