第3期 崔红米，等：外源GR24对不结球白菜腋芽生长的影响 367 和矮牵牛等多分蘖/分枝突变体的研究中[4。研究表明，低浓度的GR24能够使独脚金内酯合成缺失突 变体恢复其野生型的表型，对于独脚金内酯信号途径缺失突变体却没有作用4川。同时，一定浓度的 GR24能够抑制野生型植株分蘖/分枝的生长1-1)。例如，100 nmol.L的GR24严重抑制豌豆SLs合成缺 失突变体ccd8腋芽的生长，对豌豆SLs信号途径缺失突变体ms4的腋芽生长却没有作用[)；1molL 的GR24能够完全抑制水稻SLs合成缺失突变体d10和dI7的生长，而对水稻SLs信号途径缺失突变体 d3却没有作用：低浓度的GR24(1molL)不能影响野生型水稻分蘖芽的生长，而高浓度的GR24 (10μmolL)能够明显抑制野生型水稻分蘖芽的生长。 不结球白菜(Brassica campestris ssp..chinensis Makino)是十字花科芸墓属植物，俗称青菜、小白菜、油菜 (北方)[，在中国南方栽培广泛。不结球白菜的大部分品种不分蘖/分枝，但也有少数品种呈分蘖/分枝 状，如如皋毛莱'和南通马耳头'。分蘖/分枝影响不结球白莱的株型，进而影响其产量和品质等重 要农艺性状。研究表明：分蘖/分枝的形成仅受基因型的控制，而分蘖/分枝的生长发育受到基因、环境和 激素的共同调控，这些因素之间相互作用形成复杂的调控网络，共同调控腋芽的生长%。生长素通过顶 端优势的作用间接抑制分蘖/分枝，细胞分裂素和独脚金内酯分别直接促进和抑制分蘖/分枝)。BRC1/ TB1被认为是作为植物激素与环境信号互作的集成器来调控植物分枝发育，它编码TCP家族转录因子， 在腋芽特异表达，其功能缺失突变体会产生更多的分枝[6。MAX2是独脚金内脂响应途径上的基因，位 于BRC1/TB1的下游，外源独脚金内酯类似物不能恢复其突变体的表型[1⑧。水稻中LOG能够编码一种新 的细胞分裂素激活酶，能够催化细胞分裂素合成途径的最后一步9。拟南芥sps突变体分枝数大大增加， 细胞分裂素含量是野生型植株的3~9倍，这说明SPS可能通过控制腋芽形成部位的细胞分裂素含量来抑 制腋芽的生长[2o。SPL9抑制新叶的形成，spl9突变体分蘖/分枝数大大增加2m。 不结球白菜分蘖/分枝的研究目前还处于起步阶段。因此，本研究采用不同浓度的外源GR24处理不 结球白菜如皋毛菜'，调查其腋芽生长的动态变化，检测叶腋处细胞分裂素(Z+ZR)、生长素(IAA)含量 和分蘖/分枝相关基因的表达量，以探究外源GR24对不结球白菜分蘖/分枝生长的影响机制，为激素调控 不结球白菜分蘖/分枝生长的机制提供依据。 1材料与方法 1.1材料与外源GR24处理 不结球白菜(Brassica campestris ssp.chinensis Makino)品种如皋毛菜'为南京农业大学白菜课题组保 存材料。试验所用试剂GR24,购于北京大秦兴业科技有限公司。其余试剂均为分析纯。 不结球白菜播种穴盘，待4~5片真叶长出时，选取生长一致的幼苗，移栽到MS营养液中，气泵间断性 通气，每周换1次营养液：11~12片真叶长出时，部分腋芽开始生长，将配好的一定量的GR24母液加入到 MS营养液中(GR24母液先用少量的丙酮溶解后再用蒸馏水定容[)，使其终浓度分别为0、1.5和4.5 μmolL1,对照加入与处理等量的丙酮。分别于GR24处理后0、3、6、12、24、36和48h取腋芽（腋芽长度 大于0.2cm)及腋芽周围2mm的植物组织，用于RNA提取（约0.1g)和激素含量的测定（约1.0g), -70℃保存备用。