26 生物技术通根Biotechnology Bulletin 2009年第8期 少，大大缩短试验时间，现已成为人们试图进行药物 物合成途径的放线紫红素(actinorhodin)的生物合 “快速筛选”的一种手段。目前，已经培育出较多的 成基因簇完全搞清后，以actI、actⅢ等基因片段作 转基因动物用于药物筛选研究，并已在抗肿瘤药物、 为探针，应用DNA-DNA同源杂交技术(Southern印 抗艾滋病病毒药物、抗肝炎病毒药物、肾脏疾病药物 迹法)直接筛选一些产生作用于多聚乙酰途径的新 的筛选中取得突破性进展)。 抗生素产生菌的方法亦已建立。 一个重要的例子是多药耐药性(multidrug-.resist- 作为对生物体内DNA合成过程的模拟，PCR技 ance,mdr)转基因酿筛选模型的建立。由人体mdr-l 术中所涉及到的酶、模板和引物均可作为药物作用 基因编码表达的能量依赖性药物排出泵，能泵出有效 的靶位。因此，如果一种药物加入PCR反应体系中 天然细胞毒药物，如柔红霉素、长春碱、长春新碱、放 能够抑制PCR反应合成DNA,它往往也能抑制体内 线菌素D、紫杉醇等，这一转运系统称之为多药转运 DNA的合成。据此，Hota等a)设计了一个利用 系统（或P糖蛋白），肿瘤细胞以这种方式引起的对 PCR技术来筛选作用于DNA的抗肿瘤药物的新筛 抗肿瘤药物的耐药性称之为多药耐药性，是肿瘤有 选方法。 效治疗的一大障碍。药理研究着眼于抑制多药转运 2.4基因工程技术生产杂合抗生素 蛋白以促进现有的人类肿瘤的化疗，但由于缺乏有 杂合抗生素定义为由遗传杂种产生的具有抗菌 效的动物模型而延缓了药物研究的进展。Mickisch 活性的新化合物，区别于“突变生物合成”或“杂合 等应用重组DNA技术建立了多药耐药转基因 生物合成”所产生的已知抗生素的类似物。Hop 鼠，使md-】基因在实验动物骨髓细胞中表达，在其 wood等)将放线紫红素生物合成基因转人另两种 膜表面产生多药转运蛋白，然后测定转基因能否保 结构十分相似的异色满醒类代谢物曼德每素(med- 护骨髓细胞免受化疗的损害，作为鉴定动物模型是 ermycin)和二氢榴菌素的产生菌中表达，获得了新 否可靠的指标。 的杂合抗生素meder-rhodin A和双氢榴紫红素。我 转基因动物已逐渐成为当今分子药理学研究的 国的王以光等4]将麦迪聳素产生菌的麦迪霉素4” 重要手段和作为疾病模型用于药物筛选的一种重要 酰化酶基因导入螺旋霉素产生菌并表达，同样获得 工具，但仍存在如选择的实验动物的种属差异性、性 了异戊酰螺旋霉素。应用基因工程技术改造产生新 别不均衡、转基因产物并不一定能长期表达、目的基 的杂合抗生素，为新药物开发提供了一种完全不同 因能否准确地定位于等位基因上等技术问题。另 于以往的新技术。 外，建立转基因动物模型需明确疾病的基因遗传背 3 基因工程技术在药物生产工艺改进中的 景和克隆表达，现在常用的微量注射法及胚胎干细 应用 胞法各有优缺点，因此有人设想，是否能将这两种方 尽管目前诱变育种技术仍是改良微生物工业生 法结合起来，产生更多的实验模型，如早老性痴桌、 产菌种的主要手段，但是基因工程技术在改良工业 帕金森病等。 生产菌种方面已有成功的报道。最常见的是将控制 2.3其它与药物筛选有关的基因工程技术 药物合成关键步骤的酶基因克隆，通过适当的载体 除了受体，药物作用的靶酶也常用作药物筛选 转移到原生产菌中，以使控制限速步骤的酶水平，从 模型。这些酶在动物体内的含量通常也不高，通过 而提高产量。Malmberg等1构建了一种带有编码 基因重组使其在微生物中大量表达也具有重要意 赖氨酸e-氨基转移酶基因(lysine~e-aminotranster~- 义。例如，利用基因工程重组大肠肝菌来表达真核 ase,LAT)这种控制Streptomyces elavuligerus生物合 生物大鼠的DNA聚合酶B已获成功，为大量筛选 成头霉素C的限速步骤的关键酶的基因(lat)的高 DNA聚合酶抑制剂提供了充足的靶酶2)。 拷贝质粒，并转入这种头霉素产生菌，使LAT提高 目前临床上应用的红霉素、四环素、利福霉素、 活力提高了4倍，在2L发酵罐中产生头霉素的能 两性霉素、阿霉素等重要抗生素均作用于多聚乙酰 力是原来的2倍，重组菌胞外LAT产物α-氨基己二 (polyketide)生物合成途径。在同样作用于这一生 酸的积累量也比原受体菌高。 