上海交通大学：《细胞工程》精品课程教学资源（学习文献）第4讲 文献 甘蓝型油菜与紫罗兰体细胞杂交研究

第23卷第3期 云南农业大学学报 Vol 23 No3 2008年5月 Joumal ofY unnan A griculturalUn iversity M四2008 甘蓝型油菜与紫罗兰体细胞杂交研究 林良斌，马占强2，张传利，刘雅婷，毛孝强，厦国银'，马忠琴1 (1云南农业大学农学与生物技术学院，云南昆明65020L2河南科技大学生命科学学院，河南洛阳471000) 摘要：以甘蓝型油菜湘油15号和紫罗兰的下胚轴为材料，分离制备原生质体。采用EG-高C·-高H法进 行原生质体融合，在PEG浓度为3，原生质体融合密度为50×10个mL下融合25mi血融合率可达17%。 在附加1.5mg/L24D,0.5mg/LNAA05 mL/LBA的改良的KM8p培养基中，以03moL蔗糖和01mo/ L葡萄糖作渗透稳定剂进行液体浅层培养融合体，培养3~6d细胞发生第1次分裂，7d时统计分裂频率最高为 13.8%,35d后形成大量的细胞团和肉眼可见的小愈伤组织其植板率最高为6%。然后转移到含有01mgL 24D和02 mg /L BA的MS固体培养基上使其增殖。当愈伤组织长至5mm左右时，将其转到含有05mgL BA01mg/LNAA和Q2 mg/LGA,的MS分化培养基上诱导芽分化。当芽长1-2m时，将其切下插入附加 05 mg/L IBA的1/2MS生根培养基上，两周后即可获得完整植株。细胞学鉴定表明获得了杂种植株。 关键词：甘蓝型油菜；紫罗兰；原生质体：体细胞杂交；植株再生 中图分类号：S56540353文献标识码：A文章编号：1004-390N(2008)03-0295-07 Studies on Somatic Hybridization betw een Brassica napus andM althiola incana B.Br LN Lang-bn',MA Zhanq ing',ZHANG C huanl,LU Ya-ting'. MAO Xio-q ing,XH Guo-y n,MA Zhongqn (1 Faculty of Agmonon y and B itechnology Yunnan Agricultural University Kumm ng 650201,China 2 Facu lty of Life Science Henan Scence and Technology Un iversity Luoyang 471000 Chna) Abstract Protoplast iso lated fiom hypocoty ls of cultivar Brassica nopus X angyou 15 and Malthiola incana B Brwere fiused by hem ethod of PEGH igh CaH gh pH and the h ghest fusion frequency 17%was obta ned w hile fusion so ltion contained 30%PEG and fusion w as carred out at the den- sity of5.0x 10 potop lasts /mL for 25m n The fusion-protoplasts were then cultured by "thn liquid layer"method in ipoved KM8p medim supplemented w ih 1.5mg/L 2 4-D,0.5mg/L NAA and 0.5ml/L BA,0.3 mol/L sucrose and 0.I mol/L glucose hat both were used as osmotic regu lator The fisin-potop lasts started to d ivide after 3~6 days and the div ision frequency was 13.8%after beng cultured for 7 days The cellmasses and small calluses could be obtaned after 35 days and the plating efficiency was6.3,then transferred to the poliferation MS medim supp l ented wih 0.1 mg/L 2 4-D and 0.2mg/L BA.Calluses of 5mm n d ia eter w ere transferred on MS d ifferentatin medim supplem ented w ith 0.5mg/L BA,0.1mg/L NAA and 0.2mg/L GA3 and whole plantswere obtaned after transferring 1~2 a shoots to 1/2 MS medium w ih 0.5mg/L IBA for 2 weeks Cytobgy ilentificatins shown that hybrid plantsw ere obtaned Key words Brassica napus Malthio la incna protoplast som atic hybridization p lant regenerat in 收稿日期：2007-05-08 *基金项目：云南省自然科学基金(2004C0035M) e作者简介i林良林A3止男.南武风i载授1韩要从事神来生物技术点德传育种小www.cnki.net ,男，湖南武冈人，教授，博士，主要从事油菜生物技术与遗传育种

第 23卷 第 3期 云南农业大学学报 Vo l
23 No
3 2008年 5月 Journa l o fYunnan A griculturalUn iversity M ay 2008 收稿日期: 2007- 05- 08 * 基金项目: 云南省自然科学基金 ( 2004C0035M ) 作者简介: 林良斌 ( 1963- ) , 男, 湖南武冈人, 教授, 博士, 主要从事油菜生物技术与遗传育种。 甘蓝型油菜与紫罗兰体细胞杂交研究 * 林良斌 1 , 马占强 2 , 张传利 1 , 刘雅婷 1 , 毛孝强 1 , 厦国银 1 , 马忠琴 1 ( 1. 云南农业大学农学与生物技术学院, 云南 昆明 650201; 2. 河南科技大学生命科学学院, 河南 洛阳 471000) 摘要: 以甘蓝型油菜湘油 15号和紫罗兰的下胚轴为材料, 分离制备原生质体。采用 PEG -高 Ca 2+ - 高 pH 法进 行原生质体融合, 在 PEG浓度为 30% , 原生质体融合密度为 5
0 10 5个 /mL下融合 25 m in, 融合率可达 17% 。 在附加 1
5m g /L 2, 4D, 0
5m g /L NAA, 0
5mL /L BA的改良的 KM8p培养基中, 以 0
3m o l/L蔗糖和 0
1 mo l/ L葡萄糖作渗透稳定剂进行液体浅层培养融合体, 培养 3~ 6 d细胞发生第 1次分裂, 7 d时统计分裂频率最高为 13
8% , 35 d后形成大量的细胞团和肉眼可见的小愈伤组织, 其植板率最高为 6
