680 生理学报 Acta Physiologica Sinica, October25,2017,695):677-684 的反应性,行为学上表现出缓解炎症热痛敏行为的2痛情绪的中枢机制研究及TRPV1在其中可 效应。 能的作用探讨 对于Cdk5调控炎症热痛敏的机制,除上述 慢性痛作为困扰临床的一大顽疾,往往表现出 cdk5-KIF13B-TRPV”通路之外,我们还根据文献 迁延不愈、反复发作的特点,而关于慢性痛和焦虑、 报道,对Cdk5对TRPV直接的磷酸化作用进行抑郁共病( comorbidity)的现象受到越来越多的关 了相关研究。结果表明,Cdk5对TRPV1-T406的磷 注3,这也促使我们对慢性痛尤其是痛情绪的中 酸化可促进TRPⅥ1的膜定位,针对该位点的磷酸 化干扰肽 Tat-TRPV1-T406可发挥与 Tat-KIF3B.枢机制展开探讨 前额叶皮质( prefrontal cortex)是一个在决策 减少TRPV的膜表达,降目标导向行为和工作记忆等高级神经活动中发挥重 低细胞对辣椒素的反应性,缓解炎症痛大鼠热痛敏 要作用的脑区,同时又参与痛觉信息处理,那么其 行为。最近有文献对Cdk5通过磷酸化对TRPV 是否可能参与慢性痛中痛感觉或痛情绪的调控呢? 发挥的功能调控作用进行了详细研究叫。结果表明,我们在CFA诱导炎症痛模型上的研究显示,CFA TRPV拟磷酸化突变体TRPV1-T406D与野生型相注射后1天,大鼠即可产生焦虑样行为,化学损毁 比,通道激活动力学减慢,但失敏现象被显著抑制,对侧前边缘皮质可同时发挥缓解热痛敏和焦虑样行 并表现出使用依赖的激活特性( use-dependent acti为的效应。电生理学记录显示,模型鼠对侧前边 vation pattern,即在初始状态,突变体对低剂量激缘皮质Ⅲ层锥体神经元活性明显下降,如果应 动剂的反应性显著减弱,几近完全消失,而当其被用光遗传学技术激活这些神经元,可有效缓解模型 大剂量激动剂充分激活之后,突变体对不同剂量激鼠热痛敏和焦虑样行为,相反地,如果抑制这些神 动剂的反应性显著升高。同时,该研究还揭示经元的活性,能够在正常小鼠中诱导焦虑样行为 TRPV1406的磷酸化状态与通道的门控特性有关。而对其痛感受无明显影响。在分子机制上,蛋白激 上述参与TRPV1磷酸化调控的蛋白激酶需要酶Cdk5的激活介导了这些神经元内在兴奋性的下 稳定的细胞骨架结构帮助其锚定于胞膜或近胞膜区降。敲减对侧前额叶皮质Cdk5表达或注射其抑制 域,以接近作用底物。因此,我们注意到一种微丝剂能够翻转CFA诱导的神经元活性下降,同时模 动力学的调节分子一LM( LIM motif-containing型鼠的热痛敏和焦虑样行为得到缓解。该研究是继 protein kinase)蛋白激酶。与其他蛋白激酶具有多样前扣带回( anterior cingulate cortex))被提出作为慢性 性的底物不同,LMK激酶目前只有唯一的作用底痛和焦虑相互作用的重要脑区之后甽,首次提出前 物—一肌动蛋白解聚因子/丝切蛋白 cofilin e。我们额叶皮质的前边缘皮质亚区在二者的相互作用中发 在CFA诱导大鼠炎症痛模型上,对LMK在炎症挥关键作用 热痛敏过程及其对TRPV1可能发挥的调控作用进 与我们的研究结果相一致,Le等几乎在同期 行了研究。结果显示,随着炎症热痛敏的发生, 揭示,光激活前边缘皮质神经元可缓解选择性神经 组织中LMK激酶活性显著升高, cofilin磷酸化增损伤( spared nerve injury,SN)模型大鼠机械触诱发 强而活性降低,肌动蛋白聚合为微丝的能力增强。