2.菌种含卡那酶素的E. coli dh5a 3.试剂LB培养基,氨苄青霉素母液,溶菌酶溶液,3 mol naAc(pH5.2), 溶液Ⅰ,溶液Ⅱ,溶液Ⅲ,RNA酶,A母液,饱和酚,氯仿,70%乙醇,无水 乙醇,异丙醇,T缓冲液,STET,STE,TBE缓冲液(5×),上样缓冲液(6 ),1%琼脂糖凝胶,DNA标准分子量标记物,溴化乙锭。 【方法】 1.细菌的培养和收集:将含有质粒菌种接种在LB固体培养基(含50ug/ml Amp)中,37℃培养12-24h。用无菌牙签挑取单菌落接种到5mLB液体培养基 (含50 ug/ml Kan)中,37℃振荡培养约12h至对数生长后期。 2.裂解细菌 (1)无菌操作台上取1.5ml培养菌体置于离心管( Eppendorf管)中,微量 离心机上10000pm离心lmin,或者以4000pm离心5~10min,弃上清液,倒 扣于干净的吸水纸上吸干。 (2)将菌体沉淀悬浮于350μSTET缓冲溶液中,涡旋使其混匀。 (3)加入25山新配制的溶菌酶溶液(l0mg/m,用10 mmol/ Tris-CI(pH8.0) 配制),涡旋振荡大概3s。 (4)将 eppendorf管放入沸水浴中,40s后立即取出 (5)微量离心机上以4℃,12000mp离心10min。用无菌牙签从 eppendorf 管中挑去细菌碎片。 (6)在上清液中加入40μ5mol乙酸钠(pH5.2)和420山l异丙醇,振荡 混匀,于室温放置5min。 (7)微量离心机上以4℃,12000mp离心5min,回收核酸沉淀。小心吸 去上清液,将离心管倒置于一张纸巾上,以使所有液体流出。再将附于管壁的液 滴除尽。 (8)加入1m70%乙醇,以4℃,12000rmp离心2min。轻轻地吸去上清 液,这一步操作要格外小心,有时沉淀块贴壁不紧,去除管壁上形成的所有乙醇 液滴,室温下放置,直至乙醇挥发完全,管内无可见的液体为止(大概需要 2~5min)。 (9)用50l无DNA酶的胰RNA酶(2oμg/ml)的TE(pH8:0)溶解核酸, 稍加振荡即可,贮存于-20℃ 3.分离和纯化质粒DNA2. 菌种 含卡那酶素的 E. coli DH5α。 3. 试剂 LB 培养基，氨苄青霉素母液，溶菌酶溶液，3mol/l NaAc (pH5.2)， 溶液Ⅰ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ，RNA 酶，A 母液，饱和酚，氯仿，70%乙醇，无水 乙醇，异丙醇，TE 缓冲液，STET，STE，TBE 缓冲液 (5×)，上样缓冲液（6 ×），1%琼脂糖凝胶，DNA 标准分子量标记物，溴化乙锭。 【方法】 1. 细菌的培养和收集 ：将含有质粒菌种接种在 LB 固体培养基（含 50μg/ml Amp）中，37℃培养 12~24h。用无菌牙签挑取单菌落接种到 5ml LB 液体培养基 （含 50μg/ml Kan）中，37℃振荡培养约 12h 至对数生长后期。 2. 裂解细菌 （1）无菌操作台上取 1.5ml 培养菌体置于离心管（Eppendorf 管）中，微量 离心机上 10 000rpm 离心 1min，或者以 4000rpm 离心 5~10min，弃上清液，倒 扣于干净的吸水纸上吸干。 （2）将菌体沉淀悬浮于 350μl STET 缓冲溶液中，涡旋使其混匀。 （3）加入 25μl 新配制的溶菌酶溶液（10mg/ml，用 10mmol/L Tris-Cl（pH8.0） 配制），涡旋振荡大概 3s。 （4）将 eppendorf 管放入沸水浴中，40s 后立即取出。 （5）微量离心机上以 4℃，12 000rmp 离心 10min。用无菌牙签从 eppendorf 管中挑去细菌碎片。 （6）在上清液中加入 40μl 5mol/L 乙酸钠（pH5.2）和 420μl 异丙醇，振荡 混匀，于室温放置５min。 （7）微量离心机上以 4℃，12 000rmp 离心 5min，回收核酸沉淀。小心吸 去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。再将附于管壁的液 滴除尽。 （8）加入 1ml 70％乙醇，以 4℃，12 000rmp 离心 2min。轻轻地吸去上清 液，这一步操作要格外小心，有时沉淀块贴壁不紧，去除管壁上形成的所有乙醇 液滴，室温下放置，直至乙醇挥发完全，管内无可见的液体为止（大概需要 2~5min）。 （9）用 50μl 无 DNA 酶的胰 RNA 酶（20μg/ml）的 TE（pH8.0）溶解核酸， 稍加振荡即可，贮存于-20℃。 3. 分离和纯化质粒 DNA