5% 。然后转移到含有 0
1 mg /L 2, 4D和 0
2mg /L BA的 M S固体培养基上使其增殖。当愈伤组织长至 5 mm 左右时, 将其转到含有 0
5 mg /L BA, 0
1 mg /L NAA和 0
2 mg /L GA3 的 MS分化培养基上诱导芽分化。当芽长 1~ 2 cm 时, 将其切下插入附加 0
5 mg /L IBA的 1/2MS生根培养基上, 两周后即可获得完整植株。细胞学鉴定表明获得了杂种植株。 关键词: 甘蓝型油菜; 紫罗兰; 原生质体; 体细胞杂交; 植株再生 中图分类号: S 565
4
035
3 文献标识码: A 文章编号: 1004- 390X ( 2008) 03- 0295- 07 Studies on Somatic Hybridization between Brassica napus andMalthiola incana B
Br LIN L ia ng b in 1 , MA Zhanq ia ng 2 , ZHANG C hua nli 1 , LIU Ya ting 1 , MAO Xiao q ia ng 1 , XIA G uoy in 1 , MA Zho ng q in 1 ( 1. Faculty o f Ag ronom y and B io techno logy, Yunnan Agricultural University, Kunm ing 650201, China; 2. Facu lty of Life Science, H enan Sc ience and TechnologyUn ive rsity, Luoyang 471000, Ch ina) Abstract: Protoplast iso lated from hypocoty ls of cultivar Brassica napus. X iangyou 15 and M althiola incana B. B rw ere fused by them ethod o f PEGH igh Ca 2 + H igh pH and the h ighest fusion frequency ( 17% ) w as obta ined w h ile fusion so lution contained 30% PEG and fusion w as carried out at the den sity o f 5
0 10 5 pro top lasts /mL for 25m in. The fusionprotoplasts w ere then cu ltured by th in liquid layer! method in improved KM 8p medium supplemented w ith 1
5 mg /L 2, 4D, 0
5mg /L NAA and 0
5m l/L BA , 0
3 mo l/L sucrose and 0
1 mo l/L glucose that both w ere used as osmotic regu lator. The fusionpro top lasts started to d iv ide after 3~ 6 days, and the div ision frequency was 13
8% after be ing cu ltured for 7 days. The cellmasses and small calluses could be obta ined after 35 days, and the plating efficiency w as 6
5%, then transferred to the pro liferation M S med ium supp lem ented w ith 0
1 mg /L 2, 4D, and 0
2mg /L BA. C alluses of 5mm in d iam eterw ere transferred onM S d ifferentia tion medium supplemented w ith 0
5mg /L BA, 0
1mg /L NAA and 0
2mg /L GA3, and whole plantsw ere obta ined after transferring 1~ 2 cm shoo ts to 1 /2 MS medium w ith 0
5mg /L IBA for 2 w eeks. Cyto logy identifica tions shown that hybrid plantsw ere obta ined. K ey words: Brassica napus; M althio la incana; pro toplas;t som atic hybridization; p lant regeneration

296 云南农业大学学报 第23卷 油菜栽培种遗传基础狭窄，限制了其育种。 5mm用CPW-21S(含21%蔗糖)悬浮沉淀。 在芸墓属其它植物或近缘属植物中可利用的基因 两者原生质体产量均用血球计数板记数，原生质 资源十分丰富。因此，通过远缘有性杂交或原生 体活力测定用0.%的伊文斯蓝染色检测，以未 质体融合可将其有益基因导入到栽培油菜中，创 染色的原生质体占观察总数原生质体的百分数 造出油菜育种的新种质。紫罗兰(Malhiola inc- 表示。 naB.Br)是十字花科紫罗兰属植物.原产于地中 1.2.3原生质体的融合及融合体的培养 海，可供观赏用，据中国植物志报道，其花可入 原生质体融合采用高Ca-高H法、 药，有泻下、通经功效。花色不象油菜较单一， PEG法和PEG-高Ca2-高H法。融合体分 有玫瑰红、桃红、淡黄、纯白和雪青等；全株被 别用改良的KM8p、B5”和1/2MS培养基进 灰色星状柔毛，不易受虫害。种子油富含ω一3- 行液体浅层培养。每皿加入2mL培养基进行悬 亚麻酸，为保健珍品，是新型特用油料植物。 浮，用Palfim胶带封口，在(26士1)℃下黑暗培 可见，紫罗兰具有改变油菜的花色，提高油菜的 养。每隔2d观察融合体的分裂，待融合体再生 抗虫性，改善油菜品质等优良基因资源。油菜和 细胞完成几次分裂后，移于弱光(200k)下培 紫罗兰的远缘有性杂交高度不亲和，严重限制 养，1周时观察融合体的分裂频率。每隔一周向 了其有益基因资源的利用。为此，笔者以湘油15 各个培养皿中加0.5mL新鲜培养基，新鲜培养基 号和紫罗兰为材料，进行其原生质体对称融合的 的渗透压稳定剂浓度逐渐降低，以便再生细胞壁 研究，旨在建立起甘蓝型油菜与紫罗兰下胚轴细 的细胞生长。 胞对称融合及植株再生的技术体系，期望将紫罗 1.2.4愈伤组织的形成与诱导分化 兰的有益基因导入到栽培油菜中，创造出油菜育 当培养皿中出现肉眼可见的愈伤组织后，统 种新种质。 计植板率，再将其转移到增殖培养基上，以促进 愈伤组织的进一步生长。待愈伤组织长至直径为 1材料和方法 0.5~1m时，将其转移到分化培养基中诱导不 1.1材料 定芽分化。培养条件都为25℃，光照12h/d光 湘油15号(X ngyou15),种子由湖南农业 强为1000k。 