生物技术通报 ·综述与专论， BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2009年第8期 基因工程制药的研究现状与发展前景 汤娇雯 (中回农村技术开发中心，北京100045) 摘要：简要叙述了近年来基因工程技术在医药工业中的应用进展，主要包括基因工程技术在药物生产、新药开发及 药物生产工艺改进的应用。随着基因组和蛋白质组研究的深入，基因工程药物将有更多的机会获得突破性进展。 关键词：基因工程重组药物新药开发生产工艺改进 The Current Status and Prospects of Research and Development of Genetic Engineering Pharmaceutics Tang Jiaowen (China Rural Technology Development Center,Beijing 100045) Abstract:In this paper,the recent application of genetic engineering technology in pharmaceutical industry was introduced brief- ly.DNA recombinant technology has been playing important roles in medicine production,drugs discovery and development and im- provements of pharmaceutical production process.Both genomics and proteomics are contributing to understanding and determining more targets which involved in the development of human disease,which means there would be increasing opportunities for genetic engi- neering pharmaceutical breakthroughs. Key words:Genetic engineering technology Genetic recombinant medicine Drugs discovery and development Improvement of pharmaceutical production process 自1972年DNA重组技术诞生以来，生命科学进 少，来源困难，且具有种间特异性，因此利用基因工程 人了一个崭新的发展时期。以基因工程为核心的现 生产重组激素成为一种既安全又经济的策略。另外， 代生物技术已应用到农业、医药、化工、环境等各个领 利用基因工程技术不仅可以得到天然的激素蛋白，还 域。基因工程技术的迅速发展不仅使医学基础学科 可以通过定点突变的方法有目的地改造蛋白的结构， 发生了革命性的变化，也为医药工业发展开辟了广阔 获得性能更为优越的或者是全新的激素药物。 的前景，以DNA重组技术为基础的基因工程技术改造 运用重组DNA技术克隆胰岛素基因，并进行人 和替代传统医药工业技术已成为重要的发展方向。 胰岛素大规模地生产是重组蛋白药物应用于临床的 1基因工程技术在药物生产中的应用 第一例，1982年经美国食品和药品管理局(FDA)批 基因工程技术在医药工业中最重要的应用是通 准上市，成为现代生物技术为人类健康服务的领头 过DNA重组方便、有效，大量地生产以前由于材料 羊。目前已批准上市的重组激素类药物有胰岛素 来源困难或制造技术问题无法生产的药物，主要生 (insulin)、重组人生长激素(recombinant human growth 理活性物质、疫苗、抗体3大类。 hormone,rhGH)、重组人促卵泡激素(recombinant hu- 1.1重组表达生理活性物质 man follical stimulating hormone,rhFSH)。尚待研发 L.1.1激素类药物激素是由内分泌腺和特异细胞 中十分看好的重组激素药物还有：胰岛素样生长因 产生的含量极低的一类生物分子，作为一类化学信使 子-l(insulin--like growth factor 1,ICF-l)和生长激 或信号分子引发专一的生理效应。激素在体内含量极 素受体拮抗剂。除了目前开发的蛋白激素之外还 收稿日期：2009-04-20 作者简介：汤娇墨(1979)，女，助理研究员，主要从事科技管理；E-mail:jo0228@163.com 万方数据
·综述与专论· 生物技术通报 BloTECHNOLOGY BULLETIN 2009年第8期 基因工程制药的研究现状与发展前景 汤娇雯 (中国农村技术开发中心，北京100045) 摘要： 简要叙述了近年来基因工程技术在医药工业中的应用进展，主要包括基因工程技术在药物生产、新药开发及 药物生产工艺改进的应用。随着基因组和蛋白质组研究的深入，基因工程药物将有更多的机会获得突破性进展。 关键词： 基因工程重组药物新药开发生产工艺改进 The Current Status and Prospects of Research and Development of Genetic Engineering Pharmaceutics Tang Jiaowen (China Rural Technology Development Center，Beijing 100045) Abstract： In this paper，the recent application of genetic engineering technology in pharmaceutical industry was introduced briefly．DNA recombinant technology has been playing important roles in medicine production，drugs discovery and development and improvements of pharmaceutical production process．Both genomics and proteomics are contributing to understanding and determining more targets which involved in the development of human disease，which means there would be increasing opportunities for genetic engineering pharmaceutical breakthroughs． Key words： Genetic engineering technology Genetic recombinant medicine Drugs discovery and development Improvement of pharmaceutical production process 自1972年DNA重组技术诞生以来，生命科学进 入了一个崭新的发展时期。以基因工程为核心的现 代生物技术已应用到农业、医药、化工、环境等各个领 域。基因工程技术的迅速发展不仅使医学基础学科 发生了革命性的变化，也为医药工业发展开辟了广阔 的前景，以DNA重组技术为基础的基因工程技术改造 和替代传统医药工业技术已成为重要的发展方向…。 l 基因工程技术在药物生产中的应用 基因工程技术在医药工业中最重要的应用是通 过DNA重组方便、有效、大量地生产以前由于材料 来源困难或制造技术问题无法生产的药物，主要生 理活性物质、疫苗、抗体3大类。 