第五章基因和基因组研究技术 从caterpillar发展成蝴蝶，基因表达谱发生了一系列显著变化。用DNA芯片能同时检测成 千上万个基因的表达水平。右边是一张基因芯片，显示人的12000多种基因表达水平。每个 点的量度表示该基因的表达强度。 自从1970年代出现DNA重组技术以来，重组DNA技术给生物化学带来了革命性进步。 生物个体的遗传特征能够根据人类设计加以改造。重组DNA技术是人类对DNA,RNA, 和病毒研究进行了几十年研究的结晶。该技术取决于酶切、连接、和复制DNA的酶和RNA 反转录。限制性内切酶能够将很长的DNA分子特异断裂成易于操作的DNA片段：DNA连 接酶能够将DNA片段连接。现在已经有很多限制性内切酶。采用这种技术，研究人员能够 将将DNA片段从一个DNA分子转移到另一DNA分子中。因此重组DNA技术的基础是核 酸酶学 第二个基础是碱基配对，即序列互补的核酸链相互间自动识别、自动结合形成核酸双链。 用互补DNA或RNA探针杂交检测特异核酸序列灵敏度高。在重组DNA技术中，碱基配对 用于重组DNA构建、检测和扩增特异核酸序列。重组DNA技术也依赖病毒。病毒能有效 地将自身DNA(或RNA)供应宿主，挟持宿主复制病毒基因组、合成病毒蛋白质，或将病毒 DNA整合到宿主基因组中。质粒是细菌染色体外的遗传物质，这种遗传物质对重组DNA 技术而言也是不可或缺的。 第三，已经建立了非常有效的DNA序列测定技术。这些技术能够测定全基因组序列。 最先测定的是病毒基因组，随后是更长的细菌基因组，最后测定的是真核基因组，包括30 亿碱基对长的人类基因组。科研人员正在开始探讨这些基因组序列的海量信息。 这些新技术极大地促进了相关领域的科学研究。即可以在天然环境中、也可以在其它条 件下研究某个基因或基因产物的作用。以某种方式改造基因，制造变异蛋白质能够详细了解 蛋白质的功能。重组DNA技术能够制造临床上有用的蛋白质，如激素：也能用来制造耐受 病虫害或恶劣生长环境的农作物。重组DNA技术提供的这些机会将产生更大的影响
第五章 基因和基因组研究技术 从 caterpillar 发展成蝴蝶，基因表达谱发生了一系列显著变化。用 DNA 芯片能同时检测成 千上万个基因的表达水平。右边是一张基因芯片，显示人的 12000 多种基因表达水平。每个 点的量度表示该基因的表达强度。 自从 1970 年代出现 DNA 重组技术以来，重组 DNA 技术给生物化学带来了革命性进步。 生物个体的遗传特征能够根据人类设计加以改造。重组 DNA 技术是人类对 DNA，RNA， 和病毒研究进行了几十年研究的结晶。该技术取决于酶切、连接、和复制 DNA 的酶和 RNA 反转录。限制性内切酶能够将很长的 DNA 分子特异断裂成易于操作的 DNA 片段；DNA 连 接酶能够将 DNA 片段连接。现在已经有很多限制性内切酶。采用这种技术，研究人员能够 将将 DNA 片段从一个 DNA 分子转移到另一 DNA 分子中。因此重组 DNA 技术的基础是核 酸酶学 第二个基础是碱基配对，即序列互补的核酸链相互间自动识别、自动结合形成核酸双链。 用互补 DNA 或 RNA 探针杂交检测特异核酸序列灵敏度高。在重组 DNA 技术中，碱基配对 用于重组 DNA 构建、检测和扩增特异核酸序列。重组 DNA 技术也依赖病毒。病毒能有效 地将自身 DNA(或 RNA)供应宿主，挟持宿主复制病毒基因组、合成病毒蛋白质，或将病毒 DNA 整合到宿主基因组中。质粒是细菌染色体外的遗传物质，这种遗传物质对重组 DNA 技术而言也是不可或缺的。 第三，已经建立了非常有效的 DNA 序列测定技术。这些技术能够测定全基因组序列。 最先测定的是病毒基因组，随后是更长的细菌基因组，最后测定的是真核基因组，包括 30 亿碱基对长的人类基因组。科研人员正在开始探讨这些基因组序列的海量信息。 这些新技术极大地促进了相关领域的科学研究。即可以在天然环境中、也可以在其它条 件下研究某个基因或基因产物的作用。以某种方式改造基因，制造变异蛋白质能够详细了解 蛋白质的功能。重组 DNA 技术能够制造临床上有用的蛋白质，如激素；也能用来制造耐受 病虫害或恶劣生长环境的农作物。重组 DNA 技术提供的这些机会将产生更大的影响
5.1基因研究的关键工具 生物技术的迅猛发展实际上是几个关键技术的产物 1.限制性内切酶分析。限制性内切酶是精确的剪切DNA分子的手术刀，使研究人员能够 操纵DNA片段。 2.印迹技术。Southern blots和Northern blots能分别用来分离和鉴定DNA和RNA。在前 面介绍的Western blots采用抗体鉴定蛋白质。 3.DNA序列测定。该技术能够测定DNA分子的碱基序列。DNA序列测定产生了大量的 信息，这些信息涉及基因结构、基因表达调控、和蛋白质结构。 4.核酸固相合成。能够化学合成所需序列的核酸分子用于鉴定或扩增其它核酸。 5.聚合酶链式反应(PCR)。PCR能使特定DNA片段扩增上十亿倍。PCR反应能够将一个 DNA分子扩增到足以进行DNA鉴定和操作的产量。该技术用于病原体鉴定和遗传病 诊断、确定犯罪现场毛发来源、复活化石的基因。 6.最后的一套技术依赖计算机，将在第6章介绍。没有计算机技术，我们不可能对大量信 息（尤其是DNA序列信息）进行分类、检索、和鉴定。而这些信息就是用前面提到的 那些技术获得的。 限制性内切酶能够将DNA分子断裂成特异片段 限制酶也叫限制性核酸内切酶，能够识别双链DNA的特定碱基序列并在特定位点断裂 DNA双链。这种精确的分子手术刀是大自然馈赠给生物化学工作者的礼物。分析染色体结 构、测定非常长的DNA序列、分离基因、制造能被克隆的DNA分子都离不开限制性内切 酶。在l960年代后期，Werner Alber和Hamilton Smith发现了限制性内切酶，Daniel Natherns 首先应用限制性内切酶。 不同原核生物都有限制性内切酶。限制性内切酶的生物功能是断裂外源DNA分子，但 由于限制酶识别位点的碱基序列已被甲基化，因此限制酶不断裂生物自身的DNA分子。很 多限制酶识别的核酸序列长度是4~8个碱基对，这个区域两条核酸链都会被这个核酸内切 酶水解。这些酶识别序列的显著特征是多数限制酶识别位点具有二重旋转对称。换句话说， 使回文结构，或倒置重复。