大学油料所提供； 1.2.5不定芽的生根 紫罗兰(Malthiola incana B.Br),种子采自 当不定芽长至1~2am时将其切下，插入含 云南思茅地区。 有0.5 mg/L IBA的1/2MS生根培养集中诱导生 1.2方法 根，形成再生植株。 1.21无菌苗体系的建立 1.26杂种愈伤组织的细胞学检测 湘油15号和紫罗兰种子在水中浸泡1h后， 取0.5mm左右大小疏松的愈伤组织于10mL 用70%(VN)乙醇表面消毒1min再用0.% 的离心管中，加入5mL0.1%a-溴萘溶液，处 (WN)的升汞溶液消毒12mn无菌水漂洗4 理3h。然后100g离心5mn弃取上清液后，加 次，接种于不含任何激素的MS固体培养基上， 蒸馏水悬浮、离心5mn重复3次，加入卡诺氏 萌发出苗。培养条件湘油15号为25℃.光照14 固定液(93%乙醇3份+冰醋酸1份)固定20h。 h/d紫罗兰为20℃黑暗培养4d后转到25℃ 再用蒸馏水离心洗涤3次，用60℃预热过的1N 光照14h/d培养。光照强度都为2000k 盐酸解离6mn蒸馏水洗净后用卡宝品红染色液 1.22原生质体的制备 染色3~5mn压片、镜检并照相。 紫罗兰原生质体分离和纯化参照马占强等) 1.2.7再生植株的细胞学鉴定 的方法：湘油15号原生质体的制备方法类似紫罗 待再生植株的根长至1~2m时，取其根尖， 兰的，但取材为培养8d无菌苗的下胚轴，酶液 用0.%a-溴萘处理2~3h漂洗后用卡诺氏固 1.2%Celluase Onoaka R-10+0.4%Macerozyme 定液固定24。然后用蒸馏水漂洗根尖数次，再 Onoaika R-10+3 mmol/L MES+CPW-10 mol/L 用60℃预热过的1N盐酸解离8mn蒸馏水洗 (出52酶解时间AQh滤液用500他血离心pub1逢后用5宝品红染色液染单m中压片：镜e

油菜栽培种遗传基础狭窄, 限制了其育种。 在芸薹属其它植物或近缘属植物中可利用的基因 资源十分丰富。因此, 通过远缘有性杂交或原生 质体融合可将其有益基因导入到栽培油菜中, 创 造出油菜育种的新种质。紫罗兰 (M althiola inca na B
Br) 是十字花科紫罗兰属植物, 原产于地中 海, 可供观赏用, 据中国植物志报道, 其花可入 药, 有泻下、通经功效。花色不象油菜较单一, 有玫瑰红、桃红、淡黄、纯白和雪青等; 全株被 灰色星状柔毛, 不易受虫害。种子油富含
- 3- 亚麻酸 [ 1] , 为保健珍品, 是新型特用油料植物。 可见, 紫罗兰具有改变油菜的花色, 提高油菜的 抗虫性, 改善油菜品质等优良基因资源。油菜和 紫罗兰的远缘有性杂交高度不亲和 [ 2] , 严重限制 了其有益基因资源的利用。为此, 笔者以湘油 15 号和紫罗兰为材料, 进行其原生质体对称融合的 研究, 旨在建立起甘蓝型油菜与紫罗兰下胚轴细 胞对称融合及植株再生的技术体系, 期望将紫罗 兰的有益基因导入到栽培油菜中, 创造出油菜育 种新种质。 1 材料和方法 1
1 材料 湘油 15号 ( X ingyou 15), 种子由湖南农业 大学油料所提供; 紫罗兰 (M althiola incana B
B r. ), 种子采自 云南思茅地区。 1
2 方法 1
2
1 无菌苗体系的建立 湘油 15号和紫罗兰种子在水中浸泡 1 h 后, 用 70% (V /V ) 乙醇表面消毒 1 m in, 再用 0
1% (W /V ) 的升汞溶液消毒 12 m in, 无菌水漂洗 4 次, 接种于不含任何激素的 M S 固体培养基上, 萌发出苗。培养条件湘油 15号为 25 ∀ , 光照 14 h /d; 紫罗兰为 20 ∀ 黑暗培养 4 d, 后转到 25 ∀ 光照 14 h /d培养。光照强度都为 2 000 lx。 1
2
2 原生质体的制备 紫罗兰原生质体分离和纯化参照马占强等 [ 3 ] 的方法; 湘油 15号原生质体的制备方法类似紫罗 兰的, 但取材为培养 8 d无菌苗的下胚轴, 酶液 为 1
2% CelluaseOnozukaR10+ 0
4% M acerozyme Onozuka R10 + 3 mmo l/L M ES + CPW 10 mo l/L ( pH 5
6), 酶解时间 10 h, 滤液用 500 r/m in离心 5m in, 用 CPW - 21S (含 21% 蔗糖 ) 悬浮沉淀。 两者原生质体产量均用血球计数板记数, 原生质 体活力测定用 0
1% 的伊文斯蓝染色检测, 以未 染色的原生质体占观察总数原生质体的百分数 表示。 1
2
3 原生质体的融合及融合体的培养 原生质体融合采用高 Ca 2+ - 高 pH 法 [ 4 ]、 PEG法 [ 5]和 PEG - 高 Ca 2+ - 高 pH 法。融合体分 别用改良的 KM 8p [ 6]、 B5 [ 7]和 1 /2M S [ 8]培养基进 行液体浅层培养。每皿加入 2 mL 培养基进行悬 浮, 用 Palfilm胶带封口, 在 ( 26 # 1) ∀ 下黑暗培 养。每隔 2 d 观察融合体的分裂, 待融合体再生 细胞完成几次分裂后, 移于弱光 ( 200 lx ) 下培 养, 1周时观察融合体的分裂频率。每隔一周向 各个培养皿中加 0
5mL新鲜培养基, 新鲜培养基 的渗透压稳定剂浓度逐渐降低, 以便再生细胞壁 的细胞生长。 1
2
4 愈伤组织的形成与诱导分化 当培养皿中出现肉眼可见的愈伤组织后, 统 计植板率, 再将其转移到增殖培养基上, 以促进 愈伤组织的进一步生长。待愈伤组织长至直径为 0
5~ 1 cm 时, 将其转移到分化培养基中诱导不 定芽分化。培养条件都为 25 ∀ , 光照 12 h /d、光 强为 1 000 lx。 1
2
5 不定芽的生根 当不定芽长至 1~ 2 cm 时将其切下, 插入含 有 0
5 mg /L IBA 的 1 /2 M S生根培养集中诱导生 根, 形成再生植株。 1
2
6 杂种愈伤组织的细胞学检测 取 0
5 mm左右大小疏松的愈伤组织于 10mL 的离心管中, 加入 5 mL 0
1% - 溴萘溶液, 处 理 3 h。然后 100 g离心 5m in, 弃取上清液后, 加 蒸馏水悬浮、离心 5 m in, 重复 3次, 加入卡诺氏 固定液 ( 95%乙醇 3份 + 冰醋酸 1份 ) 固定 20 h。 再用蒸馏水离心洗涤 3次, 用 60 ∀ 预热过的 1 N 盐酸解离 6 m in, 蒸馏水洗净后用卡宝品红染色液 染色 3~ 5m in, 压片、镜检并照相。 1
2
7 再生植株的细胞学鉴定 待再生植株的根长至 1~ 2 cm 时, 取其根尖, 用 0
1% - 溴萘处理 2~ 3 h, 漂洗后用卡诺氏固 定液固定 24 h。然后用蒸馏水漂洗根尖数次, 再 用 60 ∀ 预热过的 1 N 盐酸解离 8 m in, 蒸馏水洗 净后用卡宝品红染色液染色 3~ 5 m in, 压片, 镜 296 云南农业大学学报 第 23卷

