《生理学报》：TRPV1：一种同时参与慢性痛外周敏化和疼痛中枢调制的重要分子（北京大学：张瑛、王韵）

生理学报 Acta Physiologica Sinica, October25,2017,695):677-684 677 Dol:10.13294/j.aps.2017.0057http://www.actaps.com.cn 综述 TRPV1:一种同时參与慢性痛外周敏化和疼痛中枢调制的重 要分子 张瑛,王韵2 北京大学医学部基础医学院神经科学研究所,神经生物学系,教育部和卫生与计划生育委员会神经科学重点实验室,北京 100083:2北京大学麦戈文脑科学研究所,北京100871 摘要:慢性痛是困扰临床的一大顽疾,关于慢性痛机制的研究和新型镇痛药物的研发具有重要意义。十多年来,本研究组 目绕慢性痛外周敏化形成的关键分子—瞬时受体电位香草酸亚型1( transient receptor potential vanilloid type I,TRPv1),对 其敏化和膜定位机制进行了系列研究,揭示了蛋白激酶PKDl( protein kinase D1)、Cdk5( cyclin-dependent kinase5)和LIMK (LIM- motif containing kinase)在炎症诱发热痛敏中的作用及其对 TRPVI的功能调控,并据此开发出了一系列具有镇痛作用的 Iat穿膜肽。本综述还围绕研究组近期工作所揭示的参与痛感觉和痛情绪相互作用的关键脑区—一前额叶皮质的前边缘皮质 亚区,对 TRPVI在其中的可能作用进行了探讨。此外本综述也对研究组在改进TRPV1靶向药物,提高其镇痛疗效,降低副 作用方面的工作进行了简要总结和回顾 关词:疼痛:TRPV1:磷酸化:Tat穿膜肽:镇痛 中图分类号:R383:Q432 TRPVI: an important molecule involved in the peripheral sensitization during chronic pain and central pain modulation ZHANG Y WANG Yun.2,. Neuroscience Research institute and Department of Neurobiology. School of Basic Medical Sciences, Key Laboratory for Neuroscience Ministry of Education/National Health and Family Planning Commission, Peking University Health Science Center, Beijing 100083, China; PKU-IDG/McGovern Institute for Brain Research, Peking University Beijing 100871, China Abstract: As chronic pain is a severe problem in clinics, study of the mechanisms of chronic pain and development of novel analgesic agents is of significance. In the past decade, our lab completed a series of studies on the regulatory mechanisms of functional sensiti- zation and membrane trafficking of transient receptor potential vanilloid type 1(TRPVI), a key molecule involved in the development of peripheral sensitization. Our studies elucidated the important regulatory roles of several protein kinases, including PKDl(protein kinase D1), Cdks(cyclin-dependent kinase 5)and LIMK (LIM-motif containing kinase), in inflammatory thermal hyperalgesia. Moreover based on these findings, we constructed a series of transmembrane Tat-fusion peptides for pain relief. The potential role of central TRPVI was discussed as well. Prelimbic subregion of prefrontal cortex was revealed to be a critical brain region involved in the interaction between pain sensation and pain emotions by our recent studies. In addition, our work attempted to improve the