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《生物化学 Biochemistry》课程教学资源(课本材料)第10章 调节机制

10.1 天冬氨酸-氨基甲酰转移酶是一种变构调节酶,受该途径终端产物抑制。 10.2 同功酶是进行组织特异性和时间特异性调节的一种方式 10.3 共价修饰时调节酶活性的一种方式 10.4 很多酶的活化需要蛋白质特异性断裂
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第十章调节机制 如同机动车交通,用信号调节代谢途径流动效率更高。CTP是一个多步骤反应的最终产物。 CTP抑制限速步骤催化酶(即天冬氨酸-氨基甲酰转移酶ATCase)活性能够控制这个代谢途 径。 为了在合适的时间和地点发挥作用,必须调节酶的活性。这种调节对于协调生物体内一 直发生的大量生化过程而言是必需的。酶活性的调节方式主要有五种。 1,变构控制。变构蛋白质含有独特的调节位点和多个活性位点。信号小分子与调节位点的 结合是控制这些酶蛋白活性的主要手段。而且,变构蛋白有协同性:一个活性位,点的活 性会影响其它活性位点。因此有变构控制能力的蛋白质也是信息转导分子:能够将信号 分子或同一酶蛋白活性位点的信息传递给蛋白质,调节酶蛋白活性。本章介绍研究最深 入的变构蛋白,即天冬氨酸-氨基甲酰转移酶(ATCase)。该酶催化嘧啶合成途径的第一 步反应,即氨基甲酰转移给天冬氨酸的化学反应。这个酶受该途径终产物CTP的反馈抑 制。在第7章我们已经介绍了一种变构蛋白(即运送氧气的血红蛋白)。 2.酶的多重形式。同功酶(isozyme,isoenzyme)是在不同位置或时间调节酶活性的另一 种形式。同功酶是同一生物体内存在的催化同一反应的同源酶,它们之间在结构上稍有 差异,但是催化反应的Km和Vmax,以及调节特性差异显著。通常同功酶随表达的时 间、地点和发育状态而改变。 3.可逆共价修饰。有很多酶共价连接一个基团后催化活性显著改变,最常见的修饰基团是 磷酸。ATP作为这些修饰反应的磷酸供体,催化的酶是蛋白激酶。蛋白磷酸酯酶负责删 除蛋白质的磷酸基团。本章介绍蛋白激酶的结构、特异性和活性调节。PKA是真核生物 广泛存在的蛋白激酶,能够调节不同的目标蛋白质。 4.蛋白裂解活化。有些调节使酶蛋白活性能够来回变化,使之处于有活性和无活性两种状 态。还有一种调节方式是酶蛋白活性不可逆转地激活。只要水解少数几个肽键甚至一个 肽键就能够酶激活的蛋白质称为酶原(ymogen,.or proenzyme)。这种机制能够产生消化 酶如胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、和胃蛋白酶。血液凝固就是酶原激活的级联反应。特异 抑制蛋白与分子靶标不可逆结合关闭凝血过程。 5.酶量控制。调节酶量也是调节酶活性的一种方法。通常在转录水平进行这种调节。在31 章我们将介绍这种调节模式。 下面,我们首先介绍天冬氨酸-氨基甲酰转移酶,一种变构调节的蛋白质。 10.1天冬氨酸-氨基甲酰转移酶是一种变构调节酶,受该途径终端产物抑制。 天冬氨酸-氨基甲酰转移酶催化嘧啶合成的第一步,天冬氨酸和氨基羧酸磷酸缩合形成 N-氨羰基天冬氨酸和磷酸(图101)。该反应是嘧啶合成途径的限速步骤。如何精确调节这

第十章 调节机制 如同机动车交通,用信号调节代谢途径流动效率更高。CTP 是一个多步骤反应的最终产物。 CTP 抑制限速步骤催化酶(即天冬氨酸-氨基甲酰转移酶 ATCase)活性能够控制这个代谢途 径。 为了在合适的时间和地点发挥作用,必须调节酶的活性。这种调节对于协调生物体内一 直发生的大量生化过程而言是必需的。酶活性的调节方式主要有五种。 1. 变构控制。变构蛋白质含有独特的调节位点和多个活性位点。信号小分子与调节位点的 结合是控制这些酶蛋白活性的主要手段。而且,变构蛋白有协同性:一个活性位点的活 性会影响其它活性位点。因此有变构控制能力的蛋白质也是信息转导分子:能够将信号 分子或同一酶蛋白活性位点的信息传递给蛋白质,调节酶蛋白活性。本章介绍研究最深 入的变构蛋白,即天冬氨酸-氨基甲酰转移酶(ATCase)。该酶催化嘧啶合成途径的第一 步反应,即氨基甲酰转移给天冬氨酸的化学反应。这个酶受该途径终产物 CTP 的反馈抑 制。在第 7 章我们已经介绍了一种变构蛋白(即运送氧气的血红蛋白)。 2. 酶的多重形式。同功酶(isozyme,isoenzyme)是在不同位置或时间调节酶活性的另一 种形式。同功酶是同一生物体内存在的催化同一反应的同源酶,它们之间在结构上稍有 差异,但是催化反应的 Km 和 Vmax,以及调节特性差异显著。通常同功酶随表达的时 间、地点和发育状态而改变。 3. 可逆共价修饰。有很多酶共价连接一个基团后催化活性显著改变,最常见的修饰基团是 磷酸。ATP 作为这些修饰反应的磷酸供体,催化的酶是蛋白激酶。蛋白磷酸酯酶负责删 除蛋白质的磷酸基团。本章介绍蛋白激酶的结构、特异性和活性调节。PKA 是真核生物 广泛存在的蛋白激酶,能够调节不同的目标蛋白质。 4. 蛋白裂解活化。有些调节使酶蛋白活性能够来回变化,使之处于有活性和无活性两种状 态。还有一种调节方式是酶蛋白活性不可逆转地激活。只要水解少数几个肽键甚至一个 肽键就能够酶激活的蛋白质称为酶原(zymogen, or proenzyme)。这种机制能够产生消化 酶如胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、和胃蛋白酶。血液凝固就是酶原激活的级联反应。特异 抑制蛋白与分子靶标不可逆结合关闭凝血过程。 5. 酶量控制。调节酶量也是调节酶活性的一种方法。通常在转录水平进行这种调节。在 31 章我们将介绍这种调节模式。 下面,我们首先介绍天冬氨酸-氨基甲酰转移酶,一种变构调节的蛋白质。 10.1 天冬氨酸-氨基甲酰转移酶是一种变构调节酶,受该途径终端产物抑制。 天冬氨酸-氨基甲酰转移酶催化嘧啶合成的第一步,天冬氨酸和氨基羧酸磷酸缩合形成 N-氨羰基天冬氨酸和磷酸(图 10.1)。该反应是嘧啶合成途径的限速步骤。如何精确调节这