1．1 重组表达生理活性物质 1．1．1 激素类药物激素是由内分泌腺和特异细胞 产生的含量极低的一类生物分子，作为一类化学信使 或信号分子引发专一的生理效应。激素在体内含量极 少，来源困难，且具有种间特异性，因此利用基因工程 生产重组激素成为一种既安全又经济的策略。另外， 利用基因工程技术不仅可以得到天然的激素蛋白，还 可以通过定点突变的方法有目的地改造蛋白的结构， 获得性能更为优越的或者是全新的激素药物嵋1。 运用重组DNA技术克隆胰岛素基因，并进行人 胰岛素大规模地生产是重组蛋白药物应用于临床的 第一例，1982年经美国食品和药品管理局(FDA)批 准上市，成为现代生物技术为人类健康服务的领头 羊。目前已批准上市的重组激素类药物有胰岛素 (insulin)、重组人生长激素(recombinant human growth hormone，rhGH)、重组人促卵泡激素(recombinant human follical stimulating hormone，rhFSH)o尚待研发 中十分看好的重组激素药物还有：胰岛素样生长因 子．1(insulin．1ike growth factor 1。IGF—1)¨1和生长激 素受体拮抗剂H】。除了目前开发的蛋白激素之外还 收稿日期：2009—04-20 作者简介：汤娇雯(1979一)。女，助理研究员，主要从事科技管理；E-mail：j00228@163．corn 万方数据
2009年第8期 汤娇雯：基因工程制药的研究现状与发展前景 23 有一大类非蛋白激素，因为它们需要多酶体系才能合 药候选物。这一新的技术路线利用了反向生物学原 成，目前的基因工程还无法合成这类激素，随着人类 理，沿着基因序列→+蛋白质→功能→药物的途径研制 基因组计划的完成，期待基因组工程将成为解决这一 新药，药物研发的原材料取自庞大的人类基因资源及 问题的最佳途径。 其编码蛋白质，具有巨大的开发潜力8，。 1.1,2细胞因子类药物机体的各种细胞均能合 1.1.3重组溶血栓药物溶栓治疗是血栓性疾病的 成和分泌小分子的多肽类因子，他们调节机体的生 安全、有效的手段，溶血栓药物通过激活无活性的血 理功能，参与各种细胞的增殖、分化、调亡并行使功 浆纤溶酶原(Pg),形成有活性的纤溶酶(m),后者 能，这些因子称为细胞因子。根据细胞因子的功能 催化血栓主要基质纤维蛋白水解，使血栓溶解，血管 可将其分为干扰素(IFN)、集落刺激因子(CSF)、白 再通，从而抢救急性心肌梗塞和心肌梗死患者，显著 细胞介素(IL)、肿瘤坏死因子(TNF)、趋化因子、转 降低病死率，提高患者病后生活质量【)。国内外已 化生长因子B(TGF-B)及生长因子等6类)。细胞 正式批准临床使用的重组溶栓药物有：重组链激酶 因子在某些情况下还可以产生病理作用，参与自身 (recombinant streptokinase,rt-SK),重组组织型纤维 免疫病、肿瘤、移植排斥、休克等疾病的发生和发 酶原激活剂(recombinant tissue-type plasminogen acti-- 展)。在国际医药生物技术领域，重组细胞因子药 vator,t-PA),对-甲氧苯甲酰纤溶酶原链激酶复合物 物是迄今开发最成功的产品之一，在临床上治疗疑 (APSAC)。但是现在的溶栓药物还存在许多缺陷，如 难病症已收到明显疗效，目前已有多种药物被批准 灌注延迟或失败、出血等不良反应，以及再梗死等问 上市（表1），年产值已达数十亿美元。 题。随着分子生物学技术的飞速发展，以及结构生物 表1已批准上市的重组细胞因子药物) 学的兴起，人们对现有蛋白质多肽类溶栓药物的编码 基因及其蛋白质的功能结构的了解逐渐深入，在此基 名称 适应症 IFNa 白血病、Kaposi肉瘤，肝炎，癌症、ADS 础上将研制开发出一系列新型溶栓药物。新型溶栓 慢性肉芽肿、生殖器烧、过敏性皮炎，感染性疾病、 IFNy 药物应具有更强的纤维蛋白选择性、更长的半衰期、 类风湿关节炎 抗PAI-1抑制作用。目前正在研究的有重组t-PA的 自身骨髓移植、化疗导致的粒细胞城少症、ADS、再 G-CSF 生森碍性贫血、白血病 突变体、重组scu-PA的突变体、重组葡激酶、重组纤 自身骨髓移植、化疗导致的血细胞或少症、ADS、再 GM-CSF 溶酶原激活剂的嵌和体等。 生淼碍性贫血 此外，DNA重组技术还用于一些以前只能通过化学 慢性肾衰竭导致的贫血、痛症或癌症化疗导致的贫 Epo 血，失血后贫血 处理和发酵相结合来生产的具有药用价值的小分子活性 L-2 癌症、免疫缺陷、疫苗佐剂 物质，主要包括抗生素、氨基酸以及一些维生素，。 IFNB 多发性硬化症 1.2基因工程疫苗 L-11 放化疗所致血小板减少症 SCF 与G-CSF联合应用于外周血干细胞移植 基因工程疫苗是使用重组DNA技术克隆并表 EGF 外用药治疗烧伤、费殇 达保护性抗原基因，利用表达的抗原产物活重组体 bFCF 外用药治疗烧伤，外周神经炎 本身制成的疫苗。主要包括)(1)基因工程亚单 位疫苗：将基因工程表达的蛋白抗原纯化后制成的 重组细胞因子药物的常规路线：首先通过发现其 疫苗。其优点在于产量大，纯度高、免疫原性好，可 蛋白质所具有的生物活性，以此为线索通过基因表 以用于那些病原体难于培养或有潜在致癌性或有免 达、药理药效研究，从而开发成为新药。这一路线的 疫病理作用的疫苗研究。目前正在研究的基因工程 缺点是发现新药的概率较低，只有人体内较高表达的 亚单位疫苗主要有甲肝、丙肝、戊肝、出血热、血吸 蛋白质才有可能被发现。基因组药物的开发已成为 虫、艾滋病等疫苗。(2)基因工程载体疫苗：利用微 人类基因组计划的一个重要的目标和发展契机，即利 生物做载体，将保护性抗原基因重组到微生物体中， 用基因序列数据，经生物信息学分析、高通量基因表 使用能表达保护性抗原基因的重组微生物制成的疫 达，高通量功能筛选和体内外药效研究开发得到的新 苗。使用痘苗病毒天坛株制备的甲肝、乙肝、麻疹、 万方数据
2009年第8期 汤娇雯：基因工程制药的研究现状与发展前景 23 有一大类非蛋白激素，因为它们需要多酶体系才能合 成，目前的基因工程还无法合成这类激素，随着人类 基因组计划的完成，期待基因组工程将成为解决这一 问题的最佳途径。 1．1．2细胞因子类药物 机体的各种细胞均能合 成和分泌小分子的多肽类因子，他们调节机体的生 理功能，参与各种细胞的增殖、分化、凋亡并行使功 能，这些因子称为细胞因子。根据细胞因子的功能 可将其分为干扰素(IFN)、集落刺激因子(CSF)、白 细胞介素(IL)、肿瘤坏死因子(TNF)、趋化因子、转 化生长因子p(TGF．B)及生长因子等6类”o。细胞 因子在某些情况下还可以产生病理作用，参与自身 免疫病、肿瘤、移植排斥、休克等疾病的发生和发 展¨1。在国际医药生物技术领域，重组细胞因子药 物是迄今开发最成功的产品之一，在临床上治疗疑 难病症已收到明显疗效，目前已有多种药物被批准 上市(表1)，年产值已达数十亿美元。 表1 已批准上市的重组细胞因子药物‘7’ 适应症 白血病、Kaposi肉瘤、肝炎、癌症、AIDS 慢性肉芽肿、生殖器疣、过敏性皮炎，感染性疾病、 类风湿关节炎 自身骨髓移植、化疗导致的粒细胞减少症、AIDS、再 生障碍性贫血、白血病 自身骨髓移植、化疗导致的血细胞减少症、AIDS、再 生障碍性贫血 慢性肾衰竭导致的贫血、癌症或癌症化疗导致的贫 血、失血后贫血 癌症、免疫缺陷、疫苗佐剂 多发性硬化症 放化疗所致血小板减少症 与G-CSF联合应用于外周血干细胞移植 外用药治疗烧伤、溃疡 外用药治疗烧伤、外周神经炎 重组细胞因子药物的常规路线：首先通过发现其 蛋白质所具有的生物活性，以此为线索通过基因表 达、药理药效研究，从而开发成为新药。这一路线的 缺点是发现新药的概率较低，只有人体内较高表达的 蛋白质才有可能被发现。