限制性内切酶断裂位点也处于核酸链的对称位置。例如，来源于 Streptomyces achromogenes的限制性内切酶识别的核苷酸序列是 Cleavage site ↓ 5'C一C一G一C一G一G3' 3' G-G-C+G-c-c 5 Cleavage site Symmetry axis 这个酶水解对称轴两侧的C-G磷酸二酯键。在第9章所介绍的内容指出，限制性核酸 内切酶酶切位，点的对称性是由核酸内切酶自身结构决定的。 现在已经鉴定并纯化的限制性内切酶有几百种。对这些限制性内切酶的命名方案是前面 的三个斜写字母表示限制性内切酶的菌种来源（例如Eco表示限制酶来自Esterichia coli,Hin 表示限制酶来自Haemophilus influenzae,Hae表示限制酶来自Haemophilus aegyptius),后面 是菌株名（如有必要)和罗马数字（如果同一菌株分离出一种以上的限制性内切酶）。图51 列出了几个限制性内切酶的酶切位点
5.1 基因研究的关键工具 生物技术的迅猛发展实际上是几个关键技术的产物 1. 限制性内切酶分析。限制性内切酶是精确的剪切 DNA 分子的手术刀，使研究人员能够 操纵 DNA 片段。 2. 印迹技术。Southern blots 和 Northern blots 能分别用来分离和鉴定 DNA 和 RNA。在前 面介绍的 Western blots 采用抗体鉴定蛋白质。 3. DNA 序列测定。该技术能够测定 DNA 分子的碱基序列。DNA 序列测定产生了大量的 信息，这些信息涉及基因结构、基因表达调控、和蛋白质结构。 4. 核酸固相合成。能够化学合成所需序列的核酸分子用于鉴定或扩增其它核酸。 5. 聚合酶链式反应(PCR)。PCR 能使特定 DNA 片段扩增上十亿倍。PCR 反应能够将一个 DNA 分子扩增到足以进行 DNA 鉴定和操作的产量。该技术用于病原体鉴定和遗传病 诊断、确定犯罪现场毛发来源、复活化石的基因。 6. 最后的一套技术依赖计算机，将在第 6 章介绍。没有计算机技术，我们不可能对大量信 息（尤其是 DNA 序列信息）进行分类、检索、和鉴定。而这些信息就是用前面提到的 那些技术获得的。 限制性内切酶能够将 DNA 分子断裂成特异片段 限制酶也叫限制性核酸内切酶，能够识别双链 DNA 的特定碱基序列并在特定位点断裂 DNA 双链。这种精确的分子手术刀是大自然馈赠给生物化学工作者的礼物。分析染色体结 构、测定非常长的 DNA 序列、分离基因、制造能被克隆的 DNA 分子都离不开限制性内切 酶。在 1960 年代后期，Werner Alber 和 Hamilton Smith 发现了限制性内切酶，Daniel Natherns 首先应用限制性内切酶。 不同原核生物都有限制性内切酶。限制性内切酶的生物功能是断裂外源 DNA 分子，但 由于限制酶识别位点的碱基序列已被甲基化，因此限制酶不断裂生物自身的 DNA 分子。很 多限制酶识别的核酸序列长度是 4 ~ 8 个碱基对，这个区域两条核酸链都会被这个核酸内切 酶水解。这些酶识别序列的显著特征是多数限制酶识别位点具有二重旋转对称。换句话说， 使回文结构，或倒置重复。限制性内切酶断裂位点也处于核酸链的对称位置。例如，来源于 Streptomyces achromogenes 的限制性内切酶识别的核苷酸序列是 这个酶水解对称轴两侧的 C-G 磷酸二酯键。在第 9 章所介绍的内容指出，限制性核酸 内切酶酶切位点的对称性是由核酸内切酶自身结构决定的。 现在已经鉴定并纯化的限制性内切酶有几百种。对这些限制性内切酶的命名方案是前面 的三个斜写字母表示限制性内切酶的菌种来源（例如 Eco 表示限制酶来自 Esterichia coli, Hin 表示限制酶来自 Haemophilus influenzae，Hae 表示限制酶来自 Haemophilus aegyptius），后面 是菌株名（如有必要）和罗马数字（如果同一菌株分离出一种以上的限制性内切酶）。图 5.1 列出了几个限制性内切酶的酶切位点
5'GGATCC 3' BamHI 3'CCTAGG 5' 个 5'GAATTC 3' EcoRI 3'CTTAAG 5' ↓ 5'GGCC 3 Haelll 3'CCGG 5 ↑ ↓ 5'GCGC 3 Hhal 3'CGCG 5 5'CTCGAG3' Xhol 3'GAGCTC5' Figures. ry.Sixth Edition 2007 W.H.Freeman and Compary 图51一些限制性内切酶的特异性。这些酶识别序列有二重对称轴。围绕该对称轴（绿色) 旋转180度，序列与原始序列相同。红色箭头标出限制酶的酶切位置。右边是限制酶的缩写 名称。注意：有些限制酶平切，有些限制酶错开切（产生粘性末端）。 限制性内切酶能够将DNA分子断裂成易于进行分析和操纵的特异片段。例如长度为 5.1kb的SV40是双链环状DNA,能产生肿瘤。这个DNA分子有一个EcoRI切点，4个Hpal 切点，和I1个HimdⅢ切点。一个限制性内切酶酶切DNA的产物可以用另一个限制性内切 酶酶切产生更小的DNA片段。DNA分子为限制性内切酶酶切产生的DNA片段图谱可以作 为该DNA分子的指纹。实际上，用一些列限制型内切酶酶切产生的限制型内切酶图谱可以 对复杂染色体进行作图（这样的染色体可能含有数亿碱基对）。 凝胶电泳分离、检测限制酶酶切的DNA片段 由于凝胶电泳能够分离、显示限制酶酶切的DNA片段，因此能够检测DNA分子间的 细小差异。凝胶电泳的种类很多，大多数凝胶电泳的迁移率与DNA分子式量的对数值呈负 线性关系（在一定的分子式量范围内）。聚丙烯酰胺凝胶的范围达到1000碱基对，而琼脂糖 凝胶孔径更大，分子范围达到20b。这些凝胶电泳的一个典型特征是分辨率高有些凝胶电 泳条件能够区分在几百个碱基对长的DNA分子间只相差一个核苷酸的DNA片段。而且长 度达到数百万碱基对长度的整条染色体也能用琼脂糖凝胶电泳分离。此时采用的电场是在不 同方向施加脉冲电场（即脉冲电场凝胶电泳，P℉GE)。染色体在拉伸和松弛方面有差异，因 此短期内施加和切断电场能够在琼脂糖凝胶上分离染色体。放射性自显影能够显示凝胶上同 位素标记的DNA样品条带或点。另外，用溴化乙锭染色也能显示凝胶上的DNA分子。当 溴化乙锭插入DNA双螺旋，DNA分子显示强烈的橘红色荧光（图5.2）。一个条带只有50ng 的DNA量就足以用溴化乙锭显色观察
