2.制备感受态细胞 1)用移液枪移取0.1m大肠杆菌菌液,加入已装有5mlLB培养液的玻璃试管中。于37℃C 温箱中振摇培养2小时,直至内眼呈云雾状。 2)在酒精灯旁将该5m细菌培养物倒入冰预冷的15m离心管中,冰浴10min。 3)4000m下冷离心10mn 4)酒精灯旁弃去离心管上清,并于纸巾上控干剩余液体。用1m0.1 mol/L CaC|2重悬沉 淀,吹打均匀,移入15 ml Eppendorf管中,冰浴10min 5)4000rpm下冷离心10mn 6)再次于酒精灯旁弃去管内上清,并于纸巾上控干剩余液体。用200p0.1 mol/L CaC2重 悬沉淀,吹打均匀,使细菌处于感受态。 7)分别分装50感受态细菌于两只新 Append管中,分别标记为“转化和+”(阳性对 照),立即转化。 3.转化 1)在酒精灯旁分别向两管中加入1连接产物质粒DNA和已知阳性对照质粒DNA。冰浴 30min。 2)42℃水浴中热休克90s,迅速取出。 3)在无菌条件下分别加人LB培养液150μ,盖好管盖,37℃振摇45min使其复苏 4)在酒精灯旁分别从两管中取100u菌液,分别于含AmpC(60pg/m)的LB平板上涂板 (分别标记为“转化”和+"),令其均匀分布,放入37℃温箱中倒置2小时,待液体充分收 干后改为平放,继续在37C下培养过夜 重组DNA的提取和酶切鉴定 1.重组质粒的小量快速制备 1)在50m离心试管中加入10m含60 uIml Amp的LB培养液,从重组质粒转化细菌涂布的 平板上挑取一个单菌落接种于其中,37℃温箱中震荡培养过夜。 2)取 Eppendo一只,向其中倒入15m菌液,12000×g离心1min,弃去上清,并于纸巾 上控干液体 3)重新向 Eppendor中倒入15m菌液,再次12000×g离心1mn,弃上清,纸巾上控干液 体 晨辰·复旦大学上海医学院临床医学八年制·06301010250