基因组药物的开发已成为 人类基因组计划的一个重要的目标和发展契机，即利 用基因序列数据，经生物信息学分析、高通量基因表 达、高通量功能筛选和体内外药效研究开发得到的新 药候选物。这一新的技术路线利用了反向生物学原 理，沿着基因序列一蛋白质-+功能一药物的途径研制 新药，药物研发的原材料取白庞大的人类基因资源及 其编码蛋白质，具有巨大的开发潜力¨一1。 I．1．3 重组溶血栓药物溶栓治疗是血栓性疾病的 安全、有效的手段，溶血栓药物通过激活无活性的血 浆纤溶酶原(Pig)，形成有活性的纤溶酶(Plm)，后者 催化血栓主要基质纤维蛋白水解，使血栓溶解，血管 再通，从而抢救急性心肌梗塞和心肌梗死患者，显著 降低病死率，提高患者病后生活质量¨…。国内外已 正式批准临床使用的重组溶栓药物有：重组链激酶 (recombinant streptokinase，rt—SK)，重组组织型纤维 酶原激活剂(recombinant tissue—type plasminogen acti— vator，rt—PA)，对一甲氧苯甲酰纤溶酶原链激酶复合物 (APSAC)。但是现在的溶栓药物还存在许多缺陷，如 灌注延迟或失败、出血等不良反应，以及再梗死等问 题。随着分子生物学技术的飞速发展，以及结构生物 学的兴起，人们对现有蛋白质多肽类溶栓药物的编码 基因及其蛋白质的功能结构的了解逐渐深入，在此基 础上将研制开发出一系列新型溶栓药物。新型溶栓 药物应具有更强的纤维蛋白选择性、更长的半衰期、 抗PAl一1抑制作用。目前正在研究的有重组t—PA的 突变体、重组SCU．PA的突变体、重组葡激酶、重组纤 溶酶原激活剂的嵌和体等。 此外，DNA重组技术还用于一些以前只能通过化学 处理和发酵相结合来生产的具有药用价值的小分子活性 物质，主要包括抗生素、氨基酸以及一些维生素…’“1。 1．2基因工程疫苗 基因工程疫苗是使用重组DNA技术克隆并表 达保护性抗原基因，利用表达的抗原产物活重组体 本身制成的疫苗。主要包括¨列(1)基因工程亚单 位疫苗：将基因工程表达的蛋白抗原纯化后制成的 疫苗。其优点在于产量大，纯度高、免疫原性好，可 以用于那些病原体难于培养或有潜在致癌性或有免 疫病理作用的疫苗研究。目前正在研究的基因工程 亚单位疫苗主要有甲肝、丙肝、戊肝、出血热、血吸 虫、艾滋病等疫苗。(2)基因工程载体疫苗：利用微 生物做载体，将保护性抗原基因重组到微生物体中， 使用能表达保护性抗原基因的重组微生物制成的疫 苗。使用痘苗病毒天坛株制备的甲肝、乙肝、麻疹、 铈一№ 叭 ㈣ 一 跏 M螂㈨|；}啷一 万方数据
24 生物技术通报Biotechnology Bulletin 2009年第8期 EBV、HIV等重组疫苗已进行了小量人体免疫观察。 1.3基因工程抗体 一些载体基因组容量大，适合于进行多价疫苗的研 DNA重组技术与抗体基因结构功能的研究相 究，即一种载体表达多种疾病的保护性抗原或表达 结合，根据研究者的意图在基因水平对抗体分子进 不同抗原的多个重组病毒混合，一次接种可预防多 行分割、拼接或修饰，甚至是人工全合成后导入受体 种疾病。(3)核酸疫苗：使用能够表达抗原的基因 细胞表达，即产生新型基因工程抗体，主要应用于诊 本身制成的疫苗。甲型流感病毒研究结果表明，核 断试剂和治疗性抗体)。基因工程抗体的改造包 酸疫苗不仅可以诱生中和抗体和保护同株病毒的攻 括以下途径(1)鼠单克隆抗体的人源化：克服鼠源 击，还发现用编码流感病毒共同的核蛋白抗原的 抗体的免疫原性，使其和人体内的抗体分子具有及 cDNA作为疫苗，可以诱生细胞毒T淋巴细胞反应， 其相似的轮廓，从而逃避人免疫系统的识别，避免诱 从而保护不同变种的攻击，为研制过去长期没有解 导人抗鼠免疫反应。第一个可用人源基因代替的部 决的多型善变的病原体疫苗开辟了新的途径。(4) 分是鼠源抗体中的Fc区域，用编码人抗体的F©区 基因缺失活疫苗：通过分子生物学技术去除与毒力 域的DNA片段替换鼠源单抗Fc的DNA,重组的 有关的基因获得的缺失突变毒株制成的疫苗。与传 DNA分子克隆到表达载体后转人培养的杂交瘤细 统的自然突变株活疫苗相比，基因缺失突变株具有 胞，从该细胞中收集嵌合抗体。研究人员把人的结 突变性状稳定、明确、不易反祖的优点。目前已获准 肠癌细胞的嵌合抗体注入患者体内时，其半寿期比 生产的霍乱活菌苗就是缺少了毒素A亚单位和其 单纯的鼠源抗体延长了6倍，且在10例患者中仅有 他毒力相关基因的菌株：兽用伪狂犬病疫苗是另一 1例产生了抗嵌合抗体的抗体；(2)制备双特异性抗 种已生产应用的基因缺失活疫苗。(5)蛋白质工程 体：将天然的双价单特异性抗体分子进行改造，把其 疫苗：将抗原基因加以改造，使之发生点突变、插人、 他效应物质如毒素、酶、细胞因子、受体分子通过一 缺失、构型改变，甚至进行不同基因或部分结构域的 定方法与抗体Fb片段连接，使之即可以与靶细胞 人工组合，以期达到增强其产物的免疫原性，扩大反 结合，又可介导其他的效应功能，从而最大限度的杀 应谱，去除有害作用或副反应的一类疫苗。目前这 伤靶细胞：(3)制备完全人源性抗体：目前人们尝试 方面的研究大多还只在实验动物中进行。 将人源免疫干细胞导人缺失大部分兔疫细胞的小鼠 发展基因工程疫苗的主要方向：研制常规技术 体内，使免疫细胞严重不足的小鼠实际上获得了人 不能或很雅解决的新疫苗：主要针对免疫效果差，副 的细胞免疫系统，当这种小鼠被抗原免疫的时候会 反应大，成本较高和使用不方便的传统疫苗，积极对 产生人源的抗体：另一种途径是将改造过的人的抗 其进行改造；加强治疗性疫苗的研究；发展具有高导 体基因导入小鼠的胚胎系中，以得到能在免疫后产 人、高表达、强免疫、可加强的新型载体，是研制多价 生人的抗体的转基因鼠。这种改造后的抗体除了构 疫苗的另一条重要途径。 成抗原结合部位的轻重链各3个CDR区域是鼠源 表2应用基因工程改造的传统病毒疫苗 外，其余都是人源的；(4)表达单链抗体：完整的抗 疫苗 可能使用的基因工程狡苗类型 体分子，相对分子量较大，难以穿过血管壁，影响了 流感 基因缺失活疫苗，遗传重配活疫苗 甲型肝炎 重组活疫苗，亚单位疫苗 靶部位对其的摄取。通过计算机分析，如果一个单 乙型脑炎 基因缺失活疫苗，重组活疫苗，亚单位狡苗 链抗体只包含V,和V:区域，并加入一段衔接多肽 水拉 基闪缺失活疫苗 将它们分开，即可获得正确的抗原结合构像。人工 麻疹 重组活疫苗，基因缺失活疫苗 黄热 重组活疫苗，亚单位疫苗 合成一段DNA序列，然后以V衔接物-V4的顺序 狂犬 重组活疫苗 接上V,和Vg的DNA序列，这个嵌和基因结构在 出血热 重组活疫苗，亚单位疫苗 大肠杆菌中表达以后，纯化出的单链蛋白的亲和性 腺病毒 基因缺失活疫苗，遗传重配活疫苗，重组活疫苗 轮状病毒 亚单位疫苗 和特异性都与原来完整的单克隆抗体没有差别。在 联合疫苗 重组多价活疫苗，亚单位联合疫苗 肿瘤治疗中单链ⅴ片段抗体也具有广泛的应用前 景，它体积小、免疫原性低，不易引起人为的免疫排 万方数据