图 5.1 一些限制性内切酶的特异性。这些酶识别序列有二重对称轴。围绕该对称轴（绿色） 旋转 180 度，序列与原始序列相同。红色箭头标出限制酶的酶切位置。右边是限制酶的缩写 名称。注意：有些限制酶平切，有些限制酶错开切（产生粘性末端）。 限制性内切酶能够将 DNA 分子断裂成易于进行分析和操纵的特异片段。例如长度为 5.1kb 的 SV40 是双链环状 DNA，能产生肿瘤。这个 DNA 分子有一个 EcoRI 切点，4 个 HpaI 切点，和 11 个 HindIII 切点。一个限制性内切酶酶切 DNA 的产物可以用另一个限制性内切 酶酶切产生更小的 DNA 片段。DNA 分子为限制性内切酶酶切产生的 DNA 片段图谱可以作 为该 DNA 分子的指纹。实际上，用一些列限制型内切酶酶切产生的限制型内切酶图谱可以 对复杂染色体进行作图（这样的染色体可能含有数亿碱基对）。 凝胶电泳分离、检测限制酶酶切的 DNA 片段 由于凝胶电泳能够分离、显示限制酶酶切的 DNA 片段，因此能够检测 DNA 分子间的 细小差异。凝胶电泳的种类很多，大多数凝胶电泳的迁移率与 DNA 分子式量的对数值呈负 线性关系（在一定的分子式量范围内）。聚丙烯酰胺凝胶的范围达到 1000 碱基对，而琼脂糖 凝胶孔径更大，分子范围达到 20kb。这些凝胶电泳的一个典型特征是分辨率高有些凝胶电 泳条件能够区分在几百个碱基对长的 DNA 分子间只相差一个核苷酸的 DNA 片段。而且长 度达到数百万碱基对长度的整条染色体也能用琼脂糖凝胶电泳分离。此时采用的电场是在不 同方向施加脉冲电场（即脉冲电场凝胶电泳，PFGE)。染色体在拉伸和松弛方面有差异，因 此短期内施加和切断电场能够在琼脂糖凝胶上分离染色体。放射性自显影能够显示凝胶上同 位素标记的 DNA 样品条带或点。另外，用溴化乙锭染色也能显示凝胶上的 DNA 分子。当 溴化乙锭插入 DNA 双螺旋，DNA 分子显示强烈的橘红色荧光（图 5.2）。一个条带只有 50 ng 的 DNA 量就足以用溴化乙锭显色观察
二品2n 图52限制性核酸内切酶酶切SV40DNA分子的凝胶电泳图谱。每孔相应于一种核酸内切 酶。DNA片段用溴化乙锭染色显示出荧光。 限制片段长度多态性(RFLP) Southern blotting能用来跟踪特定基因的遗传情况。如果限制性酶切位，点发生变异，限 制性内切酶酶切DNA片段的长度就会发生改变，导致Southern blot分析显示的DNA条带 位置发生改变。人群存在的遗传差异性叫多态性。这种突变可能本身就是致病变异，也有 可能与致病变异紧密连锁。遗传疾病如镰刀性贫血症、囊性纤维病变、Huntington chorea 可以用RFLP分析鉴定。 硝酸纤维素膜置于3P标记的DNA探针溶液杂交，探针能够结合与探针序列互补的 DNA片段，放射性自显影能够显示这条DNA片段所在的位置。这种方式能够从成千上万 种DNA片段中找出某一特定DNA片段（就像大海捞针）。这个技术是Edwin Southern设计 的，因此成这种检测技术是Southern blotting(印迹)。 DNA fragments e Add DNA -labeled DNA probe Autoradiography Agarose Nitrocellulo Autoradiogram gel sheet 品 图5.3 Southern Blotting.先用电泳将DNA片段混合物分离，转移到硝酸纤维膜上，与p 标记的DNA探针（序列与目标DNA序列互补）杂交。然后用放射性自显影观测目标DNA 条带。 也可以用类似的技术鉴定RNA分子。RNA分子也可以用凝胶电泳分离、转移到硝酸纤 维素膜上后也可以用杂交的方法鉴定。这种方法叫Northern blotting。Western blotting是用 特异抗体检测特定蛋白质的技术。Southern,Northern,和Western blots也称为DNA,RNA, 和Protein blots
图 5.2 限制性核酸内切酶酶切 SV40 DNA 分子的凝胶电泳图谱。每孔相应于一种核酸内切 酶。DNA 片段用溴化乙锭染色显示出荧光。 用标记的核酸探针杂交凝胶分离的限制型内切酶酶切条带，能够鉴定序列与探针互补的 DNA 片段（图 5.3）。限制性酶切产物用琼脂糖凝胶分离后，变性转化成单链 DNA，转移到 硝酸纤维素膜上。DNA 片段在硝酸纤维素膜的位置与原来琼脂糖凝胶的位置相同。然后将 硝酸纤维素膜置于 32P-标记的 DNA 探针溶液杂交，探针能够结合与探针序列互补的 DNA 片段，放射性自显影能够显示这条 DNA 片段所在的位置。这种方式能够从成千上万 种 DNA 片段中找出某一特定 DNA 片段（就像大海捞针）。这个技术是 Edwin Southern 设计 的，因此成这种检测技术是 Southern blotting(印迹)。 图 5.3 Southern Blotting. 先用电泳将 DNA 片段混合物分离，转移到硝酸纤维膜上，与 32P- 标记的 DNA 探针（序列与目标 DNA 序列互补）杂交。然后用放射性自显影观测目标 DNA 条带。 也可以用类似的技术鉴定 RNA 分子。RNA 分子也可以用凝胶电泳分离、转移到硝酸纤 维素膜上后也可以用杂交的方法鉴定。这种方法叫 Northern blotting。Western blotting 是用 特异抗体检测特定蛋白质的技术。Southern, Northern, 和 Western blots 也称为 DNA, RNA， 和 Protein blots. 限制片段长度多态性（RFLP） Southern blotting 能用来跟踪特定基因的遗传情况。如果限制性酶切位点发生变异，限 制性内切酶酶切 DNA 片段的长度就会发生改变，导致 Southern blot 分析显示的 DNA 条带 位置发生改变。人群存在的遗传差异性叫多态性。这种突变可能本身就是致病变异，也有 可能与致病变异紧密连锁。遗传疾病如镰刀性贫血症、囊性纤维病变、Huntington chorea 可以用 RFLP 分析鉴定