个酶,使之合成细胞所需量的CTP? NH- NH2 +P oP032 C00 Carbamoyl Aspartate N-Carbamoylaspartate phosphate NH- HO OH Cytidine triphosphate(CTP) 图10.1 ATCase酶促反应。天冬氨酸-氨基甲酰转移酶催化嘧啶合成途经的限速反应,天冬 氨酸与胺酰基磷酸的缩合生成N-氨甲酰天冬氨酸。 John Gerhart和Arthur Pardee发现ATCase受CTP抑制。CTP是嘧啶合成途径的最终产 物。CTP浓度低,ATCase活性高;CTP浓度增加,ATCase活性降低(图l0.2)。因此该途 径使CTP合成处于足量但不会过量的水平。CTP抑制ATCase活性是反馈抑制的例子。如 果CTP含量充足,就没有必要进一步合成N-氨羰基天冬氨酸和后续的中间体。 6 之 0.5 1.0 [CTP],mM n 图10.2CTP抑制ATCase酶促反应。尽管CTP与反应物或产物没有结构类似性,嘧啶合成 途径的终产物CTP能够抑制天冬氨酸-氨基甲酰转移酶活性。 CTP与酶促底物结构差异大是CTP抑制ATCase活性的显著特征(图I0.I)。因此CTP 的结合位点肯定不是活性位点。这种位点叫变构位点或调节位点。CTP是别构抑制剂。在 ATCase蛋白分子中,催化位点和调节位点处于不同的多肽链

个酶,使之合成细胞所需量的 CTP? 图 10.1 ATCase 酶促反应。天冬氨酸-氨基甲酰转移酶催化嘧啶合成途经的限速反应,天冬 氨酸与胺酰基磷酸的缩合生成 N-氨甲酰天冬氨酸。 John Gerhart 和 Arthur Pardee 发现 ATCase 受 CTP 抑制。CTP 是嘧啶合成途径的最终产 物。CTP 浓度低,ATCase 活性高;CTP 浓度增加,ATCase 活性降低(图 10.2)。因此该途 径使 CTP 合成处于足量但不会过量的水平。CTP 抑制 ATCase 活性是反馈抑制的例子。如 果 CTP 含量充足,就没有必要进一步合成 N-氨羰基天冬氨酸和后续的中间体。 图 10.2 CTP 抑制 ATCase 酶促反应。尽管 CTP 与反应物或产物没有结构类似性,嘧啶合成 途径的终产物 CTP 能够抑制天冬氨酸-氨基甲酰转移酶活性。 CTP 与酶促底物结构差异大是 CTP 抑制 ATCase 活性的显著特征(图 10.1)。因此 CTP 的结合位点肯定不是活性位点。这种位点叫变构位点或调节位点。CTP 是别构抑制剂。在 ATCase 蛋白分子中,催化位点和调节位点处于不同的多肽链