生物技术通报Biotechnology Bulletin 2009年第8期 EBV、HIV等重组疫苗已进行了小量人体免疫观察。 一些载体基因组容量大，适合于进行多价疫苗的研 究，即一种载体表达多种疾病的保护性抗原或表达 不同抗原的多个重组病毒混合，一次接种可预防多 种疾病。(3)核酸疫苗：使用能够表达抗原的基因 本身制成的疫苗。甲型流感病毒研究结果表明，核 酸疫苗不仅可以诱生中和抗体和保护同株病毒的攻 击，还发现用编码流感病毒共同的核蛋白抗原的 eDNA作为疫苗，可以诱生细胞毒T淋巴细胞反应， 从而保护不同变种的攻击，为研制过去长期没有解 决的多型善变的病原体疫苗开辟了新的途径。(4) 基因缺失活疫苗：通过分子生物学技术去除与毒力 有关的基因获得的缺失突变毒株制成的疫苗。与传 统的自然突变株活疫苗相比，基因缺失突变株具有 突变性状稳定、明确、不易反祖的优点。目前已获准 生产的霍乱活菌苗就是缺少了毒素A亚单位和其 他毒力相关基因的菌株；兽用伪狂犬病疫苗是另一 种已生产应用的基因缺失活疫苗。(5)蛋白质工程 疫苗：将抗原基因加以改造，使之发生点突变、插入、 缺失、构型改变，甚至进行不同基因或部分结构域的 人工组合，以期达到增强其产物的免疫原性，扩大反 应谱，去除有害作用或副反应的一类疫苗。目前这 方面的研究大多还只在实验动物中进行。 发展基因工程疫苗的主要方向：研制常规技术 不能或很难解决的新疫苗；主要针对免疫效果差，副 反应大，成本较高和使用不方便的传统疫苗，积极对 其进行改造；加强治疗性疫苗的研究；发展具有高导 入、高表达、强免疫、可加强的新型载体，是研制多价 疫苗的另一条重要途径。 表2应用基因工程改造的传统病毒疫苗¨劓 疫苗 可能使用的摹因工程疫苗类型 流感 甲型肝炎 乙型脑炎 水痘 麻疹 黄热 狂犬 出血热 腺病毒 轮状病毒 联合疫苗 基因缺失活疫苗．遗传莺配活疫苗 重组活疫苗，亚单位疫苗 基因缺失活疫苗，重组活疫苗，亚单位疫苗 基冈缺失活疫苗 重组活疫苗，基因缺失活疫苗 重组活疫苗。亚单位疫苗 重组话疫苗 重组活疫苗，亚单位疫苗 基因缺失活疫苗，遗传重配活疫苗，重组活疫苗 亚单位疫苗 重组多价活疫苗，亚单位联合疫苗 1．3基因工程抗体 DNA重组技术与抗体基因结构功能的研究相 结合，根据研究者的意图在基因水平对抗体分子进 行分割、拼接或修饰，甚至是人工全合成后导入受体 细胞表达，即产生新型基因工程抗体，主要应用于诊 断试剂和治疗性抗体¨“。基因工程抗体的改造包 括以下途径(1)鼠单克隆抗体的人源化：克服鼠源 抗体的免疫原性，使其和人体内的抗体分子具有及 其相似的轮廓，从而逃避人免疫系统的识别，避免诱 导人抗鼠免疫反应。第一个可用人源基因代替的部 分是鼠源抗体中的Fc区域，用编码人抗体的Fc区 域的DNA片段替换鼠源单抗Fc的DNA，重组的 DNA分子克隆到表达载体后转入培养的杂交瘤细 胞，从该细胞中收集嵌合抗体。研究人员把人的结 肠癌细胞的嵌合抗体注入患者体内时，其半寿期比 单纯的鼠源抗体延长了6倍，且在10例患者中仅有 1例产生了抗嵌合抗体的抗体；(2)制备双特异性抗 体：将天然的双价单特异性抗体分子进行改造，把其 他效应物质如毒素、酶、细胞因子、受体分子通过一 定方法与抗体Fab片段连接，使之即可以与靶细胞 结合，又可介导其他的效应功能，从而最大限度的杀 伤靶细胞；(3)制备完全人源性抗体：目前人们尝试 将人源免疫干细胞导入缺失大部分免疫细胞的小鼠 体内，使免疫细胞严重不足的小鼠实际上获得了人 的细胞免疫系统，当这种小鼠被抗原免疫的时候会 产生人源的抗体；另一种途径是将改造过的人的抗 体基因导入小鼠的胚胎系中，以得到能在免疫后产 生人的抗体的转基因鼠。这种改造后的抗体除了构 成抗原结合部位的轻重链各3个CDR区域是鼠源 外，其余都是人源的；(4)表达单链抗体：完整的抗 体分子，相对分子量较大，难以穿过血管壁，影响了 靶部位对其的摄取。通过计算机分析，如果一个单 链抗体只包含V。和V。区域，并加入一段衔接多肽 将它们分开，即可获得正确的抗原结合构像。人工 合成一段DNA序列，然后以VL．衔接物-V。的顺序 接上V。．和V。的DNA序列，这个嵌和基因结构在 大肠杆菌中表达以后，纯化出的单链蛋白的亲和性 和特异性都与原来完整的单克隆抗体没有差别。在 肿瘤治疗中单链Fv片段抗体也具有广泛的应用前 景，它体积小、免疫原性低，不易引起人为的免疫排 万方数据
2009年第8期 汤娇雯：基因工程制药的研究现状与发展前景 25 斥反应，渗透性好，能有效穿透致密的肿瘤屏障，有 原，可在小鼠体内引起免疫反应。 利于实体瘤的诊断和治疗：(5)制备抗体融合蛋白： 2基因工程技术在新药开发中的应用 将抗体的可变区域与非抗体蛋白融合，使融合蛋白 基因工程技术是与医药卫生产业结合极为紧密 继承抗体分子的结合特异性。或者用非免疫球蛋白 的高新技术，它的发展为发现有新颍药理作用的先 的序列替换抗体的可变区，例如，用CD4、白细胞介 导化合物提供了重要手段，已导致了新药研发方法 素2和肿瘤坏死因子受体等被称为“免疫黏附蛋 的革命。 白”的分子的序列来替换，融合蛋白获得抗体相关 2.1重组受体与药物筛选 的性质，可激活机体免疫功能和提高药物动力活 在新药研究开发中日益广泛使用的受体筛选模 性等。 型所需的受体往往来自动物体内，传统的受体制备 1.4重组基因药物表达系统的改善 是从大量的组织匀浆中提取，数量有限，因而不利于 目前绝大多数的重组蛋白药物都是在细菌等原 大量筛选。重组受体技术把受体或受体亚型的基因 核生物中表达，但是在原核生物表达系统无法对合 从人体组织中克隆出来，再在微生物或哺乳动物细 成的真核生物蛋白进行特定的翻译后修饰。例如， 胞内表达。与传统的受体制备技术相比，重组受体 形成正确的二硫健、切割前体、蛋白质糖基化赋予蛋 技术有很多优点：受体来源于人而不是动物，所以重 白质稳定性核某些特殊性质、对氨基酸进行磷酸化 组受体所得的试验结果与人体试验的结果直接相 等修饰：而且细菌中的有毒蛋白或有抗原作用的蛋 关；可大量制备受体并能得到只在特定组织中存在、 白可能会混杂在最终产物中。因此人们构建了真核 用传统制备方法难以获得的受体：重组受体包含了 表达系统用于生产药物蛋白，尤其是以转基因动植 细胞内或细胞膜上G蛋白等信号转导系统，更接近 物作为生物反应器生产重组蛋白药物。优点在于生 人体的自然状态，重组受体纯度高，更为经济。它的 产出的药物蛋白质与天然蛋白质在生化、生理和功 出现，导致了制药工业从传统动物受体制备向克隆 能等方面的性状完全一致；可高效大量表达，降低生 的人体受体的转变。 产成本；表达产物易于被接受。 Synaptic制药公司研究了能调节神经系统功能 转基因动植物在生产基因工程药物方面已接近 的肾上腺素能受体亚型、含5-HT的受体亚型及人 实用化阶段。1995年，Pharmaceutical Protein Ltd. 类转移因子受体亚型，并已克隆了许多受体，目前正 将人的基因插人绵羊胚胎，使之在成羊乳中表达产 用于筛选治疗精神失常及由神经功能失调引起的其 生人抗胰蛋白酶(AAT),表达量30gL,从乳清中 他疾病的药物。此外，其他一些重组受体如克隆的 提纯AAT回收率达到50%以上。Genpharm Ltd.用 人体多巴胺D5受体亚型、缩胆囊素B/促胃酸激素 转基因羊生产的乳铁蛋白是一种在人乳汁中产生的 受体、血管紧张素Ⅱ的I型受体等也已用于药物筛 抗菌蛋白，对免疫系统受损病人或化疗病人有益。 选并申请了专利。虽然此项技术的发展还需要一段 Genzyme Transgenic Corp.培养的转基因山羊能生产 时间的发展完善，但是克隆的人体受体已证明在药 人抗凝血蛋白酶I(AT-I),可用于治疗遗传性 物筛选中是有用的。 AT-I缺陷。另外，应用转基因动物生产EP0,IL- 2.2转基因动物与药物筛选 2,pA,血凝因子I等也取得了很大进展。1989 在医学研究中转基因动物可以“真实”地体现 年，某种抗体的重链和轻链即被成功的转人烟草中， 目的基因的活动特征，将分子水平、细胞水平、整体 将表达抗体重链和轻链的烟草单株进行杂交得到的 水平的研究有机地联系起来，可在不破坏活体原有 转基因烟草株能产生具功能的完整的抗体，其特异 系统的前提下，对一个或多个因素进行研究，使问题 性和亲和性与原抗体差不多：转基因植物的另一个 简化。利用转基因动物可建立敏感动物品系及人类 热点是利用植物系统生产疫苗。食用植物表达疫 相同疾病的动物模型用于药物筛选，避免了传统的 苗，人们通过食用这些转基因植物就起到接种疫苗 动物模型与人类某种症状相似的疾病在致病原因、 的作用。目前已在转基因烟草中表达了乙肝表面抗 机理不尽相同的缺点，其结果准确，经济，试验次数 万方数据