分别于处理后0、3、6、9、12和15d测量‘如皋毛菜'从外到里每个叶片叶腋处腋芽的长 度，并统计活动芽数和活动芽总长度。每个处理3次重复。 1.2激素含量的测定 叶腋处的Z+ZR和IAA含量参照刘旭2)的方法并适当改动。将样品(1.00g左右)放到预冷的研钵 中，加入5mL预冷的50%甲醇溶液（体积分数），冰浴研磨成浆：4℃下浸提12h,10000r·min离心10 min,取上清液保存于4℃冰箱中：残渣加入预冷的50%甲醇溶液3mL重复浸提2次，间隔12h,离心同 上，收集合并全部浸提液；向提取液中加入0.2 g PVPP吸附酚类物质及色素，在摇床上4℃振荡60min, 摇匀，离心同上；将上清液缓慢过C8小柱，流出液倒入50mL小烧杯中进行冷冻干燥；冻干样品用2.5mL 预冷的50%甲醇溶液溶解，过0.22μm的有机系超微滤膜，用于测定激素含量。超高效液相色谱(UPLC) 仪为Agilent1290 nfinity系统，色谱条件为：流动相为0.6%乙酸（体积分数）和色谱级甲醇梯度洗脱（表 1),柱温35℃，进样量2μL,流速0.3mL·min1,检测波长为254nm。 1.3RNA的提取和荧光定量PCR引物的设计 叶腋处RNA的具体提取方法参照植物RNA提取试剂盒说明书(TianGen公司)。按照PrimeScript RT ?1994-2016 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http://www.cnki.net第 3 期 崔红米，等: 外源 GＲ24 对不结球白菜腋芽生长的影响 和矮牵牛等多分蘖/分枝突变体的研究中［4－6］。研究表明，低浓度的 GＲ24 能够使独脚金内酯合成缺失突 变体恢复其野生型的表型，对于独脚金内酯信号途径缺失突变体却没有作用［4－11］。同时，一定浓度的 GＲ24 能够抑制野生型植株分蘖/分枝的生长［11－13］。例如，100 nmol·L－1 的 GＲ24 严重抑制豌豆 SLs 合成缺 失突变体 ccd8 腋芽的生长，对豌豆 SLs 信号途径缺失突变体 rms4 的腋芽生长却没有作用［7］; 1 μmol·L－1 的 GＲ24 能够完全抑制水稻 SLs 合成缺失突变体 d10 和 d17 的生长，而对水稻 SLs 信号途径缺失突变体 d3 却没有作用［11］; 低浓度的 GＲ24( 1 μmol·L－1 ) 不能影响野生型水稻分蘖芽的生长，而高浓度的 GＲ24 ( 10 μmol·L－1 ) 能够明显抑制野生型水稻分蘖芽的生长［11］。 不结球白菜( Brassica campestris ssp. chinensis Makino) 是十字花科芸薹属植物，俗称青菜、小白菜、油菜 ( 北方) ［14］，在中国南方栽培广泛。不结球白菜的大部分品种不分蘖/分枝，但也有少数品种呈分蘖/分枝 状，如‘如皋毛菜’和‘南通马耳头’［15］。分蘖/分枝影响不结球白菜的株型，进而影响其产量和品质等重 要农艺性状。研究表明: 分蘖/分枝的形成仅受基因型的控制，而分蘖/分枝的生长发育受到基因、环境和 激素的共同调控，这些因素之间相互作用形成复杂的调控网络，共同调控腋芽的生长［16］。生长素通过顶 端优势的作用间接抑制分蘖/分枝，细胞分裂素和独脚金内酯分别直接促进和抑制分蘖/分枝［17］。BＲC1 / TB1 被认为是作为植物激素与环境信号互作的集成器来调控植物分枝发育，它编码 TCP 家族转录因子， 在腋芽特异表达，其功能缺失突变体会产生更多的分枝［16］。