第3期 林良斌，等：甘蓝型油菜与紫罗兰体细胞杂研究 297 检并照相。 C+-高H法3种不同的融合方法进行甘蓝型 油菜和紫罗兰原生质体融合，其效果不同（见表 2结果与分析 )。PEG-高Ca-高H法的总融合率最高， 2.1原生质体的融合 且二源融合率也最高。因此，PEG-高C-高 2.1.1融合方法对原生质体融合的影响 山法是进行甘蓝型油菜和紫罗兰原生质体融合的 采用高Ca-高H法、PEG法和PEG-高 最佳方法。 表1融合方法对原生质体融合的影响 Tab.1 Effect of fusinm ethods on the pmotop hst fisin 融合方法fusion method 融合结果 高C-高H法 PEG法 PEG-高C-高H法 fuson results H gh Ca-high pH PEG PEG-H gh Ca-high pH 二源融合di eric fusion 42 10.5 17.8 多源融合polymeric fusin 1.1 44 56 注：以上融合时间为25 m n PEG浓度为3%。 Note The fus ion time is 25m n and the PEG concentratin is 30% 2.1.2PEG浓度对原生质体融合的影响 融合率成正相关，随着原生质体密度的增加，融 在进行甘蓝型油菜和紫罗兰原生质体融合时， 合率也逐渐加大。当原生质体密度低于1.0×10 采用4种组合的PEG-6000浓度进行处理，处理 个mL时，融合率较低，而当密度为1.0×10个 时间为25mn然后在显微镜下观察，结果表明， mL以上时，尽管融合率很高，但多数为多源融 PEG浓度对原生质体融合率有着直接的影响。从 合体。综合考虑上述因素，原生质体融合的最佳 图1可见，随着PEG浓度的增大，原生质体融合 密度为5.0×10个mL。 率也逐渐提高。PEG浓度为30%时，二源融合率 ·多源融合 ▣二源融合 接近最高。而当PEG浓度为40%时，二源融合率 potymeric fusion dimeric fusion 3 达到最高此后，但同时多源融合率也急速增大。 25 此后，二源融合率开始降低，多源融合率继续增 2 加。从综合效果来看，30%PEG是甘蓝型油菜和 童 ⊙ 紫罗兰原生质体融合的最佳浓度。 0 10 50 1005001000 ■二源融合dimeric fusion 原生质体密度Density of protoplast/(万个·mL) 口多源触合polymeric fusion 25 图2原生质体的不同密度对融合率的影响 % Fig.2 Effect of different densities of 50 protoplast on frequency of fusion 注：以上融合方法为PEG结合高Ca-高pH法，PEG 5 浓度为30%，融合时间为25min。 0 Note:The fusion method was PEG-High Ca"-high pH 20 30 40 50 and the PEG concentration was thirty percent and the fusion PEG浓度% time is twenty-five minutes. 图1PEG浓度对源生质体融合的影响 2.1.4融合时间对原生质体融合的影响 Fig.I Effect of PEG concentrations on the protoplast fusion 提高PEG浓度和延长处理时间都可提高融合 注：以上融合方法为PEG结合高Ca-高pH法，融合时 率，但过高的浓度和过长的处理时间会导致融合 间为25min。 Note:The fusion method was PEG-High Ca-high pH 细胞活力下降。本试验分别处理15202530 and the fusion time was twenty-five minutes. mm其融合率（表2）随着处理时间的延长逐渐 2.1.3原生质体不同密度对融合率的影响 提高，但处理时间超过25mn后，聚集体总数增 来羚结果图2表明原焦质体的密度点pub1多俱源合比例没有增加，hn多源增多点

检并照相。 2 结果与分析 2
1 原生质体的融合 2
1
1 融合方法对原生质体融合的影响 采用高 C a 2+ - 高 pH 法、PEG法和 PEG - 高 C a 2+ - 高 pH 法 3 种不同的融合方法进行甘蓝型 油菜和紫罗兰原生质体融合, 其效果不同 (见表 1)。PEG- 高 Ca 2+ - 高 pH 法的总融合率最高, 且二源融合率也最高。因此, PEG - 高 C a 2 + - 高 pH 法是进行甘蓝型油菜和紫罗兰原生质体融合的 最佳方法。 表 1 融合方法对原生质体融合的影响 Tab
1 Effect o f fusion m ethods on the protop last fusion 融合结果 fusion results 融合方法 fusion m ethod 高 C a 2+ -高 pH 法 H igh Ca 2+ - high pH PEG 法 PEG PEG- 高 C a 2+ - 高 pH 法 PEG- H igh C a 2+ - h igh pH 二源融合 d im eric fusion 4
2 10
5 17
8 多源融合 po lym eric fusion 1
1 4
4 5
6 注: 以上融合时间为 25m in, PEG浓度为 30% 。 No te: The fusion tim e is 25 m in and the PEG concentra tion is 30% . 2
1
2 PEG浓度对原生质体融合的影响 在进行甘蓝型油菜和紫罗兰原生质体融合时, 采用 4种组合的 PEG - 6000浓度进行处理, 处理 时间为 25 m in, 然后在显微镜下观察, 结果表明, PEG 浓度对原生质体融合率有着直接的影响。从 图 1可见, 随着 PEG 浓度的增大, 原生质体融合 率也逐渐提高。 PEG浓度为 30% 时, 二源融合率 接近最高。而当 PEG 浓度为 40%时, 二源融合率 达到最高此后, 但同时多源融合率也急速增大。 此后, 二源融合率开始降低, 多源融合率继续增 加。从综合效果来看, 30% PEG 是甘蓝型油菜和 紫罗兰原生质体融合的最佳浓度。 2
1
3 原生质体不同密度对融合率的影响 实验结果 (图 2) 表明: 原生质体的密度与 融合率成正相关, 随着原生质体密度的增加, 融 合率也逐渐加大。当原生质体密度低于 1
0 10 5 个 /mL时, 融合率较低, 而当密度为 1
0 10 7 个 /mL以上时, 尽管融合率很高, 但多数为多源融 合体。综合考虑上述因素, 原生质体融合的最佳 密度为 5
0 10 5 个 /mL。 2
1
4 融合时间对原生质体融合的影响 提高 PEG 浓度和延长处理时间都可提高融合 率, 但过高的浓度和过长的处理时间会导致融合 细胞活力下降。本试验分别处理 15, 20, 25, 30 m in, 其融合率 (表 2) 随着处理时间的延长逐渐 提高, 但处理时间超过 25 m in后, 聚集体总数增 多, 但二源融合比例没有增加, 多源增多。当 第 3期 林良斌, 等: 甘蓝型油菜与紫罗兰体细胞杂研究 297