2009年第8期 汤娇雯：基因工程制药的研究现状与发展前景 25 斥反应，渗透性好，能有效穿透致密的肿瘤屏障，有 利于实体瘤的诊断和治疗；(5)制备抗体融合蛋白： 将抗体的可变区域与非抗体蛋白融合，使融合蛋白 继承抗体分子的结合特异性。或者用非免疫球蛋白 的序列替换抗体的可变区，例如，用CD4、白细胞介 素2和肿瘤坏死因子受体等被称为“免疫黏附蛋 白”的分子的序列来替换，融合蛋白获得抗体相关 的性质，可激活机体免疫功能和提高药物动力活 性等。 1．4重组基因药物表达系统的改善 目前绝大多数的重组蛋白药物都是在细菌等原 核生物中表达，但是在原核生物表达系统无法对合 成的真核生物蛋白进行特定的翻泽后修饰。例如， 形成正确的二硫健、切割前体、蛋白质糖基化赋予蛋 白质稳定性核某些特殊性质、对氨基酸进行磷酸化 等修饰；而且细菌中的有毒蛋白或有抗原作用的蛋 白可能会混杂在最终产物中。因此人们构建了真核 表达系统用于生产药物蛋白，尤其是以转基因动植 物作为生物反应器生产重组蛋白药物。优点在于生 产出的药物蛋白质与天然蛋白质在生化、生理和功 能等方面的性状完全一致；可高效大量表达，降低生 产成本；表达产物易于被接受。 转基因动植物在生产基因工程药物方面已接近 实用化阶段。1995年，Pharmaceutical Protein Ltd． 将人的基因插入绵羊胚胎，使之在成羊乳中表达产 生人抗胰蛋白酶(AAT)，表达量30 g／L，从乳清中 提纯AAT回收率达到50％以上。Genpharm Ltd．用 转基因羊生产的乳铁蛋白是一种在人乳汁中产生的 抗菌蛋白，对免疫系统受损病人或化疗病人有益。 Genzyme Transgenic Corp．培养的转基因山羊能生产 人抗凝血蛋白酶III(AT．III)，可用于治疗遗传性 AT．III缺陷。另外，应用转基因动物生产EPO，IL一 2，tpA，血凝因子III等也取得了很大进展。1989 年，某种抗体的重链和轻链即被成功的转人烟草中， 将表达抗体重链和轻链的烟草单株进行杂交得到的 转基因烟草株能产生具功能的完整的抗体，其特异 性和亲和性与原抗体差不多；转基因植物的另一个 热点是利用植物系统生产疫苗。食用植物表达疫 苗，人们通过食用这些转基因植物就起到接种疫苗 的作用。目前已在转基因烟草中表达了乙肝表面抗 原，可在小鼠体内引起免疫反应。 2基因工程技术在新药开发中的应用 基因工程技术是与医药卫生产业结合极为紧密 的高新技术，它的发展为发现有新颖药理作用的先 导化合物提供了重要手段，已导致了新药研发方法 的革命。 2．1 重组受体与药物筛选 在新药研究开发中日益广泛使用的受体筛选模 型所需的受体往往来自动物体内，传统的受体制备 是从大量的组织匀浆中提取，数量有限，因而不利于 大量筛选。重组受体技术把受体或受体亚型的基因 从人体组织中克隆出来，再在微生物或哺乳动物细 胞内表达。与传统的受体制备技术相比，重组受体 技术有很多优点：受体来源于人而不是动物，所以重 组受体所得的试验结果与人体试验的结果直接相 关；可大量制备受体并能得到只在特定组织中存在、 用传统制备方法难以获得的受体；重组受体包含了 细胞内或细胞膜上G．蛋白等信号转导系统，更接近 人体的自然状态，重组受体纯度高，更为经济。它的 出现，导致了制药工业从传统动物受体制备向克隆 的人体受体的转变。 Synaptic制药公司研究了能调节神经系统功能 的肾上腺素能受体亚型、含5．HT的受体亚型及人 类转移因子受体亚型，并已克隆了许多受体，目前正 用于筛选治疗精神失常及由神经功能失调引起的其 他疾病的药物。此外，其他一些重组受体如克隆的 人体多巴胺D5受体亚型、缩胆囊素B／促胃酸激素 受体、血管紧张素Ⅱ的I型受体等也已用于药物筛 选并申请了专利。虽然此项技术的发展还需要一段 时间的发展完善，但是克隆的人体受体已证明在药 物筛选中是有用的¨8。。 2．2 转基因动物与药物筛选 在医学研究中转基因动物可以“真实”地体现 目的基因的活动特征，将分子水平、细胞水平、整体 水平的研究有机地联系起来，可在不破坏活体原有 系统的前提下，对一个或多个因素进行研究，使问题 简化。利用转基因动物可建立敏感动物品系及人类 相同疾病的动物模型用于药物筛选，避免了传统的 动物模型与人类某种症状相似的疾病在致病原因、 机理不尽相同的缺点，其结果准确，经济，试验次数 万方数据
26 生物技术通根Biotechnology Bulletin 2009年第8期 少，大大缩短试验时间，现已成为人们试图进行药物 物合成途径的放线紫红素(actinorhodin)的生物合 “快速筛选”的一种手段。目前，已经培育出较多的 成基因簇完全搞清后，以actI、actⅢ等基因片段作 转基因动物用于药物筛选研究，并已在抗肿瘤药物、 为探针，应用DNA-DNA同源杂交技术(Southern印 抗艾滋病病毒药物、抗肝炎病毒药物、肾脏疾病药物 迹法)直接筛选一些产生作用于多聚乙酰途径的新 的筛选中取得突破性进展)。 抗生素产生菌的方法亦已建立。 一个重要的例子是多药耐药性(multidrug-.resist- 作为对生物体内DNA合成过程的模拟，PCR技 ance,mdr)转基因酿筛选模型的建立。由人体mdr-l 术中所涉及到的酶、模板和引物均可作为药物作用 基因编码表达的能量依赖性药物排出泵，能泵出有效 的靶位。因此，如果一种药物加入PCR反应体系中 天然细胞毒药物，如柔红霉素、长春碱、长春新碱、放 能够抑制PCR反应合成DNA,它往往也能抑制体内 线菌素D、紫杉醇等，这一转运系统称之为多药转运 DNA的合成。据此，Hota等a)设计了一个利用 系统（或P糖蛋白），肿瘤细胞以这种方式引起的对 PCR技术来筛选作用于DNA的抗肿瘤药物的新筛 抗肿瘤药物的耐药性称之为多药耐药性，是肿瘤有 选方法。 效治疗的一大障碍。药理研究着眼于抑制多药转运 2.4基因工程技术生产杂合抗生素 蛋白以促进现有的人类肿瘤的化疗，但由于缺乏有 杂合抗生素定义为由遗传杂种产生的具有抗菌 效的动物模型而延缓了药物研究的进展。Mickisch 活性的新化合物，区别于“突变生物合成”或“杂合 等应用重组DNA技术建立了多药耐药转基因 生物合成”所产生的已知抗生素的类似物。Hop 鼠，使md-】基因在实验动物骨髓细胞中表达，在其 wood等)将放线紫红素生物合成基因转人另两种 膜表面产生多药转运蛋白，然后测定转基因能否保 结构十分相似的异色满醒类代谢物曼德每素(med- 护骨髓细胞免受化疗的损害，作为鉴定动物模型是 ermycin)和二氢榴菌素的产生菌中表达，获得了新 否可靠的指标。 的杂合抗生素meder-rhodin A和双氢榴紫红素。我 转基因动物已逐渐成为当今分子药理学研究的 国的王以光等4]将麦迪聳素产生菌的麦迪霉素4” 重要手段和作为疾病模型用于药物筛选的一种重要 酰化酶基因导入螺旋霉素产生菌并表达，同样获得 工具，但仍存在如选择的实验动物的种属差异性、性 了异戊酰螺旋霉素。应用基因工程技术改造产生新 别不均衡、转基因产物并不一定能长期表达、目的基 的杂合抗生素，为新药物开发提供了一种完全不同 因能否准确地定位于等位基因上等技术问题。另 于以往的新技术。 外，建立转基因动物模型需明确疾病的基因遗传背 3 基因工程技术在药物生产工艺改进中的 景和克隆表达，现在常用的微量注射法及胚胎干细 应用 胞法各有优缺点，因此有人设想，是否能将这两种方 尽管目前诱变育种技术仍是改良微生物工业生 法结合起来，产生更多的实验模型，如早老性痴桌、 产菌种的主要手段，但是基因工程技术在改良工业 帕金森病等。 生产菌种方面已有成功的报道。最常见的是将控制 2.3其它与药物筛选有关的基因工程技术 药物合成关键步骤的酶基因克隆，通过适当的载体 除了受体，药物作用的靶酶也常用作药物筛选 转移到原生产菌中，以使控制限速步骤的酶水平，从 模型。这些酶在动物体内的含量通常也不高，通过 而提高产量。Malmberg等1构建了一种带有编码 基因重组使其在微生物中大量表达也具有重要意 赖氨酸e-氨基转移酶基因(lysine~e-aminotranster~- 义。例如，利用基因工程重组大肠肝菌来表达真核 ase,LAT)这种控制Streptomyces elavuligerus生物合 生物大鼠的DNA聚合酶B已获成功，为大量筛选 成头霉素C的限速步骤的关键酶的基因(lat)的高 DNA聚合酶抑制剂提供了充足的靶酶2)。 拷贝质粒，并转入这种头霉素产生菌，使LAT提高 目前临床上应用的红霉素、四环素、利福霉素、 活力提高了4倍，在2L发酵罐中产生头霉素的能 两性霉素、阿霉素等重要抗生素均作用于多聚乙酰 力是原来的2倍，重组菌胞外LAT产物α-氨基己二 (polyketide)生物合成途径。在同样作用于这一生 酸的积累量也比原受体菌高。 万方数据