analgesic effects of the agents targeting TRPVI and concurrently reduce their side effects. Herein we summarized the work of our lab in pain nd pain modulation during the past decade. Key words: pain; TRPVI; phosphorylation; Tat-transmembrane peptide; analgesia Received 2017-05-17 Accepted 2017-07-20 Research from the corresponding authors laboratory was supported by grants from the National Natural Science Foundation of China(No 3153002, 30925015, 30830044, 31771295, and 31371143) and the National Basic Research Development Program of China(No. 2014CB542204) Corresponding author. Tel: +86-10-82801119: E-mail: wangy66@bjmu edu

生理学报 Acta Physiologica Sinica, October 25, 2017, 69(5): 677–684 DOI: 10.13294/j.aps.2017.0057 http://www.actaps.com.cn 677 TRPV1：一种同时参与慢性痛外周敏化和疼痛中枢调制的重 要分子 张 瑛1 ，王 韵1,2,* 1 北京大学医学部基础医学院神经科学研究所，神经生物学系，教育部和卫生与计划生育委员会神经科学重点实验室，北京 100083；2 北京大学麦戈文脑科学研究所，北京 100871 摘 要：慢性痛是困扰临床的一大顽疾，关于慢性痛机制的研究和新型镇痛药物的研发具有重要意义。十多年来，本研究组 围绕慢性痛外周敏化形成的关键分子——瞬时受体电位香草酸亚型1 (transient receptor potential vanilloid type 1, TRPV1)，对 其敏化和膜定位机制进行了系列研究，揭示了蛋白激酶PKD1 (protein kinase D1)、Cdk5 (cyclin-dependent kinase 5)和LIMK (LIM-motif containing kinase)在炎症诱发热痛敏中的作用及其对TRPV1的功能调控，并据此开发出了一系列具有镇痛作用的 Tat穿膜肽。本综述还围绕研究组近期工作所揭示的参与痛感觉和痛情绪相互作用的关键脑区——前额叶皮质的前边缘皮质 亚区，对TRPV1在其中的可能作用进行了探讨。此外本综述也对研究组在改进TRPV1靶向药物，提高其镇痛疗效，降低副 作用方面的工作进行了简要总结和回顾。 关键词：疼痛；TRPV1；磷酸化；Tat穿膜肽；镇痛 中图分类号：R338.3；Q432 TRPV1: an important molecule involved in the peripheral sensitization during chronic pain and central pain modulation ZHANG Ying1 , WANG Yun1,2,* 1 Neuroscience Research Institute and Department of Neurobiology, School of Basic Medical Sciences, Key Laboratory for Neuroscience, Ministry of Education/National Health and Family Planning Commission, Peking University Health Science Center, Beijing 100083, China; 2 PKU-IDG/McGovern Institute for Brain Research, Peking University, Beijing 100871, China Abstract: As chronic pain is a severe problem in clinics, study of the mechanisms of chronic pain and development of novel analgesic agents is of significance. In the past decade, our lab completed a series of studies on the regulatory mechanisms of functional sensiti￾zation and membrane trafficking of transient receptor potential vanilloid type 1 (TRPV1), a key molecule involved in the development of peripheral sensitization. Our studies