变构调节酶不遵循米氏动力学 除了酶受其它分子调节之外,变构酶促反应对底物浓度的应答也很有特征。图103是 ATCase酶促反应速度对底物Asp浓度作图的结果。这个动力学曲线与米氏方程不同,形状 像“S”。很多变构酶促动力学曲线呈S型。血红蛋白的有能够结合曲线也是S型,亚基与 氧气的结合是正协同的,即蛋白分子中一个位点与氧气结合增加这个分子其它位点的氧气结 合性能。为了理解ATCase酶促反应动力学和CTP抑制酶活性的基础,我们需要考察ATCase 结构。 ajey 111 10203040 [Aspartate],mM 图10.3 ATCase酶促反应动力学呈S曲线。天冬氨酸-氨基甲酰转移酶催化反应得产物形成 速度对底物AS即浓度作图呈S型曲线,表明一个活性位,点结合底物能够增加这个酶蛋白分 子其它位点的活性。因此这个酶是正协同酶。 ATCase含有独立的催化亚基和调节亚基 ATCase的催化位点和调节位点是什么?用汞类物质如p-羟基汞苯甲酸(只与巯基反应) 处理,能够将ATCase的催化亚基(c)与调节亚基(r)分开(图l0.4)。John Gerhart和Howard Schachman超离心研究显示,汞处理将ATCase分成两种亚基(图l0.5)。由于这两种亚基的 电荷和大小不同,因此可以用离子交换层析(有电荷差异)或蔗糖密度梯度离心(有大小差 异)分离。用沉降系数表述两种亚基,它们的大小分别是2.8S和5.8S。加入过量的巯基乙 醇,能够除去与分离亚基共价连接的P汞苯甲酸基团。因此可以研究分开亚基的功能。 HN Cysteine SH 0 HO -Hydroxy C00 HOH 图10.4半胱氨酸残基的修怖。对羟基汞苯甲酸与天冬氨酸-氨基甲酰转移酶关键的半胱氨酸 反应

变构调节酶不遵循米氏动力学 除了酶受其它分子调节之外,变构酶促反应对底物浓度的应答也很有特征。图 10.3 是 ATCase 酶促反应速度对底物 Asp 浓度作图的结果。这个动力学曲线与米氏方程不同,形状 像“S”。很多变构酶促动力学曲线呈 S 型。血红蛋白的有能够结合曲线也是 S 型,亚基与 氧气的结合是正协同的,即蛋白分子中一个位点与氧气结合增加这个分子其它位点的氧气结 合性能。为了理解 ATCase 酶促反应动力学和 CTP 抑制酶活性的基础,我们需要考察 ATCase 结构。 图 10.3 ATCase 酶促反应动力学呈 S 曲线。天冬氨酸-氨基甲酰转移酶催化反应得产物形成 速度对底物 Asp 浓度作图呈 S 型曲线,表明一个活性位点结合底物能够增加这个酶蛋白分 子其它位点的活性。因此这个酶是正协同酶。 ATCase 含有独立的催化亚基和调节亚基 ATCase 的催化位点和调节位点是什么?用汞类物质如 p-羟基汞苯甲酸(只与巯基反应) 处理,能够将 ATCase 的催化亚基(c)与调节亚基(r)分开(图 10.4)。John Gerhart 和 Howard Schachman 超离心研究显示,汞处理将 ATCase 分成两种亚基(图 10.5)。由于这两种亚基的 电荷和大小不同,因此可以用离子交换层析(有电荷差异)或蔗糖密度梯度离心(有大小差 异)分离。用沉降系数表述两种亚基,它们的大小分别是 2.8S 和 5.8S。加入过量的巯基乙 醇,能够除去与分离亚基共价连接的 p-汞苯甲酸基团。因此可以研究分开亚基的功能。 图 10.4 半胱氨酸残基的修饰。对羟基汞苯甲酸与天冬氨酸-氨基甲酰转移酶关键的半胱氨酸 反应

(A) (B) C66 Distance migrated 图10.5超离心研究ATCase酶。天然ATCase(A)和经过p-羟基汞苯甲酸处理的ATCase 的沉降速度显示酶蛋白可以分成催化亚基(c)和调节亚基(「)。 较大的亚基称为催化亚基。这个亚基有催化活性,但是不受CTP调节,其催化动力学也 不呈S曲线。较小的亚基能够结合CTP,但是没有催化活性,称为调节亚基。催化亚基有 三条多肽链,称为C3(每条多肽链有34kD)。调节亚基有两条多肽链,称为n(每条多肽链 有l7kD)。将催化亚基和调节亚基混合,两者能迅速结合成与天然ATCase一样的c6t6(即 两个催化亚基和三个调节亚基结合而成的复合物)。 2c3+3r2==c66 重组酶的催化动力学性质和变构调节性质与天然酶完全相同。因此,ATCase有独立的 调节亚基和催化亚基。天然酶分子中催化亚基与调节亚基之间相互作用产生了酶促特性和变 构调节特性。 ATCase四级结构的重大变化导致ATCase有变构相互作用 亚基之间究竟是什么作用能够解释ATCase的特性?大量的思路来自ATCase的三维结构 测定。William Lipscomb实验室首先用x-晶体衍射测定ATCase结构。两个催化三体叠加在 一起,三体之间用调解多肽链联系起来(图10.6)。催化亚基和调节亚基之间有大量接触: 调节亚基(二聚体)的每条r链与催化三体的一条℃链相互作用。一个Zn2+与四个半胱氨酸 残基结合稳定c链与「链的一个结构域接触。汞化合物P羟基汞苯甲酸与半胱氨酸结合力强, 替代Z+导致r-链结构域不稳定,结果催化亚基和调节亚基发生解离。 为了确定活性位点,在N-膦酰乙酰基-L-天冬氨酸(PALA)存在的情况下进行ATCase 结晶。PALA是双底物类似物,类似于催化途径的中间物(图10.7)。PALA是ATCase的强 竞争性抑制剂,与活性位点结合阻止酶促反应。ATCase-PALA复合物结构显示,PALA结合 于催化亚基三聚体两个相邻的c链之间。进一步检测显示,PALA与ATCase结合导致酶蛋 白四级结构发生显著变化。两个催化三聚体亚基之间疏远了12A,旋转了10°。相应地,调 节亚基叶旋转了I5°以适应这些变化(图I0.9)。因此PALA与ATCase结合导致美蛋白分子 膨大。基本上,ATCase有两种四级结构模式。一种是没有与底物或底物类似物结合时处于 优势的结构。另一种是与底物或底物类似物结合时占优势的结构。前者是紧缩型结构(T), 后者是松弛型结构(R)