26 生物技术通报Biotechnology Bulletin 2009年第8期 少，大大缩短试验时间，现已成为人们试图进行药物 q陕速筛选”的一种手段。目前，已经培育出较多的 转基因动物用于药物筛选研究，并已在抗肿瘤药物、 抗艾滋病病毒药物、抗肝炎病毒药物、肾脏疾病药物 的筛选中取得突破性进展¨9|。 一个重要的例子是多药耐药性(muhidrug．resist． ance，mdr)转基因鼠筛选模型的建立。由人体mdr—J 基因编码表达的能量依赖性药物排出泵，能泵出有效 天然细胞毒药物，如柔红霉素、长春碱、长春新碱、放 线菌素D、紫杉醇等，这一转运系统称之为多药转运 系统(或P糖蛋白)，肿瘤细胞以这种方式引起的对 抗肿瘤药物的耐药性称之为多药耐药性，是肿瘤有 效治疗的一大障碍。药理研究着眼于抑制多药转运 蛋白以促进现有的人类肿瘤的化疗，但由于缺乏有 效的动物模型而延缓了药物研究的进展。Mickiseh 等嵋叫应用重组DNA技术建立了多药耐药转基因 鼠，使mdr．J基因在实验动物骨髓细胞中表达，在其 膜表面产生多药转运蛋白，然后测定转基因能否保 护骨髓细胞免受化疗的损害，作为鉴定动物模型是 否可靠的指标。 转基因动物已逐渐成为当今分子药理学研究的 重要手段和作为疾病模型用于药物筛选的一种重要 工具，但仍存在如选择的实验动物的种属差异性、性 别不均衡、转基因产物并不一定能长期表达、目的基 因能否准确地定位于等位基因上等技术问题。另 外，建立转基因动物模型需明确疾病的基因遗传背 景和克隆表达，现在常用的微量注射法及胚胎干细 胞法各有优缺点，因此有人设想，是否能将这两种方 法结合起来，产生更多的实验模型，如早老性痴呆、 帕金森病等。 2．3 其它与药物筛选有关的基因工程技术 除了受体，药物作用的靶酶也常用作药物筛选 模型。这些酶在动物体内的含量通常也不高，通过 基因重组使其在微生物中大量表达也具有重要意 义。例如，利用基因工程重组大肠肝菌来表达真核 生物大鼠的DNA聚合酶B已获成功，为大量筛选 DNA聚合酶抑制剂提供了充足的靶酶旧“。 目前临床上应用的红霉素、四环素、利福霉素、 两性霉素、阿霉素等重要抗生素均作用于多聚乙酰 (polyketide)生物合成途径。在同样作用于这一生 物合成途径的放线紫红素(actinorhodin)的生物合 成基因簇完全搞清后，以act I、actⅢ等基因片段作 为探针，应用DNA—DNA同源杂交技术(Southern印 迹法)直接筛选一些产生作用于多聚乙酰途径的新 抗生素产生菌的方法亦已建立。 作为对生物体内DNA合成过程的模拟，PCR技 术中所涉及到的酶、模板和引物均可作为药物作用 的靶位。因此，如果一种药物加入PCR反应体系中 能够抑制PCR反应合成DNA，它往往也能抑制体内 DNA的合成。据此，Hotta等旧副设计了一个利用 PCR技术来筛选作用于DNA的抗肿瘤药物的新筛 选方法。 2．4基因工程技术生产杂舍抗生素 杂合抗生素定义为由遗传杂种产生的具有抗菌 活性的新化合物，区别于“突变生物合成”或“杂合 生物合成”所产生的已知抗生素的类似物。Hopwood等心副将放线紫红素生物合成基因转入另两种 结构十分相似的异色满醌类代谢物曼德霉素(medermycin)和二氢榴菌素的产生菌中表达，获得了新 的杂合抗生素meder-rhodin A和双氢榴紫红素。我 国的王以光等【241将麦迪霉素产生菌的麦迪霉素4” 酰化酶基因导入螺旋霉素产生菌并表达，同样获得 了异戊酰螺旋霉素。应用基因工程技术改造产生新 的杂合抗生素，为新药物开发提供了一种完全不同 于以往的新技术。 3基因工程技术在药物生产工艺改进中的 应用 尽管目前诱变育种技术仍是改良微生物工业生 产菌种的主要手段，但是基因工程技术在改良工业 生产菌种方面已有成功的报道。最常见的是将控制 药物合成关键步骤的酶基因克隆，通过适当的载体 转移到原生产菌中，以使控制限速步骤的酶水平，从 而提高产量。Malmberg等Ⅲ’构建了一种带有编码 赖氨酸￡一氨基转移酶基因(1ysine-8一aminotransterase，LAT)这种控制Streptomyces clavuligerus生物合 成头霉素C的限速步骤的关键酶的基因(1at)的高 拷贝质粒，并转入这种头霉素产生菌，使LAT提高 活力提高了4倍，在2 L发酵罐中产生头霉素的能 力是原来的2倍，重组菌胞外LAT产物a-氨基己二 酸的积累量也比原受体菌高。 万方数据
2009年第8期 汤娇雯：基因工程制药的研究现状与发展前景 27 伊维菌素(ivermectins)是一个市场很大的抗虫 发酵时直接产生7-ACA。 抗生素，其前体阿弗米丁(avermectins)的产生菌种 调节基因在药物的生物合成中也起着重要作 的发酵液中有8个以上的组分，其中只有B1a组分 用，增加调节基因的基因量能够大幅提高药物产量。 才是制备伊维菌素的原料。keda等26经过近十年 Hopwood等将放线紫红素生物合成的一个调节基因 的努力，已将阿弗米丁的生物合成基因簇全部搞清， atⅡ导人原产生菌，尽管基因的拷贝数仅增加了2 并经过诱变与DNA重组，获得了仅产阿弗米丁B2a 倍，放线紫红素的产量却增加了30~40倍。 单一组分和B1a、B2a组份的重组工程菌，这不仅大 某些抗生素生产菌的产量不高，是由于其自身 大提高了阿弗米丁有效组分的发酵效价，且给提取、 对该抗生素的抗性不高。因此，利用高拷贝质粒的 精制、半合成等后处理工序带来了很大的便利。可， 基因量效应，增加菌种对自身产生的抗生素的抗性， 以预见，随着对各种工业生产的微生物药物生物合 可能增加抗生素的产量。例如，将氨基糖苷6-乙酰 成途径的深入了解以及基因重组技术的不断进展， 转移酶基因导人卡那素和新霉素产生菌，由于提 应用基因工程方法定向构建高产菌株的成功实例将 高了对氨糖类抗生素的抗性，产量提高了2~6倍。 越来越多。 4展望 在抗生素发酵过程中供氧往往是一个限制因 综上所述，基因工程技术在医药工业中的应用 素，充足的氧气供给是药物工业发酵稳定和提高产 非常广泛，利用基因工程技术开发药物已成为当前 量，降低成本的关键。传统的解决方法如增加通气 最为活跃和迅猛发展的领域。随着人类基因组计划 量等对设备要求高，能量消耗大。20世纪70年代 的完成，以及基因组学、蛋白质组学、生物信息学等 末在专性好氧菌透明颤(Vitreoscilla)中发现了血红 研究的深人，为医药生物技术开拓了一个新的领域， 蛋白(VHb),它能促进氧气扩散到细胞末端氧化酶 基因工程制药将有更多机会获得突破性进展，为保 上。于是人们想到了将其基因Vgb克隆到其它微生 障人类健康做出更大的贡献。 物中，以促进微生物在低氧条件下生长。1988年 Khosla等2从Vitreoscilla中分离出Vgb基因并将之 参考文献 转人大肠杆菌(E.co),提高了大肠杆菌在溶氧量 1醒礼嘉，膜红雅，胡平，等，现代生物技术导论[M]北京：高等 低于5%时对氧的利用率。目前已用克隆表达VHb 教育出版社，1998. 的方法提高了放线紫红素、头孢霉素C、红籍素等产 2马大龙，生物技术药物[M].北京：科学出版社，2001， 3牛朝诗，国外医学：生理、病理科学与临床分册，2000,20(3)： 生菌及青霉紫酰化酶基因工程菌的产量4~0)。