elucidated the important regulatory roles of several protein kinases, including PKD1 (protein kinase D1), Cdk5 (cyclin-dependent kinase 5) and LIMK (LIM-motif containing kinase), in inflammatory thermal hyperalgesia. Moreover, based on these findings, we constructed a series of transmembrane Tat-fusion peptides for pain relief. The potential role of central TRPV1 was discussed as well. Prelimbic subregion of prefrontal cortex was revealed to be a critical brain region involved in the interaction between pain sensation and pain emotions by our recent studies. In addition, our work attempted to improve the analgesic effects of the agents targeting TRPV1 and concurrently reduce their side effects. Herein we summarized the work of our lab in pain and pain modulation during the past decade. Key words: pain; TRPV1; phosphorylation; Tat-transmembrane peptide; analgesia Received 2017-05-17 Accepted 2017-07-20 Research from the corresponding author’s laboratory was supported by grants from the National Natural Science Foundation of China (No. 3153002, 30925015, 30830044, 31771295, and 31371143) and the National Basic Research Development Program of China (No. 2014CB542204). * Corresponding author. Tel: +86-10-82801119; E-mail: wangy66@bjmu.edu.cn 综 述

生理学报 Acta Physiologica Sinica, October25,2017,695):677-684 2016年, Amanda c de c williams和 Kenneth D热、化学和机械等不同形式刺激的受体,这些受体 Crag两位学者提出了“疼痛”的新定义:疼痛是构成了机体进行温度、化学或机械感受的物质基础 一种与现实或潜在的组织损伤相关的痛苦体验,包其中,有一种高表达在伤害性感受相关的中小直径 含了感觉、情绪、认知和社会四方面的成分叫。根初级感觉神经元中的受体—TRPⅤ1备受关注 据其时程不同,疼痛可分为急性痛和慢性痛:前者它不仅可以被热(>43%C)、酸(pH52°C的热刺激激活, 效果,这些现象提示痛相关的高级神经中枢可能但mp2基因敲除小鼠并未表现出热感受的异常 在疼痛的慢性化进程中发挥着关键作用。因此,探TRPV3的温度激活阈值为33~35℃,主要分布在 讨慢性痛过程中发生在脑水平的可塑性变化,成为皮肤角化细胞,在维持皮肤和毛发的正常生理功 近年来疼痛研究的热点方向 能中发挥重要作用;TRPV4的温度激活阈值为 本研究组十多年来,从慢性痛的外周敏化机27-34°C叫,在角化细胞和初级感觉神经元等多种 制研究开始,围绕伤害性信息整合分子——瞬时组织中有着广泛的表达,参与细胞的渗透压和机械 受体电位香草酸亚型1( transient receptor potential感受吗。随后的这些发现进一步巩固了TRPV在 vanilloid type 1,TRPV)展开了系列工作,并在此伤害性热感受和热痛敏形成过程中的核心地位,因 基础上开发了一些具有镇痛作用的短肽物质,近此TRPV1被广泛应用为背根神经节( dorsal root 年来又应用现代神经科学技术如光遗传学、化学 ganglion,DRG)热感受神经元的分子标记物。近年 遗传学等,将研究工作拓展到痛情绪的脑机制研来,虽然越来越多的热感受分子如TRPM3( transient 究上。此外,我们还在改善现有TRPV1靶点镇痛 receptor potential melastatin-3),钙激活氯通道(anct- 药物,降低其毒副作用等方面进行了相关研究。在amin-l,Anol)和双孔钾通道(two- pore domain potas 《生理学报》创刊90周年之际,我们对本研究组十 sium channels,K2P)等被陆续发现",但通过对 余年来围绕TRPV完成的相关工作进行总结,以 TRPVI-DTR( diphtheria toxin receptor)小鼠注射白 作献礼。 喉毒素,选择性损毁 TRPVI阳性神经元的硏究再 次证实,这些神经元对小鼠40°C以上热刺激的伤 I TRPV1的敏化和膜定位调控机制研究 害性回避行为以及伤害性热刺激信息从外周向脊髓 外周伤害性感受器上分布着各种可以接受冷、背角的传递是必需的92

