张瑛等:TRPV1:一种同时参与慢性痛外周敏化和疼痛中枢调制的重要分子 679 敏化是TRPV通道最显著的功能特征之 共定位。他们的研究显示,PKD12在DRG小 也是热痛觉敏化形成的关键因素,其形成可归因于直径肽能和非肽能神经元以及中大直径神经元中有 转录和转录后水平的调控,其中磷酸化修饰是着广泛的分布,其中PKD1/2阳性神经元中约有 TRPVI最为重要的一种转录后调控机制。有文献相30%~40%同时为TRPV1阳性,并且在组织损伤或 继报道了蛋白激酶A( protein kinase A,PKA、蛋炎症过程中,蛋白酶活化受体2( protease-activated 白激酶C( protein kinase C,PKC)2、磷脂酰肌醇-3 receptor2,PAR2)激活可促进PKD/2膜定位的增多。 激酶( phosphatidylinositol-3 -kinase,P3K)2和Ca2/该研究为PKD/2调控TRPV功能并参与炎症热 钙调素依赖型蛋白激酶Ⅱ(Ca/ calmodulin-depen-痛敏的形成提供了进一步的依据 dent protein kinase, CaMKII)等对TPRV1的磷 除PKD1外,我们还发现另外一种在神经系统 酸化及在其功能敏化中的作用。本研究组前期在稳高表达的蛋白激酶Cdks( cyclin- dependnet kinase5) 定表达TRPV的CHO细胞进行的免疫共沉淀研究参与炎症热痛觉敏化,TRPⅤ1是其作用靶点之 显示,TRPV可以和PKCμ即蛋白激酶Dl( protein与Cdk家族的其它成员不同,Cdk5的激活不依赖 kinase di,PKDl)形成复合物,而未检测到TRPV于周期素( cyclin),而有其独特的激活子p35和p39 与其他PKC亚型直接的相互作用的。因此,本研(或其降解产物p25和p29)。我们以及国外一研究 究组最终将目标锁定在PKD1上。PKD1最初被归组最先报道了Cdk5参与炎症热痛敏的作用到 为PKC家族,称为非典型ⅣKC亚型。但由于其在在CFA诱导炎症痛模型鼠中,外周DRG和脊髓背 激酶特性和蛋白结构上与PKC差异显著,而在底角Cdk5有显著激活,经鞘内注射过表达Cdk5可 物特异上与CaMK家族保持较高的相似性,因此明显加重炎症痛模型鼠热痛敏行为,而过表达负显 PKD1最终被归为CaMK家族。我们的研究结果性突变的Cdk5( dominant negative Cdk5,D144N-Cdk5) 显示,PKD不仅可以与TRPV氨基端发生结合,或给予Cdk5的抑制剂 roscovitine可减轻热痛敏 还可以直接对其S116进行磷酸化,并且这种磷酸行为 化作用显著増加了 TRPVI对辣椒素刺激的反应在随后对Cdk5调控炎症热痛敏的靶点寻找上, 性。该研究为当时尚处空白的PKD1生理功能研国外研究组抢先报道了Cdk5对TRPV1-1407(此为 究提供了重要依据,也为我们今后探讨在体情况下,小鼠序列,对应大鼠序列为T406)的磷酸化作用 PKDI对TRPV1的功能调控及其在炎症热痛敏中的考虑到 TRPVI作为一种膜受体发挥功能,而当时 可能作用奠定了基础 尚未见关于 TRPVI膜转运机制的相关报道,我们 我们随后的研究工作表明,在足底注射完全弗转而研究 TRPVI的膜转运机制及Cdk5在其中可能 佐剂( complete Freund' s adjuvant,CFA)诱导的大发挥的调控作用。我们的工作首次证明动力蛋 鼠炎症痛模型中,通过鞘内注射使DRG神经元过白——驱动蛋白样蛋白13B( kinesin- clike protein 表达PKD1能显著加重大鼠热痛敏行为,而过表达13B,KIF13B)参与TRPV膜转运,并且Cdk5可 负显性突变的PKDl( dominant negative PKd1,D727A-磷酸化KIF13B的FHA结构域( forkhead- associated PKD1)或注射PKDl反义寡核苷酸则可以起到缓解 domain)T506,促进TRPV1与KIF13B的结合以及 热痛敏行为的作用,同时对机械痛敏没有影响。