峰所在的管,即可得到纯化的酶。用洗脱液一直洗即可使柱再生。 凝胶层析过程是溶质分子在流动的溶剂相和多孔胶粒构成的固定相的内部孔隙间进行扩散 分配的过程。分配系数Kav可简单地从以下公式得出:Kav=(ve-Voy(Vt-Vo),式中Ve=从柱 上洗脱下溶质需溶剂的体积,V=外水体积,Ⅴt=柱床的总体积 经验表明,Kav值与分子量的对数成反比。凝胶层析除可用于分离分子量不同的蛋白质分子 外,还可用来测定蛋白质分子的分子量。先用若干种已知分子量的蛋白质分别测出其Kav值 以分子量的对数为纵坐标,以Kav值(或简单地以洗脱体积)为横坐标,作出标准曲线,再测 出未知分子量蛋白质的Kav值(或洗脱体积),在曲线上可查出其分子量的对数。 Sephadex有不同的型号,如 Sephadex G-100, Sephadex G25等。 Sephacryl是交联的烯丙基 葡聚糖和N,N′一甲叉双丙烯酰胺共聚物,如 Sephacryl S-100,S-200,S-30,S-400S-500,.-1000 等,后面的数字越大则孔隙度越大。 近年来,除了上述 Sephadex和 Sephacryl外,还有许多种材料用作凝胶层析的基质,如聚丙 烯酰胺( Bio gel P系列)、琼脂糖( Sepharose2B,4B,6B和 Bio gelA系列)交联琼脂糖( Sepharose CL-2B,CL-4B,CL-6B)、聚苯乙烯、琼脂糖一聚丙烯酰胺混合物、多孔玻璃和聚甲基丙烯酸甲 酯等。(同样是数字越大孔隙度越大)。一般来说,新产品的性能比老产品好 3.344疏水层析 Shaltiel等人在1972年发现溴化氰活化的琼脂糖凝胶被碳链长短不同的烃类衍生物取代后 可选择性地吸附某些酶。进一步的研究表明,这种选择性的吸附作用是琼脂糖凝胶介质与酶之间 的疏水力作用的结果。酶分子的表面既有亲水性的基团或区域,也有非极性的疏水基团(如亮氨 酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸)或区域。疏水基团或区域可在酶分子的表面,也可处于亲水 区域包围之中,形成疏水性的小孔或袋。在一定的条件下,琼脂糖凝胶上的疏水基团可以和酶分 子表面或孔袋中的疏水基团发生疏水相互作用,使酶分子吸附到凝胶上。用能减弱疏水相互作用 的洗脱液洗脱,就能把疏水相互作用强弱不等的物质依次洗脱下来。用尿素或乙醇、丁醇洗即可 再生。 目前常用的三种疏水层析介质是 Butyl- Sepharose CL4B、 Phenyl-Sepharose CL-4B和 Octyl- Sepharose CL-4B。三者中, Butyl-Sepharose CL-4B的疏水作用力最弱,octy- Sepharose CL-4B的疏水作用力最强。一般在不了解目标酶的疏水性能时,先试用疏水作用力较小的介质8 峰所在的管，即可得到纯化的酶。用洗脱液一直洗即可使柱再生。 凝胶层析过程是溶质分子在流动的溶剂相和多孔胶粒构成的固定相的内部孔隙间进行扩散 分配的过程。分配系数 Kav 可简单地从以下公式得出：Kav＝(Ve－Vo)/(Vt－Vo)，式中 Ve＝从柱 上洗脱下溶质需溶剂的体积，Vo＝外水体积，Vt＝柱床的总体积。 经验表明，Kav 值与分子量的对数成反比。凝胶层析除可用于分离分子量不同的蛋白质分子 外，还可用来测定蛋白质分子的分子量。先用若干种已知分子量的蛋白质分别测出其 Kav 值， 以分子量的对数为纵坐标，以 Kav 值（或简单地以洗脱体积）为横坐标，作出标准曲线，再测 出未知分子量蛋白质的 Kav 值（或洗脱体积），在曲线上可查出其分子量的对数。 Sephadex 有不同的型号，如 Sephadex G-100，Sephadex G-25 等。Sephacryl 是交联的烯丙基 葡聚糖和 N,N＇－甲叉双丙烯酰胺共聚物，如 Sephacryl S-100, S-200, S-300, S-400, S-500, S-1000 等，后面的数字越大则孔隙度越大。 近年来，除了上述 Sephadex 和 Sephacryl 外，还有许多种材料用作凝胶层析的基质，如聚丙 烯酰胺（Bio Gel P 系列）、琼脂糖（Sepharose 2B，4B，6B 和 Bio Gel A 系列）、交联琼脂糖（Sepharose CL-2B，CL-4B，CL-6B）、聚苯乙烯、琼脂糖—聚丙烯酰胺混合物、多孔玻璃和聚甲基丙烯酸甲 酯等。（同样是数字越大孔隙度越大）。一般来说，新产品的性能比老产品好。 3.3.4.4 疏水层析： Shaltiel 等人在 1972 年发现溴化氰活化的琼脂糖凝胶被碳链长短不同的烃类衍生物取代后， 可选择性地吸附某些酶。进一步的研究表明，这种选择性的吸附作用是琼脂糖凝胶介质与酶之间 的疏水力作用的结果。酶分子的表面既有亲水性的基团或区域，也有非极性的疏水基团(如亮氨 酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸)或区域。疏水基团或区域可在酶分子的表面，也可处于亲水 区域包围之中，形成疏水性的小孔或袋。在一定的条件下，琼脂糖凝胶上的疏水基团可以和酶分 子表面或孔袋中的疏水基团发生疏水相互作用，使酶分子吸附到凝胶上。用能减弱疏水相互作用 的洗脱液洗脱，就能把疏水相互作用强弱不等的物质依次洗脱下来。用尿素或乙醇、丁醇洗即可 再生。 目 前 常 用 的 三 种 疏 水 层 析 介 质 是 Butyl-Sepharose CL-4B 、 Phenyl-Sepharose CL-4B 和 Octyl-Sepharose CL-4B。三者中，Butyl-Sepharose CL-4B 的疏水作用力最弱，Octyl-Sepharose CL-4B 的疏水作用力最强。一般在不了解目标酶的疏水性能时，先试用疏水作用力较小的介质