298 云南农业大学学报 第23卷 PEG浓度为30%，处理时间为30min时，融合体 3d后细胞发生第1次分裂：两周左右形成小细胞 的分裂能力明显下降。 团。实验观察到，胞质较浓的融合体易于分裂， 表2融合液处理时间对融合率的影响 而胞质稀少的融合体仅能分裂两三次，然后死亡。 Tab.2 E ffect of duraton of fus ins soltion 2.2.2培养基对融合体培养的影响 tream ent on the frequency of fus ion 在均附加24-D1.5mgL,6BA0.5mg/L 融合液处理时间mn 融合率% NAA0.5mgL0.1mol/L葡萄糖和0.3mol/L蔗 duration of fuson soltin frequency of fsion 糖的情况下，运用液体浅层培养法，比较了改良 15 65 的KM8pB5和1/2MS培养基对融合体培养的影 20 11.5 响（表3）。从3表可知，在3种培养基中， 25 17.8 KM8p和B5培养基在第3d时发生第1次分裂， 30 22.4 但分裂频率相差很大，当培养15d后，KM8p培 注：以上融合方法为PEG结合高C-高山法， 养基培养的再生细胞团数多于B5培养基培养的 PBG浓度为30%。 Note The fusion m ethod w as PEG-H igh Ca-high pH 再生细胞团数，培养到35d时，只有KM8p培养 基可以培养出较多的直径约2m的愈伤组织。 and PEG concentration w as 30% 而12MS培养基从第1次分裂时间、分裂频率、 2.2融合体的培养 15d时再生细胞团数以及35d时形成的愈伤组织 2.21融合体培养及其早期分裂 数都不如上述两种培养基。故采用KM8即为基本 用改良的KM8p培养基进行液体浅层培养， 培养基为佳。 融合体在培养1d后，体积增大，有的呈椭圆形： 表3培养基对融合体的影响 Tah 3 Effect of basicmed ia on the hybreds of protoplasts 第1次分裂 培养7d时的 培养15d时 培养35d再生 培养基 时间/d 分裂频率% 再生细胞团数 愈伤组织数 media nitatin tme of division fiequency No.of cell cobnies No.of callus fm ation Ist division after 7 d n culure after 15 d n culure after 35 d in culture KM 8p 3 136 +++ +++ B5 3 9.8 ++ + 1/2MS 5 22 注：“+++”为很多，“++”为较多，“+”为较少，“-”为没有。表3相同。 Notc“+++”,“++”,“+”,“_”corespond ing stand for very may may few and nothing ad the same as table4 2.23不同激素浓度及组合对融合体培养的影响 融合体培养中应选择生长素和细胞分裂素一定比例 以改良KM8即为培养基培养融合体，培养密度 的组合，如仅用生长素或细胞分裂素则不利于细胞 为1.0×10个mL其中不同的激素组合和浓度对 分裂和愈伤组织形成。 融合体影响很大（表4）。从表4可知，1.5mgL 2.2.4不同密度对融合体培养的影响 24D,0.5 mg/L NAA和0.5 mL/L BA效果最好， 在融合体培养中，培养密度对原生质体的分 分裂频率高达13.8%。24-D对原生质体的分裂 裂频率影响很大（表5）。当培养密度过小时，原 频率影响较大，在无24D的培养基中，细胞分 生质体开始分裂的时间较长且分裂频率较低。当 裂的频率都很低，单独使用24D时分裂频率较 培养密度低至2.0×10个mL,不能形成愈伤组 高，且随着24D的浓度升高，细胞分裂频率增 织。随着融合体培养密度的增大，分裂频率逐渐 高，说明24D对融合体的分裂和愈伤组织的形 增高，但当培养密度过大时，容易导致细胞聚集、 成起着重要作用。使用24D与NAA、BA的组 粘连，影响细胞进一步分裂，最后导致褐化死亡。 合效果更好，不但分裂频率稍微提高，再生细胞团 本研究表明，培养密度为1.0×10个mL效果最 和再生愈伤组织快也有不酮程度的提高因此在pub1烁n分裂颍率祛品e植板率祛手%：v,.cnki.net

PEG 浓度为 30% , 处理时间为 30 m in时, 融合体 的分裂能力明显下降。 表 2 融合液处理时间对融合率的影响 Tab
2 E ffect o f duration of fusions so lution treatm ent on the frequency of fusion 融合液处理时间 /m in duration o f fusion so lution 融合率 /% frequency o f fusion 15 6
5 20 11
5 25 17
8 30 22
4 注: 以上融合方法为 PEG 结合高 C a 2+ - 高 pH 法, PEG 浓度为 30% 。 No te: The fusion m ethod w as PEG- H igh Ca 2+ - high pH and PEG concentration w as 30% . 2
2 融合体的培养 2
2
1 融合体培养及其早期分裂 用改良的 KM 8p培养基进行液体浅层培养, 融合体在培养 1 d后, 体积增大, 有的呈椭圆形; 3 d后细胞发生第 1次分裂; 两周左右形成小细胞 团。实验观察到, 胞质较浓的融合体易于分裂, 而胞质稀少的融合体仅能分裂两三次, 然后死亡。 2
2
2 培养基对融合体培养的影响 在均附加 2, 4D 1
5 mg /L, 6BA 0
5 mg /L, NAA 0
5 mg /L, 0
1mo l/L葡萄糖和 0
3 mo l/L蔗 糖的情况下, 运用液体浅层培养法, 比较了改良 的 KM 8p, B5和 1 /2M S培养基对融合体培养的影 响 (表 3 )。从 3 表可 知, 在 3 种 培养 基中, KM 8p和 B5培养基在第 3 d 时发生第 1 次分裂, 但分裂频率相差很大, 当培养 15 d后, KM 8p培 养基培养的再生细胞团数多于 B5 培养基培养的 再生细胞团数, 培养到 35 d时, 只有 KM 8p培养 基可以培养出较多的直径约 2 mm 的愈伤组织。 而 1 /2M S 培养基从第 1次分裂时间、分裂频率、 15 d时再生细胞团数以及 35 d时形成的愈伤组织 数都不如上述两种培养基。故采用 KM 8p为基本 培养基为佳。 表 3 培养基对融合体的影响 Tab
3 E ffec t of basicm ed ia on the hybreds o f protoplasts 培养基 media 第 1次分裂 时间 /d in itia tion tim e of 1st div ision 培养 7 d时的 分裂频率 /% d iv ision frequency after 7 d in cu lture 培养 15 d时 再生细胞团数 No
o f ce ll co lonies a fter 15 d in cu lture 培养 35 d再生 愈伤组织数 No
of ca llus fo rm ation after 35 d in culture KM 8p 3 13
6 + + + + + + B5 3 9
8 + + + 1/2M S 5 2
2 + - 注: + + + ! 为很多, + + ! 为较多, + ! 为较少, - ! 为没有。表 3相同。 No te: + + + !, + + !, + !, - ! correspond ing stand for verym any, m any, few and nothing and the same as table 4. 2