血 212-215. 红蛋白基因工程的研究和应用，必将对抗生素工业 4龚德华.骨脏病与透析肾移植杂志，1998,7(4)：348-351. 和其它重组药物发酵工业的节能等带来美好的 5曹雪涛.中华消化杂志，1996,15(3)：167-170. 前景。 6 Alcami A.Trends in Immunology,2001,22(1):58 ~60. 作为半合成头孢菌素类抗生素重要原料的7- 7 Whiteside TL Clinical Immunology Newsletter,1998,18(7):69 -77. 氨基头孢烷酸(7-ACA),目前国内外仍以化学裂解 8曹雪涛.中国肿指生物治疗杂志，1995,2(3)：175-179 头孢菌素C的工艺路线为主。国内外已报道可用 9 Jurgen D.Naure Biotechnology,1996.14:1516-1519. 经由GL-7-ACA的二步法（化学/酶法或二步酶法） 10牡平中.国外医药：合成药、生化药、制剂分册，1998,19(2)： 来生产7-ACA,与化学裂解法相比不仅收率提高，且 67-71. 能大大减少环境污染，简化生产工艺。但二步法中 11吴悟期.药学进展，1996,20(1)：16-21. 关键的GL-7-ACA酰化酶在假单胞菌中表达量低而 12陈建华，陈鬓祖，是悟桐.药物生物技术，1995,2（1)：56 -60. 且分离纯化困难，限制了这种方法的应用。通过将 13 David B,Weiner RC,Kennedy.Gene Vaccine Science,1999,254 GL-7-ACA酰化酶基因转人大肠杆菌中表达恰好可 (10):16-23. 以解决这一问题[1。最近又报道可将编码2个酶 14吴梧桐，基因工程药物：基础与临床[M],北京：人民卫生出版 的基因直接转人头孢菌素C的生产菌种中，使其在 社，1996. (下转第31页) 万方数据
2009年第8期 汤娇雯：基因工程制药的研究现状与发展前景 27 伊维菌素(ivermectins)是一个市场很大的抗虫 抗生素，其前体阿弗米丁(avermeetins)的产生菌种 的发酵液中有8个以上的组分，其中只有B1a组分 才是制备伊维菌素的原料。Ikeda等旧刮经过近十年 的努力，已将阿弗米丁的生物合成基因簇全部搞清， 并经过诱变与DNA重组，获得了仅产阿弗米丁B2a 单一组分和B1a、B2a组份的重组工程菌，这不仅大 大提高了阿弗米丁有效组分的发酵效价，且给提取、 精制、半合成等后处理工序带来了很大的便利。可 以预见，随着对各种工业生产的微生物药物生物合 成途径的深入了解以及基因重组技术的不断进展， 应用基因工程方法定向构建高产菌株的成功实例将 越来越多。 在抗生素发酵过程中供氧往往是一个限制因 素，充足的氧气供给是药物工业发酵稳定和提高产 量，降低成本的关键。传统的解决方法如增加通气 量等对设备要求高，能量消耗大。20世纪70年代 末在专性好氧菌透明颤(Vitreoscilla)中发现了血红 蛋白(VHb)，它能促进氧气扩散到细胞末端氧化酶 上。于是人们想到了将其基因vgb克隆到其它微生 物中，以促进微生物在低氧条件下生长。1988年 Khosla等。”1从Vitreoscilla中分离出Vgb基因并将之 转入大肠杆菌(E．coli)，提高了大肠杆菌在溶氧量 低于5％时对氧的利用率。目前已用克隆表达VHb 的方法提高了放线紫红素、头孢霉素C、红霉素等产 生菌及青霉素酰化酶基因工程菌的产量旧¨30J。血 红蛋白基因工程的研究和应用，必将对抗生素工业 和其它重组药物发酵工业的节能等带来美好的 前景。 作为半合成头孢菌素类抗生素重要原料的7一 氨基头孢烷酸(7-ACA)，目前国内外仍以化学裂解 头孢菌素c的工艺路线为主。国内外已报道可用 经由GL-7一ACA的二步法(化学／酶法或二步酶法) 来生产7-ACA，与化学裂解法相比不仅收率提高，且 能大大减少环境污染，简化生产工艺。但二步法中 关键的GL-7一ACA酰化酶在假单胞菌中表达量低而 且分离纯化困难，限制了这种方法的应用。通过将 GL-7一ACA酰化酶基因转入大肠杆菌中表达恰好可 以解决这一问题p“。最近又报道可将编码2个酶 的基因直接转入头孢菌素C的生产菌种中，使其在 发酵时直接产生7一ACA。 调节基因在药物的生物合成中也起着重要作 用，增加调节基因的基因量能够大幅提高药物产量。 Hopwood等将放线紫红素生物合成的一个调节基因 actII导人原产生菌，尽管基因的拷贝数仅增加了2 倍，放线紫红素的产量却增加了30—40倍。 某些抗生素生产菌的产量不高，是由于其自身 对该抗生素的抗性不高。因此，利用高拷贝质粒的 基因量效应，增加菌种对自身产生的抗生素的抗性， 可能增加抗生素的产量。例如，将氨基糖苷石一乙酰 转移酶基因导入卡那霉素和新霉素产生菌，由于提 高了对氨糖类抗生素的抗性，产量提高了2～6倍。 4 展望 综上所述，基因工程技术在医药工业中的应用 非常广泛，利用基因工程技术开发药物已成为当前 最为活跃和迅猛发展的领域。随着人类基因组计划 的完成，以及基因组学、蛋白质组学、生物信息学等 研究的深入，为医药生物技术开拓了一个新的领域， 基因工程制药将有更多机会获得突破性进展，为保 障人类健康做出更大的贡献。 参考文献 l 翟礼嘉，顾红雅，胡平，等，现代生物技术导论[M]．北京：高等 教育出版社，1998． 2 马大龙，生物技术药物[M]．北京：科学出版社。2001． 3 牛朝诗．国外医学：生理、病理科学与临床分册，2000。20(3)： 212—215． 4 龚德华．肾脏病与透析肾移植杂志，1998，7(4)：348～351． 5 曹雪涛．中华消化杂志，1996，15(3)：167—170． 6 Aleami A．Trends in Immunology，2001，22(1)：58—60． 7 Whiteside TL Clinical Immunology Newsletter，1998，18(7)：69 —77． 8 曹雪涛．中国肿瘤生物治疗杂志，1995，2(3)：175—179． 9 Jurgen D．Naure Biotechnology，1996。14：1516～1519． 10牡平中．国外医药：合成药、生化药、制剂分册．1998，19(2)： 67～71． 11吴梧桐．药学进展-，1996，20(1)：16—21． 12陈建华，陈葵祖，吴梧桐．药物生物技术，1995，2(1)：56 —60． 13 David B，Weiner RC，Kennedy．Gene Vaccine Science，1999，254 (10)：16～23． 14吴梧桐，基因工程药物：基础与临床[M]．北京：人民卫生出版 社，1996． (下转第31页) 万方数据