图 10.5 超离心研究 ATCase 酶。天然 ATCase (A)和经过 p-羟基汞苯甲酸处理的 ATCase 的沉降速度显示酶蛋白可以分成催化亚基( c) 和调节亚基 ( r )。 较大的亚基称为催化亚基。这个亚基有催化活性,但是不受 CTP 调节,其催化动力学也 不呈 S 曲线。较小的亚基能够结合 CTP,但是没有催化活性,称为调节亚基。催化亚基有 三条多肽链,称为 c3 (每条多肽链有 34 kD)。调节亚基有两条多肽链,称为 r2 (每条多肽链 有 17 kD)。将催化亚基和调节亚基混合,两者能迅速结合成与天然 ATCase 一样的 c6r6 (即 两个催化亚基和三个调节亚基结合而成的复合物)。 2 c3 + 3 r2 === c6r6 重组酶的催化动力学性质和变构调节性质与天然酶完全相同。因此,ATCase 有独立的 调节亚基和催化亚基。天然酶分子中催化亚基与调节亚基之间相互作用产生了酶促特性和变 构调节特性。 ATCase 四级结构的重大变化导致 ATCase 有变构相互作用 亚基之间究竟是什么作用能够解释ATCase的特性?大量的思路来自ATCase的三维结构 测定。William Lipscomb 实验室首先用 x-晶体衍射测定 ATCase 结构。两个催化三体叠加在 一起,三体之间用调解多肽链联系起来(图 10.6)。催化亚基和调节亚基之间有大量接触: 调节亚基(二聚体)的每条 r 链与催化三体的一条 c 链相互作用。一个 Zn 2+与四个半胱氨酸 残基结合稳定 c 链与 r 链的一个结构域接触。汞化合物 p-羟基汞苯甲酸与半胱氨酸结合力强, 替代 Zn 2+导致 r-链结构域不稳定,结果催化亚基和调节亚基发生解离。 为了确定活性位点,在 N-膦酰乙酰基-L-天冬氨酸(PALA)存在的情况下进行 ATCase 结晶。PALA 是双底物类似物,类似于催化途径的中间物(图 10.7)。PALA 是 ATCase 的强 竞争性抑制剂,与活性位点结合阻止酶促反应。ATCase-PALA 复合物结构显示,PALA 结合 于催化亚基三聚体两个相邻的 c 链之间。进一步检测显示,PALA 与 ATCase 结合导致酶蛋 白四级结构发生显著变化。两个催化三聚体亚基之间疏远了 12A,旋转了 10 o。相应地,调 节亚基叶旋转了 15 o以适应这些变化(图 10.9)。因此 PALA 与 ATCase 结合导致美蛋白分子 膨大。基本上,ATCase 有两种四级结构模式。一种是没有与底物或底物类似物结合时处于 优势的结构。另一种是与底物或底物类似物结合时占优势的结构。前者是紧缩型结构(T), 后者是松弛型结构(R)

Zinc Regulatory (A) domain dimer Catalytic trimer r chain cchain (B) Catalytic trimer Regulatory dimer Regulator Side View dimer Regulatory dimer Catalytic trimer 的ee10 Sath Edrion 2007 W.H.Freeman and Compary 图10.6 ATCase结构。(A)从顶部观察天冬氨酸-氨基甲酰转移酶的四级结构。中间图仅仅 代表亚基之间的关系。只能看到一个催化三体(黄色)的℃链,另一个催化亚基(三体)被 遮住。一个r链经过Zn+离子与一个c链相互作用。(B)ATCase侧视图。 P032 P032- H2N NH2 Bound substrates Reaction intermediate PO3 N-(Phosphonacetyl)-L-aspartate (PALA) 2007 W.H.Freeman and Company 图10.7PALA,一种双底物类似物。(顶部)天冬氨酸的暗记亲和攻击氨基甲酰磷酸酯的羰 基碳原子,产生的化合物PALA类似ATCase酶促反应得中间物。这个物质是ATCase的强 竞争性抑制剂

图 10.6 ATCase 结构。(A)从顶部观察天冬氨酸-氨基甲酰转移酶的四级结构。中间图仅仅 代表亚基之间的关系。只能看到一个催化三体(黄色)的 c 链,另一个催化亚基(三体)被 遮住。一个 r 链经过 Zn 2+离子与一个 c 链相互作用。(B)ATCase 侧视图。 图 10.7 PALA,一种双底物类似物。(顶部)天冬氨酸的暗记亲和攻击氨基甲酰磷酸酯的羰 基碳原子,产生的化合物 PALA 类似 ATCase 酶促反应得中间物。这个物质是 ATCase 的强 竞争性抑制剂

