(1)配制1%琼脂糖凝胶。取250ml三角瓶,加入100 ml tBe缓冲液,称 取lg琼脂糖加入缓冲液中,沸水浴加热至完全溶解,然后在55℃水浴中保温 在灌胶模具中插入梳齿,将稍微冷却的凝胶倒λ灌胶模具。凝胶厚度3~5mm, 避免气泡产生。 (2)室温放置30~45min,待凝胶完全凝固后,按照厂家说明将凝胶放入水 平板电泳槽。 (3)在电泳槽中加入电泳缓冲液,电泳缓冲液没过胶面1mm,拔下梳齿形 成样品池。 (4)取样品与6×样品缓冲液按照比例混合后,用微量移液器缓慢加入样 品池中。 (5)盖上电泳槽并且通电,注意电源正负极,确保样品向阳极移动。恒压 l~-sv/cm(按照两极之间距离计算),至示踪染料溴酚蓝前沿距离凝胶前端lcm 时,切断电源 (6)从电泳槽中取出凝胶,将凝胶置于0.5ugml溴化乙啶水溶液中,室温 下振摇染色30~45mn (7)回收染色液,自来水冲洗凝胶后,于紫外灯下观察。 【注意事项】 1.大肠杆菌可从固体培养基上挑取单个菌落直接进行煮沸法提取质粒 DNA。 添加溶菌酶一定要有限度,浓度过髙细菌裂解效果反而不好,有时不同 溶菌酶也能溶菌。提取的质粒DNA中会含有RNA,但RNA并不干扰进一步实 验,如限制性内切酶消化,亚克隆及连接反应等。试验步骤中的细菌沉淀和核酸 沉淀中去除上清液时,一定要除尽 3.用π0%的乙醇溶液洗涤核酸沉淀时一定要十分谨慎,防止将核酸同洗液 起倒掉。实验过程中所用的器皿和吸头都要进行高压灭菌。 4!.当从表达内切核酸酶A的大肠杆菌株(endA株,如HBl01)中小量制 粒DNA时,建议不用煮沸法。因为煮沸步骤不能完全灭活内切核酸酶A,在 Mg2存在下温育(V中用限制酶时)质粒DNA可被降解。若要避免这一问题 可以在用70%乙醇洗涤一步前增加一步用酚/氯仿进行抽提。 5.如果要通过限酶切割反应来分析DNA,可取1 HI dNA溶液加到另一个含 8μl水的微量离心管内,加lu10×限制酶缓冲液和1单位所需限制酶,在适宜（1）配制 1%琼脂糖凝胶。取 250ml 三角瓶，加入 100ml TBE 缓冲液，称 取 1g 琼脂糖加入缓冲液中，沸水浴加热至完全溶解，然后在 55℃水浴中保温。 在灌胶模具中插入梳齿，将稍微冷却的凝胶倒入灌胶模具。凝胶厚度 3~5mm， 避免气泡产生。 （2）室温放置 30~45min，待凝胶完全凝固后，按照厂家说明将凝胶放入水 平板电泳槽。 （3）在电泳槽中加入电泳缓冲液，电泳缓冲液没过胶面 1mm，拔下梳齿形 成样品池。 （4）取样品与 6×样品缓冲液按照比例混合后，用微量移液器缓慢加入样 品池中。 （5）盖上电泳槽并且通电，注意电源正负极，确保样品向阳极移动。恒压 1~5V/cm（按照两极之间距离计算），至示踪染料溴酚蓝前沿距离凝胶前端 1cm 时，切断电源。 （6）从电泳槽中取出凝胶，将凝胶置于 0.5ug/ml 溴化乙啶水溶液中，室温 下振摇染色 30~45min。 （7）回收染色液，自来水冲洗凝胶后，于紫外灯下观察。 【注意事项】 1. 大肠杆菌可从固体培养基上挑取单个菌落直接进行煮沸法提取质粒 DNA。 2. 添加溶菌酶一定要有限度，浓度过高细菌裂解效果反而不好，有时不同 溶菌酶也能溶菌。提取的质粒 DNA 中会含有 RNA，但 RNA 并不干扰进一步实 验，如限制性内切酶消化，亚克隆及连接反应等。试验步骤中的细菌沉淀和核酸 沉淀中去除上清液时，一定要除尽。 3. 用 70%的乙醇溶液洗涤核酸沉淀时一定要十分谨慎，防止将核酸同洗液 一起倒掉。 实验过程中所用的器皿和吸头都要进行高压灭菌。 4. 当从表达内切核酸酶 A 的大肠杆菌株（endA+株，如 HB101）中小量制 粒 DNA 时，建议不用煮沸法。因为煮沸步骤不能完全灭活内切核酸酶Ａ，在 Mg2+存在下温育（V 中用限制酶时）质粒 DNA 可被降解。 若要避免这一问题 可以在用 70%乙醇洗涤一步前增加一步用酚/氯仿进行抽提。 5. 如果要通过限酶切割反应来分析 DNA，可取 1μl DNA 溶液加到另一个含 8μl 水的微量离心管内，加 1μl 10×限制酶缓冲液和１单位所需限制酶，在适宜