2
3 不同激素浓度及组合对融合体培养的影响 以改良 KM 8p为培养基培养融合体, 培养密度 为 1
0 10 5 个 /mL, 其中不同的激素组合和浓度对 融合体影响很大 (表 4)。从表 4可知, 1
5mg /L 2, 4D, 0
5mg /L NAA和 0
5mL /L BA 效果最好, 分裂频率高达 13
8%。2, 4D对原生质体的分裂 频率影响较大, 在无 2, 4D 的培养基中, 细胞分 裂的频率都很低, 单独使用 2, 4D 时分裂频率较 高, 且随着 2, 4D的浓度升高, 细胞分裂频率增 高, 说明 2, 4D 对融合体的分裂和愈伤组织的形 成起着重要作用。使用 2, 4D 与 NAA、BA 的组 合效果更好, 不但分裂频率稍微提高, 再生细胞团 和再生愈伤组织块也有不同程度的提高。因此, 在 融合体培养中应选择生长素和细胞分裂素一定比例 的组合, 如仅用生长素或细胞分裂素则不利于细胞 分裂和愈伤组织形成。 2
2
4 不同密度对融合体培养的影响 在融合体培养中, 培养密度对原生质体的分 裂频率影响很大 (表 5)。当培养密度过小时, 原 生质体开始分裂的时间较长且分裂频率较低。当 培养密度低至 2
0 10 4 个 /mL, 不能形成愈伤组 织。随着融合体培养密度的增大, 分裂频率逐渐 增高, 但当培养密度过大时, 容易导致细胞聚集、 粘连, 影响细胞进一步分裂, 最后导致褐化死亡。 本研究表明, 培养密度为 1
0 10 5 个 /mL效果最 好, 分裂频率达 13
6% , 植板率达 5
8% 。 298 云南农业大学学报 第 23卷

第3期 林良斌，等：甘蓝型油菜与紫罗兰体细胞杂研究 299 表4激素对融合体培养的影响 Tab 4 Effect of phnt homone on he hybreds of protop hsts n culure 激素成分/(mgL') 再生细胞团数 再生愈伤组织数 分裂频率% hom one ompositon num ber of cells number of calluses 24-D 6-BA NAA KT division frequency oolon ies 1.5 1.0 0 0 105 ++ 1.5 05 0 0 11.4 ++ ++ 1.0 05 0 0 9.60 ++ 1.0 05 0 0.5 6.80 05 0 1.0 0 4.20 0 0 1.0 0.5 3.60 1.5 05 05 0 138 1.0 0 0 0 8.50 0 1.0 05 0 7.50 表5培养密度对融合体分裂的影响 Tab 5 Effect of different culture dens ties on the celld iv isin and colon ies fmation 培养密度/(×10.mL) 第一次分裂时间d 分裂频率% 植板率% 褐化情况 desity of cu luure tm e of first diisin division frequency plating effr iency brov ng 2 6 35 0.0 无nm J ￥ 9.6 3.5 无nam 10 3 13.6 5.8 无nam 20 3 16.5 3.7 较少lit上 50 3 17.4 2.0 明显obv ious 2.3杂种的细胞学鉴定 因素 对融合体再生的愈伤组织进行染色体观察， 本研究试用了高C-高H法、PEG法和 发现不同继代的愈伤组织的染色体条数不同，介 PEG结合高Ca+-高H法3种不同的融合方法。 于14~76条，而湘油15号的染色体条数为2n= 结果发现，高Ca-高H法的融合率最低，PEG 38紫罗兰的染色体条数为2n=14说明愈伤组 法次之，而PEG结合高Ca-高山法的融合率 织或是来源于同源融合，或是来源于异源融合， 最高。从目前成功的细胞融合的资料来看，绝大 或是来源于非融合体。在检测过的愈伤组织块中， 多数也都是以PEG与高Ca+-高H液相结合来 16.%的愈伤组织块染色体数目在38~52条之 诱导原生质体融合为主，这说明了此项技术的可 间，可见它来源于异源融合体，而且同一块愈伤 行性与适应性。但在应用此法时，PEG的分子 组织中细胞的染色体数目也并不尽同，可能是融 量、浓度、纯度、Ca+的浓度以及H等都会影 合体在分裂过程中紫罗兰染色体逐步被排斥所造 响融合体的“质”和“量”9。另外，PEG诱导 成的。选取染色体数目在38~52条之间的愈伤组 植物原生质体聚集和融合的机理目前尚不清楚， 织块进行扩增及植株再生，得到了再生植株。对 在这种情况下，只有进行实验设计和大量重复实 再生植株其进行细胞学检测，发现有绝大多数植 验才有可能找到合适的融合条件。 株的染色体数为38条，说明紫罗兰的染色体在融 原生质体的浓度对融合效果主要表现在二源 合体中逐渐被排斥掉。 融合与多源融合的比例以及融合体的活力等方面。 本研究表明。随着原生质体的浓度增大，原生质 3讨论 体易于聚集、粘连，融合率逐渐增高，但同时多 3,J影响其落型油莱和紫罗兰原生质体融盒的ub源融合也提商并目些逐渐多干源融合森

表 4 激素对融合体培养的影响 Tab
4 Effect of p lant ho rmone on the hybreds o f pro top lasts in cu lture 激素成分 / ( m g∃ L - 1 ) horm one composition 分裂频率 /% d iv ision frequency 再生细胞团数 num ber of ce lls 再生愈伤组织数 number of ca lluses 2, 4- D 6- BA NAA KT co lon ies 1
5 1
0 0 0 10
5 + + + 1
5 0
5 0 0 11
4 + + + + 1
0 0
5 0 0 9
60 + + + 1
0 0
5 0 0
5 6
80 + + 0
5 0 1
0 0 4
20 + - 0 0 1
0 0
5 3
60 - - 1
5 0
5 0
5 0 13
8 + + + + + + 1
0 0 0 0 8
50 + + 0 1
0 0
5 0 7
50 - - 表 5 培养密度对融合体分裂的影响 Tab
5 E ffect o f different culture densities on the cell d iv ision and co lon ies fo rm ation 培养密度 / ( 10 4 ∃ mL - 1 ) density o f cu lture 第一次分裂时间 /d tim e o f first d iv ision 分裂频率 /% division frequency 植板率 /% plating effic iency 褐化情况 brow ing 2 6 3
5 0
0 无 non 5 4 9
6 3
5 无 non 10 3 13
6 5
8 无 non 20 3 16
5 3
7 较少 little 50 3 17
4 2
0 明显 obv ious 2
3 杂种的细胞学鉴定 对融合体再生的愈伤组织进行染色体观察, 发现不同继代的愈伤组织的染色体条数不同, 介 于 14~ 76条, 而湘油 15号的染色体条数为 2n= 38, 紫罗兰的染色体条数为 2n= 14, 说明愈伤组 织或是来源于同源融合, 或是来源于异源融合, 或是来源于非融合体。在检测过的愈伤组织块中, 16