Catalytic subunit 2 Arg 167 His 134 Gln 231 Thr 55 Arg 229 Ser 80 Thr 53 Lys 84 Figure 10-8 图10.8 ATCase酶的活性位,点。图中标出了与PALA抑制剂结合的一些关键位,点的残基。注 意,活性位点的氨基酸残基主要有一个℃链提供,相邻℃链也提供了一些重要的氨基酸侧链 (用绿色方框标出)。 6A 10 PALA PALA PALA 6A T state R state fge102sahfhaon 2007 W.H.Freeman and Company 图10.9 ATCase酶的T态向R态转化。天冬氨酸-氨基甲酰转移酶有两种结构状态,即活性 低的压紧型(T态)和松弛状态(R型)。ATCase从T态转变成R态结构变化明显。PALA结 合能够稳定蛋白质的R态结构。 结合酶蛋白结构,如何解释ATCase的动力学曲线?如同血红蛋白,酶蛋白分子处于两 种结构(R和T)的平衡状态。没有第五分子存在时,几乎所有的酶蛋白都是T态。T态与 底物的亲和力小,因此催化活性低。偶尔与底物分子结合导致整个酶分子转变成亲和力高的 R态。增加底物浓度产生两种效应。一是使每个酶分子至少结合一个底物分子的几率大大增 加。其次是增加每个酶分子结合底物的平均数值。酶分子上已有一个底物分子结合将使酶分 子其他位点的底物亲和性增加,造成每个酶分子结合底物分子的数量增加(即活性位点被底 物占据的比例提高)。因此酶催化显示亚基之间有协同性,产生与血红蛋白氧结合曲线相似 的S型曲线

图 10.8 ATCase 酶的活性位点。图中标出了与 PALA 抑制剂结合的一些关键位点的残基。注 意,活性位点的氨基酸残基主要有一个 c 链提供,相邻 c 链也提供了一些重要的氨基酸侧链 (用绿色方框标出)。 图 10.9 ATCase 酶的 T 态向 R 态转化。天冬氨酸-氨基甲酰转移酶有两种结构状态,即活性 低的压紧型(T 态)和松弛状态(R 型)。ATCase 从 T 态转变成 R 态结构变化明显。PALA 结 合能够稳定蛋白质的 R 态结构。 结合酶蛋白结构,如何解释 ATCase 的动力学曲线?如同血红蛋白,酶蛋白分子处于两 种结构(R 和 T)的平衡状态。没有第五分子存在时,几乎所有的酶蛋白都是 T 态。T 态与 底物的亲和力小,因此催化活性低。偶尔与底物分子结合导致整个酶分子转变成亲和力高的 R 态。增加底物浓度产生两种效应。一是使每个酶分子至少结合一个底物分子的几率大大增 加。其次是增加每个酶分子结合底物的平均数值。酶分子上已有一个底物分子结合将使酶分 子其他位点的底物亲和性增加,造成每个酶分子结合底物分子的数量增加(即活性位点被底 物占据的比例提高)。因此酶催化显示亚基之间有协同性,产生与血红蛋白氧结合曲线相似 的 S 型曲线

变构酶的这种调节机制称为协同机制,因为酶蛋白分子显示“全部”或“全无”两种状 态。酶蛋白从T转化成R影响所有的活性位点。对酶分子所有催化位点的影响是等同的。 相反,序变模型假定底物分子与酶蛋白结合仅增加相邻位,点活性,而不会导致所有位,点都发 生T向R的转化。尽管协同机制能很好地解释ATCase酶促动力学,但是其他变构酶的动力 学需要将两种机制结合起来解释。 ATCase的S型曲线可以看作是两种米氏酶(一种是T态酶,另一种是R态酶)酶促反应 的叠加。底物浓度的增加有助于酶促反应从T态曲线转化成R态曲线(图I010)。注意这 种S型动力学曲线有另一个结果,当底物浓度达到T向R转化时,增加底物浓度使酶促反 应速度急剧上升。酶分子从活性低转变成活性高的底物浓度区间很窄。如果细微的浓度变化 就需要应答的话,这种酶促行为就非常有用。底物对变构酶的这种效应叫同促效应 (homotropic effects). R-state curve 6 T-state curve [Aspartate]→ 图10.10S型曲线的基础。将变构酶想象成两种米氏酶的混合物,一种酶Km低(相当于 R态结构),一种酶Km高(相当于T态结构)。随着底物浓度的增加,平衡从T向R移动, 导致反应速度虽底物浓度增加急剧增高。 在研究分离的催化三聚体过程中,酶促反应行为是米氏曲线,与推测的ATCase R态的 米氏曲线几乎没有区别(图l0.l0)。因此,tense这个此是合适的。在T态,调节亚基将两 个催化亚基(即两个催化三聚体)紧紧抓在一块导致催化亚基表面的环发生碰撞,千扰蛋白 质调整构型使之适宜于与底物高亲和性结合和催化。 别构调节剂调节TR之间的平衡 现在来看看CTP的抑制机制。前面说过,CTP能够抑制ATCase活性。在CTP存在时 进行ATCase结晶,结构显示,(I)与CTP结合的酶蛋白是T态;(2)调节链与CTP结合 的位点并没有与催化链作用(图10.11)。每个活性位点距离最近的CTP结合位点又50A。 这就出现这样的问题,它不与催化亚基相互作用,如何抑制酶的催化活性?

