在质粒提取过程中,由于机械力、酸碱度、试剂等的原因,可能使质粒DNA 链发生断裂。所以,质粒DNA琼脂塘凝胶电泳模式图分为:松弛线性的DNA 松弛开环的OC构型;超螺旋的SC构型。由于琼脂糖中加有嵌入型染料溴化乙 锭,因此,在紫外线照射下DNA电泳带成橘黄色。道中的 SC DNA走在最前沿, OC DNA则位于凝胶的最后边;道中的LDNA是经核酸内切限制酶切割质粒之 后产生的,它在凝胶中的位置介于 OC DNA和 SC DNA之间。以提取小量质粒 为例 )煮沸法 【原理】 煮沸法是根据 Holme和 Quigley(1985)的方法改进而成的。在基因工程 中,DNA分子的切割是由限制性内切酶来完成的。限制性内切酶能识别特定的 DNA序列,在一定的条件下切断双链DNA。限制性内切酶的作用效率是受多方 面因素影响的,如反应温度,缓冲体系,离子种类与浓度,DNA的纯度和甲基 化程度等。对DNA进行酶切时,首先要选择适合的缓冲液。对于单酶切,应选 用该酶的最适缓冲液;对于双酶切或三酶切,应选用一种能使所有酶都充分作用 的缓冲液。DNA的纯度对于酶切的效果的影响也很大,因为蛋白质、酚、氯仿、 SDS等杂质都会抑制限制性内切酶的活性 琼脂糖凝胶电泳是分离,鉴定和纯化DNA片段的常规方法。利用低浓度 的荧光嵌入染料溴化乙锭进行染色,可确定DNA在凝胶中的位置。如有必要, 还可以从凝胶中回收DNA条带,用于各种克隆操作。琼脂糖凝胶的分辨能力要 比聚丙烯酰胺凝胶低,但其分离范围较广。用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长 度为200bp至近50kbp的DNA。长度100kb或更大的DNA,可以通过电场方向 呈周期性变化的脉冲电场凝胶电泳进行分离。 在基因工程的常规操作中,琼脂糖凝胶电泳应用最为广泛。它通常采用水平 电泳装置,在强度和方向恒定的电场下进行电泳。DNA分子在凝胶缓冲液( 般为碱性)中带负电荷,在电场中由负极向正极迁移。DNA分子迁移的速率受 分子大小,构象。电场强度和方向,碱基组成,温度和嵌入染料等因素的影响。 【材料】 1.器材微量移液器(2oμl、200ul、1000ul),台式髙速离心机,恒温振荡 摇床,髙压蒸汽消毒器(灭菌锅),涡旋振荡器,电泳仪,琼脂糖平板电泳装置 恒温水浴锅,1.5ml塑料离心管(又称 eppendorf管,离心管架。在质粒提取过程中，由于机械力、酸碱度、试剂等的原因，可能使质粒 DNA 链发生断裂。所以，质粒 DNA 琼脂塘凝胶电泳模式图分为：松弛线性的 DNA； 松弛开环的 OC 构型；超螺旋的 SC 构型。由于琼脂糖中加有嵌入型染料溴化乙 锭，因此，在紫外线照射下 DNA 电泳带成橘黄色。道中的 SC DNA 走在最前沿， OC DNA 则位于凝胶的最后边；道中的 L DNA 是经核酸内切限制酶切割质粒之 后产生的，它在凝胶中的位置介于 OC DNA 和 SC DNA 之间。以提取小量质粒 为例。 一）煮沸法 【原理】 煮沸法是根据 Holmex 和 Quigley（1985）的方法改进而成的。在基因工程 中，DNA 分子的切割是由限制性内切酶来完成的。限制性内切酶能识别特定的 DNA 序列，在一定的条件下切断双链 DNA。限制性内切酶的作用效率是受多方 面因素影响的，如反应温度，缓冲体系，离子种类与浓度，DNA 的纯度和甲基 化程度等。对 DNA 进行酶切时，首先要选择适合的缓冲液。对于单酶切，应选 用该酶的最适缓冲液；对于双酶切或三酶切，应选用一种能使所有酶都充分作用 的缓冲液。DNA 的纯度对于酶切的效果的影响也很大，因为蛋白质、酚、氯仿、 SDS 等杂质都会抑制限制性内切酶的活性。 琼脂糖凝胶电泳是分离，鉴定和纯化 DNA 片段的常规方法。利用低浓度 的荧光嵌入染料-溴化乙锭进行染色，可确定 DNA 在凝胶中的位置。如有必要， 还可以从凝胶中回收 DNA 条带，用于各种克隆操作。琼脂糖凝胶的分辨能力要 比聚丙烯酰胺凝胶低，但其分离范围较广。用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长 度为 200bp 至近 50kbp 的 DNA。长度 100kb 或更大的 DNA，可以通过电场方向 呈周期性变化的脉冲电场凝胶电泳进行分离。 在基因工程的常规操作中，琼脂糖凝胶电泳应用最为广泛。它通常采用水平 电泳装置，在强度和方向恒定的电场下进行电泳。DNA 分子在凝胶缓冲液（一 般为碱性）中带负电荷，在电场中由负极向正极迁移。DNA 分子迁移的速率受 分子大小，构象。电场强度和方向，碱基组成，温度和嵌入染料等因素的影响。 【材料】 1. 器材 微量移液器（20μl、200μl、1000μl），台式高速离心机，恒温振荡 摇床，高压蒸汽消毒器（灭菌锅），涡旋振荡器，电泳仪，琼脂糖平板电泳装置， 恒温水浴锅，1.5ml 塑料离心管（又称 eppendorf 管），离心管架