GAATTC GAATTC CTTAAG CTTAAG Cleave with EcoRl restriction enzyme AATTC G AATTC CTTAA CTTAA Anneal DNA fragments and rejoin with DNA ligase GAATTC GAATTC CTTAAG CTTAAG 图5.10粘性末端将DNA分子结合。两个DNA分子用同一限制性内切酶酶切，产生的DNA 片段用DNA连接酶连接生成重组DNA分子。 可以用化学合成的DNA接头(linker)制造这种粘性末端。首先将这种化学合成的接 头与平端的DNA片段连接。例如十聚核苷酸的接头用多核苷酸激酶将5'-末端磷酸化，然后 用T4-DNA连接酶连接（图5.II)。这种连接酶能够将平端DNA分子共价连接。接头部分 有限制性切，点，用限制性内切酶酶切产生粘性末端。因此任何DNA分子都可以用这种方法 制造粘性末端。将化学合成和酶学方法结合制造新DNA分子。 5'⊙ H3 3′H0- -®5' DNA fragment or vector T4 ligase 5'⊙-CGGAATTCGG-OH3' 3'Ho-GGCTTAAGCC-⊙5' Decameric linker 5'⊙-CGGAATTCGG CGGAATTCGG-OH 3' 3'HO-GGCTTAAGCC GGCTTAAGCC-(P)5' EcoRl restriction enzyme 5P-AATTCGG CGG-OH HO-GCC GGCTTAA-P5 图5.11粘性末端的形成。添加化学合成的接头，然后用限制性内切酶酶切，形成粘性末端。 质粒和入噬菌体是在大肠杆菌进行DNA克隆的选择性载体 基因工程用的很多质粒和噬菌体已经被修改，目的是促进重组DNA分子进入细菌或易 于选择携带这种载体的细菌。质粒是一些细菌中天然存在的染色体外遗传物质，使双链环状 DNA分子，长度在2kb到几百kb之间。质粒携带的基因能失活抗生素、制造毒素、分解天 然产物。质粒能独立于细菌染色体的方式进行复制。与宿主基因组不同，在一定条件下，质 粒是细菌不可或缺的。每个细菌可以完全没有质粒，也可以有20拷贝的质粒。 pBR322质粒.第一个用于基因克隆的质粒是pBR322。这个质粒有两个抗生素基因，分 别是四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因。不同限制性内切酶能够在该质粒的不同位点发 生酶切。这些限制性酶切位点可以插入外源DNA片段。在EcoRI位，点插入外源DNA片段 不影响质粒的两种抗生素抗性基因。在SaⅢ或BamHⅢ位，点插入外源DNA导致四环素抗性 基因失活（图5.12）。DNA片段插入导致基因失活得现象叫插入失活。细胞携带的在SalⅢ 或BamHⅢ位，点插入外源DNA的pBR322能够耐受氨苄抗生素，但不能耐受四环素，因此可 以利用抗生素来选择重组质粒。没有摄取质粒的大肠杆菌对四环素、氨苄青霉素都敏感。图 5.10 粘性末端将 DNA 分子结合。两个 DNA 分子用同一限制性内切酶酶切，产生的 DNA 片段用 DNA 连接酶连接生成重组 DNA 分子。 可以用化学合成的 DNA 接头（linker）制造这种粘性末端。首先将这种化学合成的接 头与平端的 DNA 片段连接。例如十聚核苷酸的接头用多核苷酸激酶将 5'-末端磷酸化，然后 用 T4-DNA 连接酶连接（图 5.11）。这种连接酶能够将平端 DNA 分子共价连接。接头部分 有限制性切点，用限制性内切酶酶切产生粘性末端。因此任何 DNA 分子都可以用这种方法 制造粘性末端。将化学合成和酶学方法结合制造新 DNA 分子。 图 5.11 粘性末端的形成。添加化学合成的接头，然后用限制性内切酶酶切，形成粘性末端。 质粒和噬菌体是在大肠杆菌进行 DNA 克隆的选择性载体 基因工程用的很多质粒和噬菌体已经被修改，目的是促进重组 DNA 分子进入细菌或易 于选择携带这种载体的细菌。质粒是一些细菌中天然存在的染色体外遗传物质，使双链环状 DNA 分子，长度在 2kb 到几百 kb 之间。质粒携带的基因能失活抗生素、制造毒素、分解天 然产物。质粒能独立于细菌染色体的方式进行复制。与宿主基因组不同，在一定条件下，质 粒是细菌不可或缺的。每个细菌可以完全没有质粒，也可以有 20 拷贝的质粒。 pBR322 质粒. 第一个用于基因克隆的质粒是 pBR322。这个质粒有两个抗生素基因，分 别是四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因。不同限制性内切酶能够在该质粒的不同位点发 生酶切。这些限制性酶切位点可以插入外源 DNA 片段。在 EcoRI 位点插入外源 DNA 片段 不影响质粒的两种抗生素抗性基因。在 SalI 或 BamHI 位点插入外源 DNA 导致四环素抗性 基因失活（图 5.12）。DNA 片段插入导致基因失活得现象叫插入失活。细胞携带的在 SalI 或 BamHI 位点插入外源 DNA 的 pBR322 能够耐受氨苄抗生素，但不能耐受四环素，因此可 以利用抗生素来选择重组质粒。没有摄取质粒的大肠杆菌对四环素、氨苄青霉素都敏感