在TRPV1的膜表达。在此基础上,我们还利用Tat 炎症痛模型鼠的DRG神经元中,可以观察到PKD( trans- activating transcriptional activator)技术构建了 膜定位的增多及其与TRPV的共定位,同时生化穿膜肽Tat-KIF13B-T506。Tat是人类I型免疫缺陷 检测可发现二者的相互结合。在急性分离的DRG病毒的一种转录激活蛋白,它是一段富含碱性氨基 神经元中的研究显示,当增强PKDI活性时,酸(主要为精氨酸和赖氨酸)的短肽,长度为9~1l TRPⅤⅠ的膜表达增多,辣椒素诱发的电流幅度增个氨基酸残基不等。Tat具有很强的细胞穿透性, 大叼。该研究首次揭示了在体情况下“PKD1-温度适应性很广,能负载包括小分子物质、核酸、 TRPV1”之间的相互作用及其促进炎症热痛敏行为肽和蛋白质在内的各种形式及分子量的物质进入细 产生的效应,也是首次在整体动物水平阐明PKD1胞内,并且不影响后者的功能。通过 Tat-KIE13B- 在神经系统中的功能。随后, Amadesi等人的研究T506特异性干扰KF13B在T506位点的磷酸化, 进一步验证了PKD1和TRPⅤ1在DRG神经元中的可显著减少TRPV的膜表达,降低细胞对辣椒素张 瑛等：TRPV1：一种同时参与慢性痛外周敏化和疼痛中枢调制的重要分子 679 敏化是 TRPV1 通道最显著的功能特征之一， 也是热痛觉敏化形成的关键因素，其形成可归因于 转录和转录后水平的调控，其中磷酸化修饰是 TRPV1 最为重要的一种转录后调控机制。有文献相 继报道了蛋白激酶 A (protein kinase A, PKA)[21]、蛋 白激酶 C (protein kinase C, PKC)[22]、磷脂酰肌醇 -3 激 酶 (phosphatidylinositol-3-kinase, PI3K)[23] 和 Ca2+/ 钙调素依赖型蛋白激酶 II (Ca2+/calmodulin-depen￾dent protein kinase II, CaMKII)[24] 等 对 TPRV1 的 磷 酸化及在其功能敏化中的作用。本研究组前期在稳 定表达 TRPV1 的 CHO 细胞进行的免疫共沉淀研究 显示，TRPV1 可以和 PKCµ 即蛋白激酶 D1 (protein kinase D1, PKD1) 形成复合物，而未检测到 TRPV1 与其他 PKC 亚型直接的相互作用 [25]。因此，本研 究组最终将目标锁定在 PKD1 上。PKD1 最初被归 为 PKC 家族，称为非典型 PKC 亚型。但由于其在 激酶特性和蛋白结构上与 PKC 差异显著，而在底 物特异上与 CaMK 家族保持较高的相似性，因此 PKD1 最终被归为 CaMK 家族 [26]。我们的研究结果 显示，PKD1 不仅可以与 TRPV1 氨基端发生结合， 还可以直接对其 S116 进行磷酸化，并且这种磷酸 化作用显著增加了 TRPV1 对辣椒素刺激的反应 性 [25]。该研究为当时尚处空白的 PKD1 生理功能研 究提供了重要依据，也为我们今后探讨在体情况下， PKD1 对 TRPV1 的功能调控及其在炎症热痛敏中的 可能作用奠定了基础。 我们随后的研究工作表明，在足底注射完全弗 氏佐剂 (complete Freund’s adjuvant, CFA) 诱导的大 鼠炎症痛模型中，通过鞘内注射使 DRG 神经元过 表达 PKD1 能显著加重大鼠热痛敏行为，而过表达 负显性突变的 PKD1 (dominant negative PKD1, D727A￾PKD1) 或注射 PKD1 反义寡核苷酸则可以起到缓解 热痛敏行为的作用，同时对机械痛敏没有影响。