万方数据26 生物技术通报Biotechnology Bulletin 2009年第8期 少，大大缩短试验时间，现已成为人们试图进行药物 q陕速筛选”的一种手段。目前，已经培育出较多的 转基因动物用于药物筛选研究，并已在抗肿瘤药物、 抗艾滋病病毒药物、抗肝炎病毒药物、肾脏疾病药物 的筛选中取得突破性进展¨9|。 一个重要的例子是多药耐药性(muhidrug．resist． ance，mdr)转基因鼠筛选模型的建立。由人体mdr—J 基因编码表达的能量依赖性药物排出泵，能泵出有效 天然细胞毒药物，如柔红霉素、长春碱、长春新碱、放 线菌素D、紫杉醇等，这一转运系统称之为多药转运 系统(或P糖蛋白)，肿瘤细胞以这种方式引起的对 抗肿瘤药物的耐药性称之为多药耐药性，是肿瘤有 效治疗的一大障碍。药理研究着眼于抑制多药转运 蛋白以促进现有的人类肿瘤的化疗，但由于缺乏有 效的动物模型而延缓了药物研究的进展。Mickiseh 等嵋叫应用重组DNA技术建立了多药耐药转基因 鼠，使mdr．J基因在实验动物骨髓细胞中表达，在其 膜表面产生多药转运蛋白，然后测定转基因能否保 护骨髓细胞免受化疗的损害，作为鉴定动物模型是 否可靠的指标。 转基因动物已逐渐成为当今分子药理学研究的 重要手段和作为疾病模型用于药物筛选的一种重要 工具，但仍存在如选择的实验动物的种属差异性、性 别不均衡、转基因产物并不一定能长期表达、目的基 因能否准确地定位于等位基因上等技术问题。另 外，建立转基因动物模型需明确疾病的基因遗传背 景和克隆表达，现在常用的微量注射法及胚胎干细 胞法各有优缺点，因此有人设想，是否能将这两种方 法结合起来，产生更多的实验模型，如早老性痴呆、 帕金森病等。 2．3 其它与药物筛选有关的基因工程技术 除了受体，药物作用的靶酶也常用作药物筛选 模型。这些酶在动物体内的含量通常也不高，通过 基因重组使其在微生物中大量表达也具有重要意 义。例如，利用基因工程重组大肠肝菌来表达真核 生物大鼠的DNA聚合酶B已获成功，为大量筛选 DNA聚合酶抑制剂提供了充足的靶酶旧“。 目前临床上应用的红霉素、四环素、利福霉素、 两性霉素、阿霉素等重要抗生素均作用于多聚乙酰 (polyketide)生物合成途径。在同样作用于这一生 物合成途径的放线紫红素(actinorhodin)的生物合 成基因簇完全搞清后，以act I、actⅢ等基因片段作 为探针，应用DNA—DNA同源杂交技术(Southern印 迹法)直接筛选一些产生作用于多聚乙酰途径的新 抗生素产生菌的方法亦已建立。 作为对生物体内DNA合成过程的模拟，PCR技 术中所涉及到的酶、模板和引物均可作为药物作用 的靶位。因此，如果一种药物加入PCR反应体系中 能够抑制PCR反应合成DNA，它往往也能抑制体内 DNA的合成。据此，Hotta等旧副设计了一个利用 PCR技术来筛选作用于DNA的抗肿瘤药物的新筛 选方法。 2．4基因工程技术生产杂舍抗生素 杂合抗生素定义为由遗传杂种产生的具有抗菌 活性的新化合物，区别于“突变生物合成”或“杂合 生物合成”所产生的已知抗生素的类似物。Hop￾wood等心副将放线紫红素生物合成基因转入另两种 结构十分相似的异色满醌类代谢物曼德霉素(med￾ermycin)和二氢榴菌素的产生菌中表达，获得了新 的杂合抗生素meder-rhodin A和双氢榴紫红素。我 国的王以光等【241将麦迪霉素产生菌的麦迪霉素4” 酰化酶基因导入螺旋霉素产生菌并表达，同样获得 了异戊酰螺旋霉素。应用基因工程技术改造产生新 的杂合抗生素，为新药物开发提供了一种完全不同 于以往的新技术。 3基因工程技术在药物生产工艺改进中的 应用 尽管目前诱变育种技术仍是改良微生物工业生 产菌种的主要手段，但是基因工程技术在改良工业 生产菌种方面已有成功的报道。最常见的是将控制 药物合成关键步骤的酶基因克隆，通过适当的载体 转移到原生产菌中，以使控制限速步骤的酶水平，从 而提高产量。Malmberg等Ⅲ’构建了一种带有编码 赖氨酸￡一氨基转移酶基因(1ysine-8一aminotranster￾ase，LAT)这种控制Streptomyces clavuligerus生物合 成头霉素C的限速步骤的关键酶的基因(1at)的高 拷贝质粒，并转入这种头霉素产生菌，使LAT提高 活力提高了4倍，在2 L发酵罐中产生头霉素的能 力是原来的2倍，重组菌胞外LAT产物a-氨基己二 酸的积累量也比原受体菌高。 万方数据