变构酶的这种调节机制称为协同机制,因为酶蛋白分子显示“全部”或“全无”两种状 态。酶蛋白从 T 转化成 R 影响所有的活性位点。对酶分子所有催化位点的影响是等同的。 相反,序变模型假定底物分子与酶蛋白结合仅增加相邻位点活性,而不会导致所有位点都发 生 T 向 R 的转化。尽管协同机制能很好地解释 ATCase 酶促动力学,但是其他变构酶的动力 学需要将两种机制结合起来解释。 ATCase 的 S 型曲线可以看作是两种米氏酶(一种是 T 态酶,另一种是 R 态酶)酶促反应 的叠加。底物浓度的增加有助于酶促反应从 T 态曲线转化成 R 态曲线(图 10.10)。注意这 种 S 型动力学曲线有另一个结果,当底物浓度达到 T 向 R 转化时,增加底物浓度使酶促反 应速度急剧上升。酶分子从活性低转变成活性高的底物浓度区间很窄。如果细微的浓度变化 就需要应答的话,这种酶促行为就非常有用。底物对变构酶的这种效应叫同促效应 (homotropic effects)。 图 10.10 S 型曲线的基础。将变构酶想象成两种米氏酶的混合物,一种酶 Km 低(相当于 R 态结构),一种酶 Km 高(相当于 T 态结构)。随着底物浓度的增加,平衡从 T 向 R 移动, 导致反应速度虽底物浓度增加急剧增高。 在研究分离的催化三聚体过程中,酶促反应行为是米氏曲线,与推测的 ATCase R 态的 米氏曲线几乎没有区别(图 10.10)。因此,tense 这个此是合适的。在 T 态,调节亚基将两 个催化亚基(即两个催化三聚体)紧紧抓在一块导致催化亚基表面的环发生碰撞,干扰蛋白 质调整构型使之适宜于与底物高亲和性结合和催化。 别构调节剂调节 T-R 之间的平衡 现在来看看 CTP 的抑制机制。前面说过,CTP 能够抑制 ATCase 活性。在 CTP 存在时 进行 ATCase 结晶,结构显示,(1)与 CTP 结合的酶蛋白是 T 态;(2)调节链与 CTP 结合 的位点并没有与催化链作用(图 10.11)。每个活性位点距离最近的 CTP 结合位点又 50A。 这就出现这样的问题,它不与催化亚基相互作用,如何抑制酶的催化活性?

CTP CTP T state T state 图I0.11CTP稳定ATCase酶的T态结构。CTP与ATCase的调节亚基结合稳定酶蛋白的T 态结构。 底物类似物与酶结合导致酶蛋白四级结构变化提示CTP抑制ATCase活性的一种机制 (图10.12).CTP与蛋白质结合导致酶蛋白倾向于T态,减少了活性酶的数量CTP与ATCase 结合使酶蛋白与底物的结合难度增加,相应地转化成R态的难度增加。结果,CTP增加了S 形曲线的起始期(图10.13)。需要更多底物才能获得特定的反应速度。 T state R state (less active) (more active) Favored by CTP binding Favored by substrate binding fge10nhn 2007 W.H.Freeman and Company 图1012R态与T态处于平衡状态。即使没有底物,没有调节因子,天冬氨酸-氨基甲酰转 移酶的结构处于R态和T态之间的平衡状态。此时,T态比R态多200倍。 6 +0.4 mM CTP 1020 [Aspartate],mM 图10.l3CTP对ATCase动力学的彩响。CTP稳定ACTase的T态结构,使之更加难以与 底物结合,转变成R态更难。结果动力学曲线向右移动(红色)

图 10.11 CTP 稳定 ATCase 酶的 T 态结构。CTP 与 ATCase 的调节亚基结合稳定酶蛋白的 T 态结构。 底物类似物与酶结合导致酶蛋白四级结构变化提示 CTP 抑制 ATCase 活性的一种机制 (图10.12)。CTP与蛋白质结合导致酶蛋白倾向于T态,减少了活性酶的数量。CTP与ATCase 结合使酶蛋白与底物的结合难度增加,相应地转化成 R 态的难度增加。结果,CTP 增加了 S 形曲线的起始期(图 10.13)。需要更多底物才能获得特定的反应速度。 图 10.12 R 态与 T 态处于平衡状态。即使没有底物,没有调节因子,天冬氨酸-氨基甲酰转 移酶的结构处于 R 态和 T 态之间的平衡状态。此时,T 态比 R 态多 200 倍。 图 10.13 CTP 对 ATCase 动力学的影响。CTP 稳定 ACTase 的 T 态结构,使之更加难以与 底物结合,转变成 R 态更难。结果动力学曲线向右移动(红色)