2009年第8期 张鑫等：阳离子脂质体在转基因畜禽中的应用 31 9蒋重林，陆寿珍，沈大棱，细胞生物学实骏[M].上海：复旦大学 -116 出版杜，2001,935-936 18孙新明，魏，赵永聚，等.西南大学学报（自然科学版），2007， 10 Gorlich D,Mattuj IW.Science,1996,271(5255):1513-1518. 29(6):77-81 11 Kim JH,Jung-Ha HS,Lee HT,et aL Mol Reprod Dev,1997,46 19 Nakanishi A,Iritani A.Mol Reprod Dev,1993,36(2):258-261. (4):515-526 20 Squires EJ.Drake D.Animal Biotechology,1993,4:71 ~78. 12 Lai L,Qingyuan S,Guangming W.et al.Zygote,2001,9 339 21杜立新.蒋满喜，山东畜牧兽医，2001,1：1-2 346. 22李建许，陈杰，蔡亚飞，等.南京农业大学学报，2007,30(2)：83 13肖红卫，郑新民，陈思怀，等，华中农业大学学报，2006,25(1)： -88. 170-173. 23 Li B,Sun G,Sun H,et al.Sei China C Life Sei,2008,51(8):734 14刘忠华，宋军，王振坤，等.科学通报.2008,53(5)：556-560. 42. 15李胜芝，马志方，张玥，等.透析与人工器官，2004,15(4)：15 24 Rottmann OJ,Antes R.Hofer P,ct al,Gene Transfer in Rabbits by -17. Liposome Treated Sperms.In:5th World Congress on Genetics Ap- 16曹新，曾泄滔.南京医科大学学报（自然科学版），2003,23(2)： plied to Livestock Production,Guelph:1994,21,347~349. 112-115. 25曹阳.高庆预，李庆伟，等.高技术通讯，2001,10：17→21 17霍挂桃，郑杰，徐广资，等，畜牧普医学报，2008,39(1)：113 0w000000o00⊙00000o00⊙0000000000000000000000c0000000000⊙0000000000030000000000000o0000000000000 (上接第27页) 23 Hopwood DA.Malpartida F.et al.Nature,1985,314:642~644. 15朱迅，肖畅.细胞与分子免疫学杂志，2001,17(1)：1~4. 24王以光，金莲舫.等，生物工程学报，1992,8(1)：1-13. 16扬卫东，等，国外医学：放射医学核医学分册，1999,23(2)：62 25 Malmberg LH.Hu WS,Sherman DH.Joumal of Bacteriology -65. 1993,175(11):6916-6924. 17唐冬生，夏家辉.生命科学研究，1999,3(2)：92-96. 26 Haruo Ikeda,Satoshi Omura.Joural of Antibiotics,1995.48(7): 18周勇.陈国平，中国医院药学杂志，2000，(6)：39-40. 549-562. 19鲁春城.国际药学研究杂志，1997，(6)：330-334. 27 Chaitan Khosla,James EB.Nature,1988.331:633~635. 20 Mickisch GH,Merlino GT,Galski H.et aL Proc Natl Acad Sci 28郭宏秋，杨胜利.激生物学通报，1996,23(4)：227-230. UsA,1991,88(1):547-551. 29周煜，刘涤，胡之璧.药物生物技术，2000,7(4)：251~253. 21 Yoshiyuki M.Hisaaki Y.The Joural of Antibiotics,1996,49(5): 30吴奕，杨胜利，生物工程学报，1997,13(1)：1-5. 491-495. 31陈剑锋，李勇，等.生物化学与生物物理学报，1998,30(4)： 22 Hotta K,Zhu CB,et al.The Journal of Antibiotics,1995,48(11): 393-396. 1267-1272. 万方数据
2009年第8期 张鑫等：阳离子脂质体在转基因畜禽中的应用 3l 蒋亚林，陆寿珍，沈大棱，细胞生物学实验[M]．上海：复旦大学 出版社，2001，935—936． Gorlich D，Mattuj IW．Science，1996，271(5255)：1513一1518． Kim JH，Jung·Ha HS，Lee HT，et aL Mol Reprod Dev，1997，46 (4)：515～526． Lai L，Qingyuan S，Guangming W。et aL Zygote，2001，9：339— 346． 肖红卫，郑新民，陈恩怀，等．华中农业大学学报，2006，25(1)： 170一173． 刘忠华，宋军，王振坤．等．科学通报．2008，53(5)：556—560． 李胜芝，马志方，张弱，等．透析与人工器官，2004，15(4)：15 ～17． 曹新，曾溢滔．南京医科大学学报(自然科学版)，2003，23(2)： 112一115． 17霍桂桃，郑杰，徐广贤，等．畜牧兽医学报，2008，39(I)：113 ～116． 孙新明，魏泓，赵永聚，等．西南大学学报(自然科学版)，2007， 29(6)：77—81． Nakanishi A，Iritani A．Mol Reprod Dev，1993，36(2)：258—261． Squires EJ。Drake D．Animal Biotechology，1993，4：7 1～78． 杜立新，蒋满喜．山东畜牧兽医，2001，1：1—2． 李建许，陈杰，蔡亚飞，等．南京农业大学学报，2007，30(2)：83 ～88． “B，Sun G，Sun H，et a1．Sci China C Life Sol，2008，51(8)：734 —42． Rottmann OJ．Antes R，Hofer P．et al，Gene Transfer in Rabbits by Liposome Treated Sperms．In：5th World Congress on Genetics Ap— plied to Livestock Production，Guelph：1994，21，347～349． 曹阳，高庆颖，李庆伟。等．高技术通讯，2001，10：17—21． (上接第27页) 15朱迅，肖畅．细胞与分子免疫学杂志，2001，17(1)：1～4． 16扬卫东，等．国外医学：放射医学核医学分册。1999，23(2)：62 —65． 17唐冬生，夏家辉．生命科学研究，1999，3(2)：92—96． 18周勇，陈国平．中国医院药学杂志，2000，(6)：39—40． 19鲁春娥．国际药学研究杂志，1997，(6)：330—334． 20 Mickisch GH．Merlino GT．Galski H，et aL Proc Natl Acad Sci USA，1991，88(1)：547—551． 21 Yoshiyuki M．Hisaaki Y．The Journal of Antibiotics，1996，49(5)： 49l～495． 22 Hotta K。Zhu CB，et aL The Journal ofAntibiotics，1995，48(11)： 1267一1272． Hopwood DA，Malpartida F。et a1．Nature，1985，314：642—644． 王以光，金莲舫，等．生物工程学报，1992，8(I)：1～13． Malmberg LH．Hu WS，Sherman Dtt．Journal of Bacteriology， 1993，175(11)：6916—6924． Harllo lkeda．Satoshi Omura．Journal of Antibiotics，1995，48(7)： 549—562． Chaitan Khosla，James EB．Nature，1988，33I：633～635． 郭宏秋，杨胜利．微生物学通报，1996，23(4)：227—230． 周煜，刘涤．胡之壁．药物生物技术，2000，7(4)：251—253． 吴奕，杨胜利．生物工程学报，1997，13(1)：1～5． 陈剑锋，李勇，等．生物化学与生物物理学报，1998，30(4)： 393—396． 埔 坶加”控 ∞ M 笱 9 m¨ 屹 ¨ M：2 埔 ”M笱 拍 "勰”∞” 万方数据