在 炎症痛模型鼠的 DRG 神经元中，可以观察到 PKD1 膜定位的增多及其与 TRPV1 的共定位，同时生化 检测可发现二者的相互结合。在急性分离的 DRG 神 经 元 中 的 研 究 显 示， 当 增 强 PKD1 活 性 时， TRPV1 的膜表达增多，辣椒素诱发的电流幅度增 大 [27]。 该 研 究 首 次 揭示 了 在 体 情 况 下“PKD1- TRPV1”之间的相互作用及其促进炎症热痛敏行为 产生的效应，也是首次在整体动物水平阐明 PKD1 在神经系统中的功能。随后，Amadesi 等人的研究 进一步验证了 PKD1 和 TRPV1 在 DRG 神经元中的 共定位 [28]。他们的研究显示，PKD1/2 在 DRG 小 直径肽能和非肽能神经元以及中大直径神经元中有 着广泛的分布，其中 PKD1/2 阳性神经元中约有 30%~40% 同时为 TRPV1 阳性，并且在组织损伤或 炎症过程中，蛋白酶活化受体 2 (protease-activated receptor 2, PAR2)激活可促进PKD1/2膜定位的增多。 该研究为 PKD1/2 调控 TRPV1 功能并参与炎症热 痛敏的形成提供了进一步的依据。 除 PKD1 外，我们还发现另外一种在神经系统 高表达的蛋白激酶 Cdk5 (cyclin-dependnet kinase 5) 参与炎症热痛觉敏化，TRPV1 是其作用靶点之一。 与 Cdk 家族的其它成员不同，Cdk5 的激活不依赖 于周期素 (cyclin)，而有其独特的激活子 p35 和 p39 ( 或其降解产物 p25 和 p29)。我们以及国外一研究 组最先报道了 Cdk5 参与炎症热痛敏的作用 [29,30]。 在 CFA 诱导炎症痛模型鼠中，外周 DRG 和脊髓背 角 Cdk5 有显著激活，经鞘内注射过表达 Cdk5 可 明显加重炎症痛模型鼠热痛敏行为，而过表达负显 性突变的 Cdk5 (dominant negative Cdk5, D144N-Cdk5) 或给予 Cdk5 的抑制剂 roscovitine 可减轻热痛敏 行为。 在随后对 Cdk5 调控炎症热痛敏的靶点寻找上， 国外研究组抢先报道了 Cdk5 对 TRPV1-T407 ( 此为 小鼠序列，对应大鼠序列为 T406) 的磷酸化作用 [31]。 考虑到 TRPV1 作为一种膜受体发挥功能，而当时 尚未见关于 TRPV1 膜转运机制的相关报道，我们 转而研究 TRPV1 的膜转运机制及 Cdk5 在其中可能 发挥的调控作用。我们的工作首次证明动力蛋 白 —— 驱动蛋白样蛋白 13B (kinesin-like protein 13B, KIF13B)参与 TRPV1膜转运，并且 Cdk5可 磷酸化 KIF13B 的 FHA 结构域 (forkhead-associated domain) T506，促进 TRPV1 与 KIF13B 的结合以及 TRPV1 的膜表达 [32]。在此基础上，我们还利用 Tat (trans-activating transcriptional activator) 技术构建了 穿膜肽 Tat-KIF13B-T506。Tat 是人类 I 型免疫缺陷 病毒的一种转录激活蛋白，它是一段富含碱性氨基 酸 ( 主要为精氨酸和赖氨酸 ) 的短肽，长度为 9~11 个氨基酸残基不等。Tat 具有很强的细胞穿透性， 温度适应性很广，能负载包括小分子物质、核酸、 肽和蛋白质在内的各种形式及分子量的物质进入细 胞内，并且不影响后者的功能。通过 Tat-KIF13B￾T506 特异性干扰 KIF13B 在 T506 位点的磷酸化， 可显著减少 TRPV1 的膜表达，降低细胞对辣椒素