选择性终止复制能测定DNA序列 DNA序列测定技术也极大地促进了DNA结构和功能的研究。DNA序列测定的关键是 产生一组DNA片段，其长度取决于DNA序列最后一个核苷酸。Frederick Sanger及其同事 建立了Sanger双脱氧方法（即选择性终止复制）测定DNA序列的技术。与其他技术相比， Sanger双脱氧法简便，能够同时进行四种终止反应。在这些混合物中，DNA聚合酶用来制 造DNA单链模板的互补DNA序列。合成引物是化学合成的DNA片段，与模板分子的序列 已知区互补。除了四种脱氧核苷三磷酸（同位素标记）外，每个反应混合物都含有少量的一 种2,3双脱氧核苷三磷酸类似物，各个混合物所含的类似物不同。 DNA to be sequenced 3'—GAATTCGCTAATGG- 5'—CTTAA Primer DNA polymerase I Labeled dATP TTP dCTP,dGTP Dideoxy analog of dATP 3-GAATTCGCTAATGC 5-CTTAAGCGATTA + 3-GAATTCGCTAATGG 5'—CTTAAGCGA New DNA strands are separated and subjected to electrophoresis Figure 5-4 2',3'-Dideoxy analog 图5.4链终止法测定DNA序列的策略。一种2'3'-双脱氧核苷三磷酸加入DNA聚合酶促反 应混合物产生一组DNA片段，其3末端就是这种2'3-双脱氧核苷三磷酸。例如ddATP(红 色)产生的DNA片段，其末端都是ddA。由于缺乏3'OH,这种链不能继续延伸。 由于核苷类似物3'末端缺乏OH,这种类似物的参入能够阻止生长链进一步延长。双脱 氧类似物浓度要足够低，使生长链偶尔参入一个双脱氧核苷酸导致DNA合成终止。DNA 聚合酶有时参入正常的核苷酸，有时参入双脱氧核苷酸导致反应终止。例如，反应混合物含 有ddATP产生的合成DNA链长度不同，但是3'-端都是ddA(图5.4)。ddA参与的位点就是 待测核酸链的T。因此根据合成核酸链长度就能确定待测核酸链T的位置。一套（四种终止 混合物)双脱氧终止反应后，上样到凝胶的四个孔中电泳分离，从放射性自显影图谱能读出 待测核酸序列。 荧光检测的灵敏度很高，能够替代放射性同位素。每个双脱氧核苷酸连接一个荧光标签， 这样每种链终止反应就带有一种特异的荧光标签（例如蓝色荧光表示ddA,红色荧光表示 dC)。此时能够将四种终止反应混合物混在一起，进行聚合酶链终止反应。产物在一个上样 孔中进行凝胶电泳分离。条带泳动的先后次序表示DNA链的长度，条带的荧光颜色表示 DNA链的终止核苷酸，由此测定DNA链的核酸序列（图5.5)。这种方式能够测定长度达 到550核苷酸的DNA序列。荧光检测更好，这种方法不用放射性同位素，易于自动化检测。 实际上，现代DNA测序仪器采用这种方法每天能够测定的DNA序列超过1O0万碱基
选择性终止复制能测定 DNA 序列 DNA 序列测定技术也极大地促进了 DNA 结构和功能的研究。DNA 序列测定的关键是 产生一组 DNA 片段，其长度取决于 DNA 序列最后一个核苷酸。Frederick Sanger 及其同事 建立了 Sanger 双脱氧方法（即选择性终止复制）测定 DNA 序列的技术。与其他技术相比， Sanger 双脱氧法简便，能够同时进行四种终止反应。在这些混合物中，DNA 聚合酶用来制 造 DNA 单链模板的互补 DNA 序列。合成引物是化学合成的 DNA 片段，与模板分子的序列 已知区互补。除了四种脱氧核苷三磷酸（同位素标记）外，每个反应混合物都含有少量的一 种 2', 3'-双脱氧核苷三磷酸类似物，各个混合物所含的类似物不同。 图 5.4 链终止法测定 DNA 序列的策略。一种 2'3'-双脱氧核苷三磷酸加入 DNA 聚合酶促反 应混合物产生一组 DNA 片段，其 3'-末端就是这种 2'3'-双脱氧核苷三磷酸。例如 ddATP(红 色）产生的 DNA 片段，其末端都是 ddA。由于缺乏 3'-OH，这种链不能继续延伸。 由于核苷类似物 3'-末端缺乏 OH，这种类似物的参入能够阻止生长链进一步延长。双脱 氧类似物浓度要足够低，使生长链偶尔参入一个双脱氧核苷酸导致 DNA 合成终止。DNA 聚合酶有时参入正常的核苷酸，有时参入双脱氧核苷酸导致反应终止。例如，反应混合物含 有 ddATP 产生的合成 DNA 链长度不同，但是 3'-端都是 ddA(图 5.4）。ddA 参与的位点就是 待测核酸链的 T。因此根据合成核酸链长度就能确定待测核酸链 T 的位置。一套（四种终止 混合物）双脱氧终止反应后，上样到凝胶的四个孔中电泳分离，从放射性自显影图谱能读出 待测核酸序列。 荧光检测的灵敏度很高，能够替代放射性同位素。每个双脱氧核苷酸连接一个荧光标签， 这样每种链终止反应就带有一种特异的荧光标签（例如蓝色荧光表示 ddA, 红色荧光表示 ddC)。此时能够将四种终止反应混合物混在一起，进行聚合酶链终止反应。产物在一个上样 孔中进行凝胶电泳分离。条带泳动的先后次序表示 DNA 链的长度，条带的荧光颜色表示 DNA 链的终止核苷酸，由此测定 DNA 链的核酸序列（图 5.5）。这种方式能够测定长度达 到 550 核苷酸的 DNA 序列。荧光检测更好，这种方法不用放射性同位素，易于自动化检测。 实际上，现代 DNA 测序仪器采用这种方法每天能够测定的 DNA 序列超过 100 万碱基