MAX2 是独脚金内脂响应途径上的基因，位 于 BＲC1 /TB1 的下游，外源独脚金内酯类似物不能恢复其突变体的表型［18］。水稻中 LOG 能够编码一种新 的细胞分裂素激活酶，能够催化细胞分裂素合成途径的最后一步［19］。拟南芥 sps 突变体分枝数大大增加， 细胞分裂素含量是野生型植株的 3 ～ 9 倍，这说明 SPS 可能通过控制腋芽形成部位的细胞分裂素含量来抑 制腋芽的生长［20］。SPL9 抑制新叶的形成，spl9 突变体分蘖/分枝数大大增加［21］。 不结球白菜分蘖/分枝的研究目前还处于起步阶段。因此，本研究采用不同浓度的外源 GＲ24 处理不 结球白菜‘如皋毛菜’，调查其腋芽生长的动态变化，检测叶腋处细胞分裂素( Z+ZＲ) 、生长素( IAA) 含量 和分蘖/分枝相关基因的表达量，以探究外源 GＲ24 对不结球白菜分蘖/分枝生长的影响机制，为激素调控 不结球白菜分蘖/分枝生长的机制提供依据。 1 材料与方法 1．1 材料与外源 GＲ24 处理 不结球白菜( Brassica campestris ssp. chinensis Makino) 品种‘如皋毛菜’为南京农业大学白菜课题组保 存材料。试验所用试剂 GＲ24，购于北京大秦兴业科技有限公司。其余试剂均为分析纯。 不结球白菜播种穴盘，待 4 ～ 5 片真叶长出时，选取生长一致的幼苗，移栽到 MS 营养液中，气泵间断性 通气，每周换 1 次营养液; 11 ～ 12 片真叶长出时，部分腋芽开始生长，将配好的一定量的 GＲ24 母液加入到 MS 营养液中( GＲ24 母液先用少量的丙酮溶解后再用蒸馏水定容［22］) ，使其终浓度分别为 0、1．5 和 4．5 μmol·L－1 ，对照加入与处理等量的丙酮。分别于 GＲ24 处理后 0、3、6、12、24、36 和 48 h 取腋芽( 腋芽长度 大于 0．2 cm) 及腋芽周围 2 mm 的植物组织，用于 ＲNA 提取( 约 0． 1 g) 和激素含量的测定( 约 1． 0 g) ， －70 ℃保存备用。分别于处理后 0、3、6、9、12 和 15 d 测量‘如皋毛菜’从外到里每个叶片叶腋处腋芽的长 度，并统计活动芽数和活动芽总长度。每个处理 3 次重复。 1．2 激素含量的测定 叶腋处的 Z+ZＲ 和 IAA 含量参照刘旭［23］的方法并适当改动。将样品( 1．00 g 左右) 放到预冷的研钵 中，加入 5 mL 预冷的 50%甲醇溶液( 体积分数) ，冰浴研磨成浆; 4 ℃ 下浸提 12 h，10 000 r·min－1 离心 10 min，取上清液保存于 4 ℃冰箱中; 残渣加入预冷的 50%甲醇溶液 3 mL 重复浸提 2 次，间隔 12 h，离心同 上，收集合并全部浸提液; 向提取液中加入 0．2 g PVPP 吸附酚类物质及色素，在摇床上 4 ℃ 振荡 60 min， 摇匀，离心同上; 将上清液缓慢过 C18小柱，流出液倒入 50 mL 小烧杯中进行冷冻干燥; 冻干样品用 2．5 mL 预冷的 50%甲醇溶液溶解，过 0．22 μm 的有机系超微滤膜，用于测定激素含量。超高效液相色谱( UPLC) 仪为 Agilent 1290 Infinity 系统，色谱条件为: 流动相为 0．6%乙酸( 体积分数) 和色谱级甲醇梯度洗脱( 表 1) ，柱温 35 ℃，进样量 2 μL，流速 0．3 mL·min－1 ，检测波长为 254 nm。 1．3 ＲNA 的提取和荧光定量 PCＲ 引物的设计 叶腋处 ＲNA 的具体提取方法参照植物 ＲNA 提取试剂盒说明书( TianGen 公司) 。按照 PrimeScript ＲT 763