有趣的是,ATP也是ATCase的别构效应剂。但是ATP能够增加特定底物浓度时ATCase 酶促反应速率(图10.14)。ATP浓度愈高,S形曲线就越不明显。ATP与CTP竞争性结合 ATCase的调节位,点。结果,ATP浓度高阻止CTP与ATCase结合。非底物分子对变构酶的 影响称为异质效应(heterotropic effects)。 2mM ATP 6 1020 [Aspartate],mM n 图10.14ATP对ATCase动力学的影响。ATP是ATCase的异质活化剂,因为它能够稳定 蛋白质的R态结构,使蛋白质易于与底物结合。结果动力学曲线向左边移动(蓝色)。 ATP浓度增加导致ATCase活性高有两个潜在的生理意义。首先,ATP浓度高表示细胞 内嘌呤的密度高,需要增加ATCase活性促成细胞内嘌吟和嘧啶的平衡。其次,ATP的浓度 高表明细胞内能量充足,能用来合成mRNA和复制DNA,也需要合成更多的嘧啶。 在第7章附录部分,我们介绍了协同模型的定量表达方式。尽管那个表达方式用来描述 结合过程,但是也适于变构酶(因为与底物结合的活性位点比例与酶促反应速度成正比)。 这个模型的关键点是两种结构状态处于平衡。我们用L来表述R态和T态之间的平衡。 R===T L=[TVR] CTP和ATP的效应可以简单地理解为影响L数值。在CTP饱和的情况下,L值从250 增加到1250,因此需要更高的底物浓度才能使ATCase转化成R态。在ATP饱和的情况下, L值降至70(图10.15)。 因此协同模型使我们能够很好地描述各种调节因子存在时ATCase酶促反应的动力学。 1.0 +ATP(L=70) (AAe 0.8 0.6 L=200 0.4 +CTP(L=1250) 0.2 0.0 46810 n 图10.15MWC模型的定量表述。在MWC模型中,活性位,点比例(即活性分数)Y是结 合底物的活性位点部分,与酶促反应速度成正比。是底物浓度与R态酶-底物复合物解离 常数的比值;L是T态酶浓度与R态酶浓度之间的比值。ATP和CTP与ATCase的结合能 够改变L值,因此改变了酶蛋白对底物浓度的应答。要获得这些曲线,前面介绍的MWC 模型的公式中,c=0.1,n=6

有趣的是,ATP 也是 ATCase 的别构效应剂。但是 ATP 能够增加特定底物浓度时 ATCase 酶促反应速率(图 10.14)。ATP 浓度愈高,S 形曲线就越不明显。ATP 与 CTP 竞争性结合 ATCase 的调节位点。结果,ATP 浓度高阻止 CTP 与 ATCase 结合。非底物分子对变构酶的 影响称为异质效应(heterotropic effects)。 图 10.14 ATP 对 ATCase 动力学的影响。ATP 是 ATCase 的异质活化剂,因为它能够稳定 蛋白质的 R 态结构,使蛋白质易于与底物结合。结果动力学曲线向左边移动(蓝色)。 ATP 浓度增加导致 ATCase 活性高有两个潜在的生理意义。首先,ATP 浓度高表示细胞 内嘌呤的密度高,需要增加 ATCase 活性促成细胞内嘌呤和嘧啶的平衡。其次,ATP 的浓度 高表明细胞内能量充足,能用来合成 mRNA 和复制 DNA,也需要合成更多的嘧啶。 在第 7 章附录部分,我们介绍了协同模型的定量表达方式。尽管那个表达方式用来描述 结合过程,但是也适于变构酶(因为与底物结合的活性位点比例与酶促反应速度成正比)。 这个模型的关键点是两种结构状态处于平衡。我们用 L 来表述 R 态和 T 态之间的平衡。 R ===== T L = [T]/[R] CTP 和 ATP 的效应可以简单地理解为影响 L 数值。在 CTP 饱和的情况下,L 值从 250 增加到 1250,因此需要更高的底物浓度才能使 ATCase 转化成 R 态。在 ATP 饱和的情况下, L 值降至 70(图 10.15)。 因此协同模型使我们能够很好地描述各种调节因子存在时 ATCase 酶促反应的动力学。 图 10.15 MWC 模型的定量表述。在 MWC 模型中,活性位点比例(即活性分数)Y 是结 合底物的活性位点部分,与酶促反应速度成正比。是底物浓度与 R 态酶-底物复合物解离 常数的比值;L 是 T 态酶浓度与 R 态酶浓度之间的比值。ATP 和 CTP 与 ATCase 的结合能 够改变 L 值,因此改变了酶蛋白对底物浓度的应答。要获得这些曲线,前面介绍的 MWC 模型的公式中,c = 0.1, n = 6