ATOGTGTCACCTAOAT AGCTTGGCG TAATCATGGTCATAGCT 00 110 120 困5.5荧光检测双脱氧法产生的寡核酸片段。四个链终止双脱氧核苷酸用不同颜色的荧光 标签标记（如红色标记T)。色谱图中一种颜色表示一种核苷酸。 固相自动法能合成DNA探针 如同多肽，依次添加活化单体至不溶性载体交联的生长链能够合成DNA链。活化单体 是质子化的脱氧核苷3-亚磷酰胺。第1步，加入的脱氧核苷3'-亚磷酰胺的3”磷原子与生长 链的5-0原子连接，形成亚磷酸三酯（图5.6)。加入的脱氧核苷3-亚磷酰胺5'OH被二甲 氧三苯甲基(DMT)保护，不参与这个连接反应。3”磷酰基与B-氛乙基(B-CE)结合，没有 反应活性。类似地，嘌呤和嘧啶碱基环上的氨基也需要保护。 Dimethoxytrityl DMT]group base(protected) CH B-Cyanoethyl Hz (BCE)group 一C CH NC一2 Aaoreneminu ” 在无水条件下进行缩合反应（因为水能够与亚磷酰胺发生反应）。第二步，用碘氧化亚 磷酸三酯，生成磷酸三酯(（五价磷)。第三步，二氯乙酸脱去生长链5OH的保护基团DMT, 但不影响其它保护基团。现在DNA合成已经完成一个核苷酸延长，可以进行下一轮操作。 每延长一个核苷酸耗时10分钟，延伸效率超过99%。 basen-1 basen basen-1 Activated monomer Growing chain hosphite triester intermediate by lz basen-1 ③ Deprotection cetic acid Elongated chain Phosphotriester intermediate 总 图5.6亚磷酸三酯法固相合成DNA链。加成到生长链的活化单体是脱氧核苷3'-亚磷酰胺， 其5-OH用DMT保护，3'磷氧原子用B-CE保护，还有一个保护基团保护碱基环上的胺基
图 5.5 荧光检测双脱氧法产生的寡核酸片段。四个链终止双脱氧核苷酸用不同颜色的荧光 标签标记（如红色标记 T）。色谱图中一种颜色表示一种核苷酸。 固相自动法能合成 DNA 探针 如同多肽，依次添加活化单体至不溶性载体交联的生长链能够合成 DNA 链。活化单体 是质子化的脱氧核苷 3'-亚磷酰胺。第 1 步，加入的脱氧核苷 3'-亚磷酰胺的 3'-磷原子与生长 链的 5'-O 原子连接，形成亚磷酸三酯（图 5.6）。加入的脱氧核苷 3'-亚磷酰胺 5'-OH 被二甲 氧三苯甲基（DMT）保护，不参与这个连接反应。3'-磷酰基与氰乙基（CE)结合，没有 反应活性。类似地，嘌呤和嘧啶碱基环上的氨基也需要保护。 在无水条件下进行缩合反应（因为水能够与亚磷酰胺发生反应）。第二步，用碘氧化亚 磷酸三酯，生成磷酸三酯（五价磷）。第三步，二氯乙酸脱去生长链 5'-OH 的保护基团 DMT， 但不影响其它保护基团。现在 DNA 合成已经完成一个核苷酸延长，可以进行下一轮操作。 每延长一个核苷酸耗时 10 分钟，延伸效率超过 99%。 图 5.6 亚磷酸三酯法固相合成 DNA 链。加成到生长链的活化单体是脱氧核苷 3'-亚磷酰胺， 其 5'-OH 用 DMT 保护，3'-磷氧原子用CE 保护，还有一个保护基团保护碱基环上的胺基
由于所需产物连接在不溶性支持物上，只是在延伸结束后才从支持物释放出来，因此固 相方法是化学合成DNA、多肽的理想途径。所有反应都在一个反应器中进行，可以加入过 量试剂驱使化学反应彻底进行。每步反应之后，可以洗去溶剂和副产物。反应结束后，用氨 水处理能够释放合成的寡核苷酸，并除去所有的保护基团。由于延伸反应不能超过100%， 合成链的长度不一致。最长的寡核苷酸分子就是我们需要的合成产物。合成产物可以用 HPLC或聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化。用固相方法曾经合成了长度达到100核苷酸的DNA链。 能够迅速合成各种序列的DNA链使我们能够开展很多研究。例如合成寡核苷酸的末端 用P或荧光基团标记可以用来搜寻很长DNA分子或含有很多染色体的基因组中某段互补 的DNA序列，用标记寡核苷酸作为探针使用很有效，也很普及。例如，能够与人色体上某 段序列互补的DNA探针可以用来探讨染色体上相邻DNA。用该探针作为引物进行PCR扩 增能获得相邻的DNA片段。DNA化学合成技术能够制造新基因。已经有很多实例利用合 成基因表达生产具有新特性的蛋白质。 聚合酶链式反应(PCR)能选择性扩增DNA序列 I984年Kary Mullis设计了聚合酶链式反应(PCR)扩增特意的DNA序列。DNA分子 是连续的DNA双链。我们所要扩增的DNA序列（即目标序列）两侧有非目标DNA序列。 如果目标序列两侧的DNA序列已知就能用PCR扩增制造大量的目标序列。在含有目标序 列的溶液中加入：(1)能够与两侧序列杂交的一对引物，(2)四种脱氧核苷三磷酸，和(3) 热稳定的DNA聚合酶。一轮PCR反应含有三个步骤（图5.7）。 1.链分离。将DNA溶液在95℃加热15S,亲本DNA分子双链分开，成为单链DNA。 2.引物杂交。将DNA溶液迅速冷却至54℃，使引物与DNA链杂交。一种引物与其中一 条DNA链目标序列的3'-端结合，另一种引物与另一条DNA链的3'-末端结合。由于引 物量比亲本DNA多很多，因此不会形成亲本DNA双链。 3.DNA合成。溶液加热至Taq DNA聚合酶最适温度，即72℃。Taq DNA polymerase是从 温泉生长微生物thumus aquaticus分离的。两条引物发生延伸（方向是5'-3")。两条引 物的延伸会超出目标序列。 Flanking sequence Target sequence Add excess primers Heat to separate strands 图5.7第一轮PCR扩增反应。一轮PCR反应含有三个步骤：链分离，引物杂交，和引物延 伸(DNA合成)。 这三个步骤一链分离、引物杂交、和链延伸一构成一轮PC℉扩增。改变混合物的温度 恩能够重复上述操作。DNA聚合酶的热稳定性是PCR反应在一支密闭试管内执行PCR操 作，每轮反应后不必添加试剂。第一轮扩增反应完成后，加热启动第二轮扩增，产生4个双 链。接着启动第三轮扩增（图5.8）。第三轮扩增的产物有两个短链（只含有目标序列和两侧