痛、热和冷痛敏行为,同时对这些大鼠在糖水偏好 相反地,如果抑制LMK激酶活性或敲减其表达,和强迫游泳等实验中表现出的抑郁样行为具有显著 或通过磷酸化干扰肽 Tat-cofilir-s3千扰其底物 cofilin缓解作用。随着中枢TRPV1的功能被越来越多 的磷酸化不仅可抑制微丝聚合,还可以发挥对热痛的研究所揭示,这种在外周热痛觉敏化中发挥关键 敏行为的缓解作用。随着LIMK功能或 cofilin磷酸作用的分子是否也可能参与到疼痛的中枢调控,尤 化被抑制( cofilin活性增强→微丝聚合减弱→蛋白其是在我们前述所关注的前额叶皮质部位?在对痛 激酶锚定减少), TRPVI通道对辣椒素刺激的反应感觉的影响方面, de novellas等报道,脊神经结扎 性下降,其丝氨酸磷酸化水平降低。综上所述,如( spinal nerve ligation,SNL)术后7天大鼠前额叶皮 果说Cdk5促进 TRPVI膜定位是通过一种主动的膜质之前/下边缘皮质亚区TRPⅤ1蛋白含量显著上 转运调控机制实现的,那么LIMK增强 TRPVI功调,此时若向该部位注射TRPV1拮抗剂LRTX可 能则是通过一种被动的促进受体或离子通道膜定位产生即刻(<40min)的镇痛效应,大鼠机械抬足阈 的机制来实现 值升高约50%,触诱发痛( allodynia)现象减轻680 生理学报 Acta Physiologica Sinica, October 25, 2017, 69(5): 677–684 的反应性，行为学上表现出缓解炎症热痛敏行为的 效应。 对于 Cdk5 调控炎症热痛敏的机制，除上述 “Cdk5-KIF13B-TRPV1” 通路之外，我们还根据文献 报道，对 Cdk5 对 TRPV1 直接的磷酸化作用进行 了相关研究。结果表明，Cdk5 对 TRPV1-T406 的磷 酸化可促进 TRPV1 的膜定位，针对该位点的磷酸 化干扰肽 Tat-TRPV1-T406 可发挥与 Tat-KIF13B￾T506 类似的效应 —— 减少 TRPV1 的膜表达，降 低细胞对辣椒素的反应性，缓解炎症痛大鼠热痛敏 行为 [33]。最近有文献对 Cdk5 通过磷酸化对 TRPV1 发挥的功能调控作用进行了详细研究[34]。结果表明， TRPV1 拟磷酸化突变体 TRPV1-T406D 与野生型相 比，通道激活动力学减慢，但失敏现象被显著抑制， 并表现出使用依赖的激活特性 (use-dependent acti￾vation pattern)，即在初始状态，突变体对低剂量激 动剂的反应性显著减弱，几近完全消失，而当其被 大剂量激动剂充分激活之后，突变体对不同剂量激 动剂的反应性显著升高。同时，该研究还揭示 TRPV1-T406 的磷酸化状态与通道的门控特性有关。 上述参与 TRPV1 磷酸化调控的蛋白激酶需要 稳定的细胞骨架结构帮助其锚定于胞膜或近胞膜区 域，以接近作用底物。因此，我们注意到一种微丝 动力学的调节分子 ——LIMK (LIM motif-containing protein kinase) 蛋白激酶。与其他蛋白激酶具有多样 性的底物不同，LIMK 激酶目前只有唯一的作用底 物 —— 肌动蛋白解聚因子 / 丝切蛋白 cofilin。我们 在 CFA 诱导大鼠炎症痛模型上，对 LIMK 在炎症 热痛敏过程及其对 TRPV1 可能发挥的调控作用进 行了研究。