10.2同功酶是进行组织特异性和时间特异性调节的一种方式 同功酶(isozyme,或isoenzyme)是氨基酸序列不同,但催化同一化学反应的酶。通常这 些酶的动力学常数(如Km值),或者对不同调节信号的应答能力不同。这些酶的编码基因 不同,通常是同一基因发生重复和差异化所致。通常利用生化性质例如电泳迁移率差异区分 同功酶。 同功酶的存在允许代谢调节更为精细,以满足特定组织或特定发展阶段的需要。乳酸脱 氢酶(LDH)催化葡萄糖厌氧代谢和葡萄糖合成的一个反应步骤。人类有两种LDHs,分别 是LDH-H(在心肌表达水平高)和LDH-M(在骨骼肌表达水平高)。这两种LDHs的氨基 酸序列一致性高达75%。每种LDH都是四聚体,是两种亚基的各种组合。H4同功酶只见于 心肌,对底物的亲和力比M4高。高浓度的丙酮酸别构抑制H4,但不抑制M4。其他组合, 如H3M的性质居于两者之间。在第16章,我们将介绍这些同功酶所处的生理环境。 M4同功酶在骨骼肌剧烈运动导致缺氧的厌氧环境中活性最高,而心肌的LDH处于心肌 的有氧环境中活性最高。实际上,从缺氧环境转移至有氧环境,大鼠心脏中这些同功酶的类 型也相应变化(图10.16A)。图11.16B显示成年大鼠中不同组织的LDH情况。 LDH-1 ■品 ■■ ■● Red LDH-2 ■ Heart Kidney blood cell Brain Leukocyte Muscle Liver LDH-3 8 88 H4围 HgM LDH-4 oa ●● ●图 H2M2 LDH-5 HM3 =9 -5 -1 +12 +21 Adult Ma 图10.16乳酸脱氢酶同功酶。(A)大鼠发育过程中心脏LDH表达谱的变化情况。H亚基 用方块表示,M亚基用圆圈表示。负数表示出生前的天数,正数表示出生后的天数。(B) 成年大鼠不同组织的LDH同功酶。 有些同功酶在血液中出现表示相应组织出现损伤,可以用作临床诊断指标。例如血清中 H4(相对于H3M)水平增加表示心肌破裂(Myocardial infraction)或心脏病,损伤了心肌细胞 导致胞内组分释放。 10.3共价修饰时调节酶活性的一种方式 与另一个分子共价连接能够调节酶促活性和其他一些蛋白质活性。在这方面,供体分子 提供蛋白质共价连接的功能基团。大多数修饰是可逆的。最常见的共价修饰是磷酸化和去磷 酸化。乙酰化和去乙酰化是另一种常见的蛋白共价修饰。将DNA包装压缩成染色体的蛋白 质,即组蛋白,在或体内有深度的乙酰化和去乙酰化(313节)。活跃转录基因所结合的组 蛋白,乙酰化程度更高。乙酰基转移酶和去乙酰酶自身的活性受磷酸化-去磷酸化调节。说 明修饰酶的共价修饰可能调节蛋白质共价修饰。 有些情况下共价修饰不可逆。在信号传导过程中蛋白质不可逆地与脂质分子共价连接, 变成面向细胞浆的固定于细胞质膜的蛋白质,如Ras(一种GTPase)和Src(一种蛋白酪氨 酸激酶)。固定在这种地方,蛋白质更能够接受沿信号途径传递的信号,并将信号向下游传 递(第l4章)。有些癌症,其Ras和Src有变异。与小蛋白ubiquitin连接,是销毁该蛋白的

10.2 同功酶是进行组织特异性和时间特异性调节的一种方式 同功酶(isozyme,或 isoenzyme)是氨基酸序列不同,但催化同一化学反应的酶。通常这 些酶的动力学常数(如 Km 值),或者对不同调节信号的应答能力不同。这些酶的编码基因 不同,通常是同一基因发生重复和差异化所致。通常利用生化性质例如电泳迁移率差异区分 同功酶。 同功酶的存在允许代谢调节更为精细,以满足特定组织或特定发展阶段的需要。乳酸脱 氢酶(LDH)催化葡萄糖厌氧代谢和葡萄糖合成的一个反应步骤。人类有两种 LDHs,分别 是 LDH-H(在心肌表达水平高)和 LDH-M(在骨骼肌表达水平高)。这两种 LDHs 的氨基 酸序列一致性高达 75%。每种 LDH 都是四聚体,是两种亚基的各种组合。H4同功酶只见于 心肌,对底物的亲和力比 M4高。高浓度的丙酮酸别构抑制 H4,但不抑制 M4。其他组合, 如 H3M 的性质居于两者之间。在第 16 章,我们将介绍这些同功酶所处的生理环境。 M4 同功酶在骨骼肌剧烈运动导致缺氧的厌氧环境中活性最高,而心肌的 LDH 处于心肌 的有氧环境中活性最高。实际上,从缺氧环境转移至有氧环境,大鼠心脏中这些同功酶的类 型也相应变化(图 10.16A)。图 11.16B 显示成年大鼠中不同组织的 LDH 情况。 图 10.16 乳酸脱氢酶同功酶。(A)大鼠发育过程中心脏 LDH 表达谱的变化情况。H 亚基 用方块表示,M 亚基用圆圈表示。负数表示出生前的天数,正数表示出生后的天数。(B) 成年大鼠不同组织的 LDH 同功酶。 有些同功酶在血液中出现表示相应组织出现损伤,可以用作临床诊断指标。例如血清中 H4(相对于 H3M)水平增加表示心肌破裂(Myocardial infraction)或心脏病,损伤了心肌细胞 导致胞内组分释放。 10.3 共价修饰时调节酶活性的一种方式 与另一个分子共价连接能够调节酶促活性和其他一些蛋白质活性。在这方面,供体分子 提供蛋白质共价连接的功能基团。大多数修饰是可逆的。最常见的共价修饰是磷酸化和去磷 酸化。乙酰化和去乙酰化是另一种常见的蛋白共价修饰。将 DNA 包装压缩成染色体的蛋白 质,即组蛋白,在或体内有深度的乙酰化和去乙酰化(31.3 节)。活跃转录基因所结合的组 蛋白,乙酰化程度更高。乙酰基转移酶和去乙酰酶自身的活性受磷酸化-去磷酸化调节。说 明修饰酶的共价修饰可能调节蛋白质共价修饰。 有些情况下共价修饰不可逆。在信号传导过程中蛋白质不可逆地与脂质分子共价连接, 变成面向细胞浆的固定于细胞质膜的蛋白质,如 Ras(一种 GTPase)和 Src(一种蛋白酪氨 酸激酶)。固定在这种地方,蛋白质更能够接受沿信号途径传递的信号,并将信号向下游传 递(第 14 章)。有些癌症,其 Ras 和 Src 有变异。与小蛋白 ubiquitin 连接,是销毁该蛋白的

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