由于所需产物连接在不溶性支持物上，只是在延伸结束后才从支持物释放出来，因此固 相方法是化学合成 DNA、多肽的理想途径。所有反应都在一个反应器中进行，可以加入过 量试剂驱使化学反应彻底进行。每步反应之后，可以洗去溶剂和副产物。反应结束后，用氨 水处理能够释放合成的寡核苷酸，并除去所有的保护基团。由于延伸反应不能超过 100%， 合成链的长度不一致。最长的寡核苷酸分子就是我们需要的合成产物。合成产物可以用 HPLC 或聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化。用固相方法曾经合成了长度达到 100 核苷酸的 DNA 链。 能够迅速合成各种序列的 DNA 链使我们能够开展很多研究。例如合成寡核苷酸的末端 用 32P 或荧光基团标记可以用来搜寻很长 DNA 分子或含有很多染色体的基因组中某段互补 的 DNA 序列，用标记寡核苷酸作为探针使用很有效，也很普及。例如，能够与人色体上某 段序列互补的 DNA 探针可以用来探讨染色体上相邻 DNA。用该探针作为引物进行 PCR 扩 增能获得相邻的 DNA 片段。DNA 化学合成技术能够制造新基因。已经有很多实例利用合 成基因表达生产具有新特性的蛋白质。 聚合酶链式反应（PCR）能选择性扩增 DNA 序列 1984 年 Kary Mullis 设计了聚合酶链式反应（PCR）扩增特意的 DNA 序列。DNA 分子 是连续的 DNA 双链。我们所要扩增的 DNA 序列（即目标序列）两侧有非目标 DNA 序列。 如果目标序列两侧的 DNA 序列已知就能用 PCR 扩增制造大量的目标序列。在含有目标序 列的溶液中加入：（1）能够与两侧序列杂交的一对引物，（2）四种脱氧核苷三磷酸，和（3） 热稳定的 DNA 聚合酶。一轮 PCR 反应含有三个步骤（图 5.7）。 1. 链分离。将 DNA 溶液在 95℃加热 15s，亲本 DNA 分子双链分开，成为单链 DNA。 2. 引物杂交。将 DNA 溶液迅速冷却至 54℃，使引物与 DNA 链杂交。一种引物与其中一 条 DNA 链目标序列的 3'-端结合，另一种引物与另一条 DNA 链的 3'-末端结合。由于引 物量比亲本 DNA 多很多，因此不会形成亲本 DNA 双链。 3. DNA 合成。溶液加热至 Taq DNA 聚合酶最适温度，即 72℃。Taq DNA polymerase 是从 温泉生长微生物 thumus aquaticus 分离的。两条引物发生延伸（方向是 5' - 3')。两条引 物的延伸会超出目标序列。 图 5.7 第一轮 PCR 扩增反应。一轮 PCR 反应含有三个步骤：链分离，引物杂交，和引物延 伸（DNA 合成）。 这三个步骤—链分离、引物杂交、和链延伸—构成一轮 PCR 扩增。改变混合物的温度 恩能够重复上述操作。DNA 聚合酶的热稳定性是 PCR 反应在一支密闭试管内执行 PCR 操 作，每轮反应后不必添加试剂。第一轮扩增反应完成后，加热启动第二轮扩增，产生 4 个双 链。接着启动第三轮扩增（图 5.8）。第三轮扩增的产物有两个短链（只含有目标序列和两侧
的引物序列)。后续扩增是目标序列的对数扩增，而更长些的DNA链只能算术扩增，并充 当一些短链（由目标序列和两侧引物序列构成）合成的模板。理想状态下，经过轮PCR 扩增后目标序列的产物是2”倍。经过20轮扩增，目标序列达到数百万倍数量级，30轮能够 达到数十亿数量级。这些扩增可以在1小时内完成。 FIRST CYCLE BEGINS Flanking sequence larget sequence SECOND CCLE RD CYCLE BEGIN Add excess primers Heat to separate Cool Primers UBSEQUENT CYCLES Add heat-stable DNA polymerase Synthesize new DNA rand 兰 。 图5.8多轮PCR反应。第三轮扩增的产物是两分子的短DNA双链（相伴产生的两分子的 长DNA双链没有画出)。短DNA双链就是目标序列。后续的PCR反应能对数扩增目标序 列，而亲本DNA序列只能算术扩增。 这种扩增有几个显著特征值得注意。第一，不必知道目标序列，只需要目标序列两侧的 DNA序列。第二，目标序列比两侧的引物长很多。PCR扩增能够扩增长度超过1Okb的目 标序列。第三，引物与两侧序列并不必要100%配对。用序列已知基因设计的引物，PCR能 够检测基因变异，发现基因家族。第四，提高杂交温度能够提高PCR扩增的严谨性。严谨 性是引物与目标接触（二不是与其它区域接触所需要的）。目标与引物接触受温度、和溶液 盐浓度的影响。温度高，只有两个引物杂交序列之间的DNA才能被扩增。用PCR技术能 够扩增高等生物的某一基因，虽然该基因在总DNA的含量还不到百万分之一。PCR能够扩 增、检测单DNA分子。 PCR是医学诊断、法医和分子进化研究的重要工具 PCR能够提供有价值的医学诊断结果。用特异引物进行PCR能够检测细菌和病毒。例 如，PC能查出没有症状但是已经感染HV的人群（这类人群用抗体免疫检测会漏检）。用 组织培养检测结核杆菌速度慢、劳动量大。用PCR检测，一百万个人细胞中只有10个结核 杆菌就能够检测出来。PC能够坚定一些生长控制基因的（如raS)的基因突变。选择性扩增 特定区域的DNA序列在检测癌症治疗效果方面也有用。如果PC℉检测结果显示癌细胞已 被消除，化疗就可以停止。PCR检测发现停药后癌细胞又出现了，就要恢复用药。PC℉检 测染色体重排导致白血病是非常灵敏准确的。 在法医领域PCR也非常有用。在人群中很多遗传基因是高度可变的，因此这些为，点的 个体DNA谱有个体专一性。例如人白细胞表面抗原(HLA)就是高度可变的，PCR能够确定 个体的HLA类型。若供体和受体的HLA类型不匹配，器官移植后悔产生免疫排斥反应。 多基因PCR扩增还用于亲子鉴定。PCR分析嫌疑人血迹或精液能够找出真正的强奸或杀人 凶犯。犯罪现场留下的一根发根含有足量的DNA进行PCR分型（图5.9）。 DNA分子稳定，尤其是在避光、无水、和隔绝空气的情况下DNA分子就更为稳定。 在这样的条件下，大的DNA分子在几千年的时间内不发生断裂。PCR是扩增古代DNA分 子的理想方法。扩增之后才能进行鉴定和检测。PCR还能扩增那些无法培养微生物的DNA。 下一章将介绍PCR产物的DNA序列能够跟踪不同生物的进化关系