结果显示，随着炎症热痛敏的发生，DRG 组织中 LIMK 激酶活性显著升高，cofilin 磷酸化增 强而活性降低，肌动蛋白聚合为微丝的能力增强 [35]。 相反地，如果抑制 LIMK 激酶活性或敲减其表达， 或通过磷酸化干扰肽 Tat-cofilin-S3 干扰其底物 cofilin 的磷酸化不仅可抑制微丝聚合，还可以发挥对热痛 敏行为的缓解作用。随着 LIMK 功能或 cofilin 磷酸 化被抑制 (cofilin 活性增强→微丝聚合减弱→蛋白 激酶锚定减少 )，TRPV1 通道对辣椒素刺激的反应 性下降，其丝氨酸磷酸化水平降低。综上所述，如 果说 Cdk5 促进 TRPV1 膜定位是通过一种主动的膜 转运调控机制实现的，那么 LIMK 增强 TRPV1 功 能则是通过一种被动的促进受体或离子通道膜定位 的机制来实现。 2 痛情绪的中枢机制研究及TRPV1在其中可 能的作用探讨 慢性痛作为困扰临床的一大顽疾，往往表现出 迁延不愈、反复发作的特点，而关于慢性痛和焦虑、 抑郁共病 (comorbidity) 的现象受到越来越多的关 注 [36, 37]，这也促使我们对慢性痛尤其是痛情绪的中 枢机制展开探讨。 前额叶皮质 (prefrontal cortex) 是一个在决策、 目标导向行为和工作记忆等高级神经活动中发挥重 要作用的脑区，同时又参与痛觉信息处理，那么其 是否可能参与慢性痛中痛感觉或痛情绪的调控呢？ 我们在 CFA 诱导炎症痛模型上的研究显示，CFA 注射后 1 天，大鼠即可产生焦虑样行为，化学损毁 对侧前边缘皮质可同时发挥缓解热痛敏和焦虑样行 为的效应 [38]。电生理学记录显示，模型鼠对侧前边 缘皮质 II/III 层锥体神经元活性明显下降，如果应 用光遗传学技术激活这些神经元，可有效缓解模型 鼠热痛敏和焦虑样行为，相反地，如果抑制这些神 经元的活性，能够在正常小鼠中诱导焦虑样行为， 而对其痛感受无明显影响。在分子机制上，蛋白激 酶 Cdk5 的激活介导了这些神经元内在兴奋性的下 降。敲减对侧前额叶皮质 Cdk5 表达或注射其抑制 剂能够翻转 CFA 诱导的神经元活性下降，同时模 型鼠的热痛敏和焦虑样行为得到缓解。该研究是继 前扣带回 (anterior cingulate cortex) 被提出作为慢性 痛和焦虑相互作用的重要脑区之后 [39]，首次提出前 额叶皮质的前边缘皮质亚区在二者的相互作用中发 挥关键作用。 与我们的研究结果相一致，Lee 等几乎在同期 揭示，光激活前边缘皮质神经元可缓解选择性神经 损伤 (spared nerve injury, SNI) 模型大鼠机械触诱发 痛、热和冷痛敏行为，同时对这些大鼠在糖水偏好 和强迫游泳等实验中表现出的抑郁样行为具有显著 缓解作用 [40]。随着中枢 TRPV1 的功能被越来越多 的研究所揭示，这种在外周热痛觉敏化中发挥关键 作用的分子是否也可能参与到疼痛的中枢调控，尤 其是在我们前述所关注的前额叶皮质部位？在对痛 感觉的影响方面，de Novellis 等报道，脊神经结扎 (spinal nerve ligation, SNL) 术后 7 天大鼠前额叶皮 质之前 / 下边缘皮质亚区 TRPV1 蛋白含量显著上 调，此时若向该部位注射 TRPV1 拮抗剂 I-RTX 可 产生即刻 (< 40 min) 的镇痛效应，大鼠机械抬足阈 值升高约 50%，触诱发痛 (allodynia) 现象减轻 [41]