7%的愈伤组织块染色体数目在 38 ~ 52 条之 间, 可见它来源于异源融合体, 而且同一块愈伤 组织中细胞的染色体数目也并不尽同, 可能是融 合体在分裂过程中紫罗兰染色体逐步被排斥所造 成的。选取染色体数目在 38~ 52条之间的愈伤组 织块进行扩增及植株再生, 得到了再生植株。对 再生植株其进行细胞学检测, 发现有绝大多数植 株的染色体数为 38条, 说明紫罗兰的染色体在融 合体中逐渐被排斥掉。 3 讨论 3
1 影响甘蓝型油菜和紫罗兰原生质体融合的 因素 本研究试用了高 C a 2+ - 高 pH 法、 PEG 法和 PEG结合高 Ca 2+ - 高 pH 法 3种不同的融合方法。 结果发现, 高 C a 2+ - 高 pH 法的融合率最低, PEG 法次之, 而 PEG结合高 Ca 2+ - 高 pH 法的融合率 最高。从目前成功的细胞融合的资料来看, 绝大 多数也都是以 PEG 与高 Ca 2+ - 高 pH 液相结合来 诱导原生质体融合为主, 这说明了此项技术的可 行性与适应性。但在应用此法时, PEG 的分子 量、浓度、纯度、 Ca 2+ 的浓度以及 pH 等都会影 响融合体的 质 ! 和 量! [ 9]。另外, PEG 诱导 植物原生质体聚集和融合的机理目前尚不清楚, 在这种情况下, 只有进行实验设计和大量重复实 验才有可能找到合适的融合条件。 原生质体的浓度对融合效果主要表现在二源 融合与多源融合的比例以及融合体的活力等方面。 本研究表明, 随着原生质体的浓度增大, 原生质 体易于聚集、粘连, 融合率逐渐增高, 但同时多 源融合率也提高, 并且比例逐渐多于二源融合率。 第 3期 林良斌, 等: 甘蓝型油菜与紫罗兰体细胞杂研究 299

300 云南农业大学学报 第23卷 因此，过高的原生质体密度并不适宜于原生质体 胞分裂素后，细胞分裂频率没有较大的提高，但 的融合。 植板率有明显的提高，这可能是生长素主要促进 3.2影响甘蓝型油菜和紫罗兰融合体培养的因素 核的有丝分裂，而细胞分裂素主要促进细胞质分 3.21培养基种类对融合体培养的影响 裂。当生长素浓度过高时，细胞自身还来不及合 融合体的培养与细胞培养相似，培养基中需 成充足的内源细胞分裂素，造成核分裂，细胞质 要含有矿质营养、碳源、氨基酸、维生素、激素 不分裂，形成多核细胞，不能发育成小愈伤组织， 以及其它多种成分。培养基的种类直接影响融合 降低了植板率。因此，在甘蓝行油菜与紫罗兰下 体的分裂频率、植板率和愈伤组织的形成等。甘 胚轴原生质体融合的融合体培养中生长素和细胞 蓝型油菜原生质体的培养和融合体的培养大多采 分裂素配合使用才对细胞分裂起最佳的效果。 用KM8p培养基、B5培养基？，而紫罗兰的原生 质体培养也采用了KM8p培养基。在对甘蓝型 [参考文献] 油菜与紫罗兰原生质体融合体培养中笔者采用了 1]YANN Z SCHA FFERNANN D,ZUR M,et al.Culti 3种基本培养基，结果发现，研究结果与前人一 vation of mproved lnes ofM ath ila ncana a source of 致，以KM8p培养基培养融合体效果最好。 -3-lnoen ic acil [A ]M onteino A.Papes of HS 3.22融合体密度对其培养的影响 Sym posium on Brassixa and Nnth Cncier Genetics 在原生质体培养中，合适的培养密度是一个 W orkshop [C].L ibon Secretariat 1994 【2]马占强，林良斌.甘蓝型油菜与紫罗兰远缘杂交亲 重要影响因素。同样，在融合体培养中也要注意 和性初探【刀.江苏农业科学，2005(1片32-33 融合体的密度，本实验过程中发现，融合体密度 [3)马占强，林良斌，董娜，等.紫罗兰下胚轴原生质 过低，融合体不启动分裂，最终全部死亡，而密 体分离条件的研究[刀.云南农业大学学报，2005 度过高，融合体易于集聚、粘连，最后融合体过 20(2):155-158 早褐化、死亡。这可能是因为密度过低，融合体 [4]KAO K L M CHAY LUCM R.A method for high fre 间不能很快分泌足够的促进细胞分裂的必要内源 quency ntergeneric fusin of plant probp asts J]. 化合物，延迟细胞的分裂启动，降低了分裂频率， Planta1974115355-367. 甚至就不发生分裂。而当融合体培养密度达到一 [5]KELLWE W A,MELCH ERS G.The effect of high pH 定程度时，产生群体效应，合成某些对进行分裂 and calcim on tobacoo leaf protoplast fus ion J].Z 所必要的内源化合物，只有当这些化合物的内生 Naurforsch 1973 28c 737-741. 浓度达到一个临界值以后细胞才能启动分裂。因 [6]KAO K N,M ICHAYLUK M R.Nutritional requirem ents 此，一定程度上的聚集有利于细胞的分裂。但培 for guow th V ca hajastana cells and protoplasts at a very 养密度过高，则易引起原生质体过度聚集、粘连， lov popu ltion density in lquid media J].Plan ta 导致细胞过早褐化、死亡，大大降低了植板率。 1975126105-110 [7]GAMBORG O L M ILLER RA.O JMA K Nutrient re 3.2.3激素对融合体培养的影响 qu irem ents of suspensin culture of soybean fots cells 为了启动和促进细胞的分裂和生长，在培养 [月.Exp CellRes196850150-158 基中有必要加入一种和几种生长调节物质。植物 [8]MURASH GE T.SKOOG E A revised m edim for rap il 细胞在培养状态下增殖对于补充生长素的需求更 gnow h and bioassays w ith tobacco tissue cultures J]. 大一些，而对于分裂素的需求不明显，这是因为 Physi bg ia P hntanm,1962 15 473-497 细胞可以部分合成分裂素，本实验中也表明这一 [9]KAOK N.Plan t protoplanst fusin and grow th of nterge 点。单独的24D就可以诱导细胞的分裂，并且 neric hybril cells J].Plant Berl )1974 120 随着浓度升高，细胞分裂频率增高。但24D浓 215-227 度过高又会抑制细胞的分裂和植板率。当加入细 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http://www.cnki.net

因此, 过高的原生质体密度并不适宜于原生质体 的融合。 3
2 影响甘蓝型油菜和紫罗兰融合体培养的因素 3
2