的引物序列）。后续扩增是目标序列的对数扩增，而更长些的 DNA 链只能算术扩增，并充 当一些短链（由目标序列和两侧引物序列构成）合成的模板。理想状态下，经过 n 轮 PCR 扩增后目标序列的产物是 2 n倍。经过 20 轮扩增，目标序列达到数百万倍数量级，30 轮能够 达到数十亿数量级。这些扩增可以在 1 小时内完成。 图 5.8 多轮 PCR 反应。第三轮扩增的产物是两分子的短 DNA 双链（相伴产生的两分子的 长 DNA 双链没有画出）。短 DNA 双链就是目标序列。后续的 PCR 反应能对数扩增目标序 列，而亲本 DNA 序列只能算术扩增。 这种扩增有几个显著特征值得注意。第一，不必知道目标序列，只需要目标序列两侧的 DNA 序列。第二，目标序列比两侧的引物长很多。PCR 扩增能够扩增长度超过 10kb 的目 标序列。第三，引物与两侧序列并不必要 100%配对。用序列已知基因设计的引物，PCR 能 够检测基因变异，发现基因家族。第四，提高杂交温度能够提高 PCR 扩增的严谨性。严谨 性是引物与目标接触（二不是与其它区域接触所需要的）。目标与引物接触受温度、和溶液 盐浓度的影响。温度高，只有两个引物杂交序列之间的 DNA 才能被扩增。用 PCR 技术能 够扩增高等生物的某一基因，虽然该基因在总 DNA 的含量还不到百万分之一。PCR 能够扩 增、检测单 DNA 分子。 PCR 是医学诊断、法医和分子进化研究的重要工具 PCR 能够提供有价值的医学诊断结果。用特异引物进行 PCR 能够检测细菌和病毒。例 如，PCR 能查出没有症状但是已经感染 HIV 的人群（这类人群用抗体免疫检测会漏检）。用 组织培养检测结核杆菌速度慢、劳动量大。用 PCR 检测，一百万个人细胞中只有 10 个结核 杆菌就能够检测出来。PCR 能够坚定一些生长控制基因的（如 ras)的基因突变。选择性扩增 特定区域的 DNA 序列在检测癌症治疗效果方面也有用。如果 PCR 检测结果显示癌细胞已 被消除，化疗就可以停止。PCR 检测发现停药后癌细胞又出现了，就要恢复用药。PCR 检 测染色体重排导致白血病是非常灵敏准确的。 在法医领域 PCR 也非常有用。在人群中很多遗传基因是高度可变的，因此这些为点的 个体 DNA 谱有个体专一性。例如人白细胞表面抗原(HLA)就是高度可变的，PCR 能够确定 个体的 HLA 类型。若供体和受体的 HLA 类型不匹配，器官移植后悔产生免疫排斥反应。 多基因 PCR 扩增还用于亲子鉴定。PCR 分析嫌疑人血迹或精液能够找出真正的强奸或杀人 凶犯。犯罪现场留下的一根发根含有足量的 DNA 进行 PCR 分型（图 5.9）。 DNA 分子稳定，尤其是在避光、无水、和隔绝空气的情况下 DNA 分子就更为稳定。 在这样的条件下，大的 DNA 分子在几千年的时间内不发生断裂。PCR 是扩增古代 DNA 分 子的理想方法。扩增之后才能进行鉴定和检测。PCR 还能扩增那些无法培养微生物的 DNA。 下一章将介绍 PCR 产物的 DNA 序列能够跟踪不同生物的进化关系
4μg8μg λ1 kb TS D jeans-shirt. V入1kb Figure5 ry.Sixth Edition 2007 W.H.Freeman and Company 图5.9DNA与法医。从嫌疑人裤衩和衬衫的血迹分离的DNA用PCR扩增，与嫌疑人和受 害人的DNA样品进行比较，凝胶电泳后放射性自显影。嫌疑人衣服上的血迹DNA与受害 人一致，但与嫌疑人不同。DNA类型偶尔相同的概率大约330亿分之一，因此用这种技术 鉴定的结果非常准确。上样孔分别是：入，Ikb,TS(对照DNA),D(嫌疑人DNA),jeans和 shit(来自嫌疑人衣物的血迹)，V(受害者DNA). 5.2重组DNA技术使生物学各个领域发生了革命性变化 在l970年代Paul Berg,Herbert Boyer,.和Stanley Cohen的开创性工作建立了重组DNA 技术，使生物学从纯粹的分析科学发展成合成科学。采用重组DNA技术，再实验室能够将 无关基因组合起来。新的基因组合能够克隆、扩增、并能被引入适当细胞（在这种细胞内， 宿主DNA合成机器能合成引入的组合基因)。宿主细胞能够转录外源基因，并翻译合成外 源基因所编码的蛋白质产物。最显著的特征是这种技术能永久性改变宿主的遗传特征。 限制性内切酶和DNA连接酶是形成重组DNA分子的关镀工具 现在我们介绍实验室如何构建新DNA分子。目标DNA片断必须与DNA载体共价交联。 载体的必需特性是它能够在适当宿主中能自主复制。质粒是细胞体内存在的染色体外的遗传 物质，是环状双链DNA。入啦菌体是大肠杆菌的病毒。质粒和啦菌体是大肠杆菌的基因克隆 载体(vector)。载体可以用限制性内切酶酶切，酶切后可以接受一个新DNA分子。例如， 质粒pSC101是一个9.9-kb的双链环状DNA分子，有一个单一切点EcoRI。用EcoR酶切 后，产生粘性末端。任何DNA片段，只要两端的粘性序列与EcoRI酶切产生的粘性末端相 同（用相同的限制性内切酶断裂大DNA分子能够获得）就能与载体结合（图5.10）。 DNA片段末端的单链区与质粒酶切后产生末端的单链区互补，退火配对后用DNA连 接酶连接。DNA连接酶需要3'-OH和5'磷酸，将缺口连接成磷酸二酯键。DNA连接酶要求 DNA分子是双链，连接反应需要ATP或NAD提供能量
图 5.9 DNA 与法医。从嫌疑人裤衩和衬衫的血迹分离的 DNA 用 PCR 扩增，与嫌疑人和受 害人的 DNA 样品进行比较，凝胶电泳后放射性自显影。嫌疑人衣服上的血迹 DNA 与受害 人一致，但与嫌疑人不同。DNA 类型偶尔相同的概率大约 330 亿分之一，因此用这种技术 鉴定的结果非常准确。上样孔分别是：，1kb，TS（对照 DNA), D（嫌疑人 DNA), jeans 和 shirt（来自嫌疑人衣物的血迹），V（受害者 DNA). 5.2 重组 DNA 技术使生物学各个领域发生了革命性变化 在 1970 年代 Paul Berg, Herbert Boyer, 和 Stanley Cohen 的开创性工作建立了重组 DNA 技术，使生物学从纯粹的分析科学发展成合成科学。采用重组 DNA 技术，再实验室能够将 无关基因组合起来。新的基因组合能够克隆、扩增、并能被引入适当细胞（在这种细胞内， 宿主 DNA 合成机器能合成引入的组合基因）。宿主细胞能够转录外源基因，并翻译合成外 源基因所编码的蛋白质产物。最显著的特征是这种技术能永久性改变宿主的遗传特征。 限制性内切酶和 DNA 连接酶是形成重组 DNA 分子的关键工具 现在我们介绍实验室如何构建新 DNA 分子。目标 DNA 片断必须与 DNA 载体共价交联。 载体的必需特性是它能够在适当宿主中能自主复制。质粒是细胞体内存在的染色体外的遗传 物质，是环状双链 DNA。噬菌体是大肠杆菌的病毒。质粒和噬菌体是大肠杆菌的基因克隆 载体（vector）。载体可以用限制性内切酶酶切，酶切后可以接受一个新 DNA 分子。例如， 质粒 pSC101 是一个 9.9-kb 的双链环状 DNA 分子，有一个单一切点 EcoRI。用 EcoRI 酶切 后，产生粘性末端。任何 DNA 片段，只要两端的粘性序列与 EcoRI 酶切产生的粘性末端相 同（用相同的限制性内切酶断裂大 DNA 分子能够获得）就能与载体结合（图 5.10）。 DNA 片段末端的单链区与质粒酶切后产生末端的单链区互补，退火配对后用 DNA 连 接酶连接。DNA 连接酶需要 3'-OH 和 5'-磷酸，将缺口连接成磷酸二酯键。DNA 连接酶要求 DNA 分子是双链，连接反应需要 ATP 或 NAD+提供能量
GAATTC GAATTC CTTAAG CTTAAG Cleave with EcoRl restriction enzyme AATTC G AATTC CTTAA CTTAA Anneal DNA fragments and rejoin with DNA ligase GAATTC GAATTC CTTAAG CTTAAG 图5.10粘性末端将DNA分子结合。两个DNA分子用同一限制性内切酶酶切，产生的DNA 片段用DNA连接酶连接生成重组DNA分子。 可以用化学合成的DNA接头(linker)制造这种粘性末端。首先将这种化学合成的接 头与平端的DNA片段连接。例如十聚核苷酸的接头用多核苷酸激酶将5'-末端磷酸化，然后 用T4-DNA连接酶连接（图5.II)。这种连接酶能够将平端DNA分子共价连接。接头部分 有限制性切，点，用限制性内切酶酶切产生粘性末端。因此任何DNA分子都可以用这种方法 制造粘性末端。将化学合成和酶学方法结合制造新DNA分子。 5'⊙ H3 3′H0- -®5' DNA fragment or vector T4 ligase 5'⊙-CGGAATTCGG-OH3' 3'Ho-GGCTTAAGCC-⊙5' Decameric linker 5'⊙-CGGAATTCGG CGGAATTCGG-OH 3' 3'HO-GGCTTAAGCC GGCTTAAGCC-(P)5' EcoRl restriction enzyme 5P-AATTCGG CGG-OH HO-GCC GGCTTAA-P5 图5.11粘性末端的形成。添加化学合成的接头，然后用限制性内切酶酶切，形成粘性末端。 质粒和入噬菌体是在大肠杆菌进行DNA克隆的选择性载体 基因工程用的很多质粒和噬菌体已经被修改，目的是促进重组DNA分子进入细菌或易 于选择携带这种载体的细菌。质粒是一些细菌中天然存在的染色体外遗传物质，使双链环状 DNA分子，长度在2kb到几百kb之间。质粒携带的基因能失活抗生素、制造毒素、分解天 然产物。质粒能独立于细菌染色体的方式进行复制。与宿主基因组不同，在一定条件下，质 粒是细菌不可或缺的。每个细菌可以完全没有质粒，也可以有20拷贝的质粒。 pBR322质粒.第一个用于基因克隆的质粒是pBR322。这个质粒有两个抗生素基因，分 别是四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因。不同限制性内切酶能够在该质粒的不同位点发 生酶切。这些限制性酶切位点可以插入外源DNA片段。在EcoRI位，点插入外源DNA片段 不影响质粒的两种抗生素抗性基因。在SaⅢ或BamHⅢ位，点插入外源DNA导致四环素抗性 基因失活（图5.12）。DNA片段插入导致基因失活得现象叫插入失活。细胞携带的在SalⅢ 或BamHⅢ位，点插入外源DNA的pBR322能够耐受氨苄抗生素，但不能耐受四环素，因此可 以利用抗生素来选择重组质粒。没有摄取质粒的大肠杆菌对四环素、氨苄青霉素都敏感
图 5.10 粘性末端将 DNA 分子结合。两个 DNA 分子用同一限制性内切酶酶切，产生的 DNA 片段用 DNA 连接酶连接生成重组 DNA 分子。 可以用化学合成的 DNA 接头（linker）制造这种粘性末端。首先将这种化学合成的接 头与平端的 DNA 片段连接。例如十聚核苷酸的接头用多核苷酸激酶将 5'-末端磷酸化，然后 用 T4-DNA 连接酶连接（图 5.11）。这种连接酶能够将平端 DNA 分子共价连接。接头部分 有限制性切点，用限制性内切酶酶切产生粘性末端。因此任何 DNA 分子都可以用这种方法 制造粘性末端。将化学合成和酶学方法结合制造新 DNA 分子。 图 5.11 粘性末端的形成。添加化学合成的接头，然后用限制性内切酶酶切，形成粘性末端。 质粒和噬菌体是在大肠杆菌进行 DNA 克隆的选择性载体 基因工程用的很多质粒和噬菌体已经被修改，目的是促进重组 DNA 分子进入细菌或易 于选择携带这种载体的细菌。质粒是一些细菌中天然存在的染色体外遗传物质，使双链环状 DNA 分子，长度在 2kb 到几百 kb 之间。质粒携带的基因能失活抗生素、制造毒素、分解天 然产物。质粒能独立于细菌染色体的方式进行复制。与宿主基因组不同，在一定条件下，质 粒是细菌不可或缺的。每个细菌可以完全没有质粒，也可以有 20 拷贝的质粒。 pBR322 质粒. 第一个用于基因克隆的质粒是 pBR322。这个质粒有两个抗生素基因，分 别是四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因。不同限制性内切酶能够在该质粒的不同位点发 生酶切。这些限制性酶切位点可以插入外源 DNA 片段。在 EcoRI 位点插入外源 DNA 片段 不影响质粒的两种抗生素抗性基因。在 SalI 或 BamHI 位点插入外源 DNA 导致四环素抗性 基因失活（图 5.12）。DNA 片段插入导致基因失活得现象叫插入失活。细胞携带的在 SalI 或 BamHI 位点插入外源 DNA 的 pBR322 能够耐受氨苄抗生素，但不能耐受四环素，因此可 以利用抗生素来选择重组质粒。没有摄取质粒的大肠杆菌对四环素、氨苄青霉素都敏感