1 培养基种类对融合体培养的影响 融合体的培养与细胞培养相似, 培养基中需 要含有矿质营养、碳源、氨基酸、维生素、激素 以及其它多种成分。培养基的种类直接影响融合 体的分裂频率、植板率和愈伤组织的形成等。甘 蓝型油菜原生质体的培养和融合体的培养大多采 用 KM 8p培养基、B5培养基 [ 7] , 而紫罗兰的原生 质体培养也采用了 KM 8p培养基 [ 6] 。在对甘蓝型 油菜与紫罗兰原生质体融合体培养中笔者采用了 3种基本培养基, 结果发现, 研究结果与前人一 致, 以 KM 8p培养基培养融合体效果最好。 3
2
2 融合体密度对其培养的影响 在原生质体培养中, 合适的培养密度是一个 重要影响因素。同样, 在融合体培养中也要注意 融合体的密度, 本实验过程中发现, 融合体密度 过低, 融合体不启动分裂, 最终全部死亡, 而密 度过高, 融合体易于集聚、粘连, 最后融合体过 早褐化、死亡。这可能是因为密度过低, 融合体 间不能很快分泌足够的促进细胞分裂的必要内源 化合物, 延迟细胞的分裂启动, 降低了分裂频率, 甚至就不发生分裂。而当融合体培养密度达到一 定程度时, 产生群体效应, 合成某些对进行分裂 所必要的内源化合物, 只有当这些化合物的内生 浓度达到一个临界值以后细胞才能启动分裂。因 此, 一定程度上的聚集有利于细胞的分裂。但培 养密度过高, 则易引起原生质体过度聚集、粘连, 导致细胞过早褐化、死亡, 大大降低了植板率。 3
2
3 激素对融合体培养的影响 为了启动和促进细胞的分裂和生长, 在培养 基中有必要加入一种和几种生长调节物质。植物 细胞在培养状态下增殖对于补充生长素的需求更 大一些, 而对于分裂素的需求不明显, 这是因为 细胞可以部分合成分裂素, 本实验中也表明这一 点。单独的 2, 4D就可以诱导细胞的分裂, 并且 随着浓度升高, 细胞分裂频率增高。但 2, 4D浓 度过高又会抑制细胞的分裂和植板率。当加入细 胞分裂素后, 细胞分裂频率没有较大的提高, 但 植板率有明显的提高, 这可能是生长素主要促进 核的有丝分裂, 而细胞分裂素主要促进细胞质分 裂。当生长素浓度过高时, 细胞自身还来不及合 成充足的内源细胞分裂素, 造成核分裂, 细胞质 不分裂, 形成多核细胞, 不能发育成小愈伤组织, 降低了植板率。因此, 在甘蓝行油菜与紫罗兰下 胚轴原生质体融合的融合体培养中生长素和细胞 分裂素配合使用才对细胞分裂起最佳的效果。 [参考文献 ] [ 1] YANIV Z, SCHAFFERNANN D, ZUR M, et a.l . Culti vation o f improved lines o fM atth io la incana, a source o f
- 3- lino len ic ac id [ A ]. M onte iro A. Pape rs o f ISH S Sym posium on Brassix a and N inth C rucife r Genetics W orkshop [ C ]. L isbon: Secretariat, 1994. [ 2] 马占强, 林良斌. 甘蓝型油菜与紫罗兰远缘杂交亲 和性初探 [ J]. 江苏农业科学, 2005, ( 1): 32- 33. [ 3] 马占强, 林良斌, 董娜, 等. 紫罗兰下胚轴原生质 体分离条件的研究 [ J]. 云南农业大学学报, 2005, 20 ( 2): 155- 158. [ 4] KAO K L, M ICHAYLUCM R. A m ethod for high fre quency in tergeneric fusion of plant pro top lasts [ J]. Planta, 1974, 115: 355- 367. [ 5] KELLWE W A, MELCH ERS G. The effect of high pH and ca lcium on tobacco leaf pro toplast fusion [ J]. Z, Na turforsch. 1973, 28c: 737- 741. [ 6] KAO K N, M ICHAYLUK M R. Nutritiona l requirem ents for grow th V ic ia ha jastana cells and protoplasts at a very low popu lation density in liquid m edia [ J]. Plan ta, 1975, 126: 105- 110. [ 7] GAMBORG O L, M ILLER R A, O JIMA K. Nutrient re qu irem ents of suspension culture o f soybean foo ts cells [ J]. Exp. Ce ll Res, 1968, 50: 150- 158. [ 8] MURASH IGE T, SKOOG F. A revised m ed ium fo r rap id g row th and bioassays w ith tobacco tissue cultures [ J]. Phy sio log ia P lantarum, 1962, 15: 473- 497. [ 9] KAO K N. Plan t protoplanst fusion and grow th of interge neric hyb rid ce lls [ J]. Plant ( Be r.l ), 1974, 120: 215- 227. 300 云南农业大学学报 第 23卷

第3期 林良斌，等：甘蓝型油菜与紫罗兰体细胞杂研究 301 图3湘油15号原生质体 图4紫罗兰原生质体 图5融合发生于15min时 Fig.3 Protoplasts isolated Fig.4 Protoplasts isolated from Fig.5 15 min after fusion from hypocotyls of Xiangyou 15 hypocotyls of Matthiola incana 图6融合发生于20min时 图7融合发生于25min时 图8小愈伤组织 Fig.6 20 min after fusion Fig.7 25 min after fusion Fig.8 Visible colonies 35d after fusion ready for transferring to applification medium 08 图9愈伤组织的扩增 图10芽的分化 图1再生植株 Fig.9 Callus formation Fig.10 Shoots of amplification Fig.11 Regenerated plantlet from protoplasts 图12亲本湘油15号 图13亲本紫罗兰 图14再生植株的染色体(42条) Fig.12 Asceptically Fig.13 Asceptically seedling Fig.14 Chromosome of seedling of Xiangyou 15 of Matthiola incana fusion protoplasts C1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http://www.cnki.net

第 3期 林良斌, 等: 甘蓝型油菜与紫罗兰体细胞杂研究 301