678 生理学报 Acta Physiologica Sinica, October 25, 2017, 69(5): 677–684 2016 年，Amanda C de C Williams 和 Kenneth D Craig 两位学者提出了“疼痛”的新定义 ：疼痛是 一种与现实或潜在的组织损伤相关的痛苦体验，包 含了感觉、情绪、认知和社会四方面的成分 [1]。根 据其时程不同，疼痛可分为急性痛和慢性痛 ：前者 发生于组织损伤即刻，对机体具有警示和保护作用； 而后者是由神经损伤或神经活动异常引起的长时程 病理变化所介导，是目前临床亟需解决的一大难题。 据统计，全球约有五分之一的人口罹患慢性痛 [2]， 而其中约四分之三的病人在病程中伴发过焦虑、抑 郁障碍等精神共病 [3]，肉体与精神的双重折磨严重 降低了病人的生存质量。但是，由于人们对慢性痛 产生机制的认识还不充分，现有镇痛药物疗效欠佳 或副作用显著，因此多数慢性痛病人得不到及时、 有效的镇痛治疗。关于慢性痛机制的研究和新型镇 痛药物的研发具有重要意义。 关于慢性痛机制的研究，主要围绕外周伤害性 感受器 (nociceptor)、脊髓和脑三个水平展开。既往 在外周伤害性感受器和脊髓水平进行的研究，催生 了大量参与慢性痛形成或维持的蛋白激酶、离子通 道和受体等分子成为潜在的镇痛药物靶点，然而临 床实践表明，仅靶向外周和 / 或脊髓水平且收效良 好的镇痛药物寥寥无几 [4–6]，而针对脑内神经活动 的抗焦虑和抗抑郁药物却在临床上获得良好的镇痛 效果 [7]，这些现象提示痛相关的高级神经中枢可能 在疼痛的慢性化进程中发挥着关键作用。因此，探 讨慢性痛过程中发生在脑水平的可塑性变化，成为 近年来疼痛研究的热点方向。 本研究组十多年来，从慢性痛的外周敏化机 制研究开始，围绕伤害性信息整合分子 —— 瞬时 受体电位香草酸亚型 1 (transient receptor potential vanilloid type 1, TRPV1) 展开了系列工作，并在此 基础上开发了一些具有镇痛作用的短肽物质，近 年来又应用现代神经科学技术如光遗传学、化学 遗传学等，将研究工作拓展到痛情绪的脑机制研 究上。此外，我们还在改善现有 TRPV1 靶点镇痛 药物，降低其毒副作用等方面进行了相关研究。在 《生理学报》创刊 90 周年之际，我们对本研究组十 余年来围绕 TRPV1 完成的相关工作进行总结，以 作献礼。 1 TRPV1的敏化和膜定位调控机制研究 外周伤害性感受器上分布着各种可以接受冷、 热、化学和机械等不同形式刺激的受体，这些受体 构成了机体进行温度、化学或机械感受的物质基础。 其中，有一种高表达在伤害性感受相关的中小直径 初级感觉神经元中的受体 ——TRPV1 备受关注。 它不仅可以被热 (> 43 °C)、酸 (pH 52 °C 的热刺激激活， 但 trpv2 基因敲除小鼠并未表现出热感受的异常 [11] ； TRPV3 的温度激活阈值为 33~35 °C，主要分布在 皮肤角化细胞 [12]，在维持皮肤和毛发的正常生理功 能中发挥重要作用 [13] ；TRPV4 的温度激活阈值为 27~34 °C [14]，在角化细胞和初级感觉神经元等多种 组织中有着广泛的表达，参与细胞的渗透压和机械 感受 [15]。随后的这些发现进一步巩固了 TRPV1 在 伤害性热感受和热痛敏形成过程中的核心地位，因 此 TRPV1 被广泛应用为背根神经节 (dorsal root ganglion, DRG) 热感受神经元的分子标记物。近年 来，虽然越来越多的热感受分子如 TRPM3 (transient receptor potential melastatin-3)，钙激活氯通道 (anoct￾amin-1, Ano1) 和双孔钾通道 (two-pore domain potas￾sium channels, K2P) 等被陆续发现 [16–18]，但通过对 TRPV1-DTR (diphtheria toxin receptor) 小鼠注射白 喉毒素，选择性损毁 TRPV1 阳性神经元的研究再 次证实，这些神经元对小鼠 40 °C 以上热刺激的伤 害性回避行为以及伤害性热刺激信息从外周向脊髓 背角的传递是必需的 [19, 20]

张瑛等:TRPV1:一种同时参与慢性痛外周敏化和疼痛中枢调制的重要分子 679 敏化是TRPV通道最显著的功能特征之 共定位。他们的研究显示,PKD12在DRG小 也是热痛觉敏化形成的关键因素,其形成可归因于直径肽能和非肽能神经元以及中大直径神经元中有 转录和转录后水平的调控,其中磷酸化修饰是着广泛的分布,其中PKD1/2阳性神经元中约有 TRPVI最为重要的一种转录后调控机制。有文献相30%~40%同时为TRPV1阳性,并且在组织损伤或 继报道了蛋白激酶A( protein kinase A,PKA、蛋炎症过程中,蛋白酶活化受体2( protease-activated 白激酶C( protein kinase C,PKC)2、磷脂酰肌醇-3 receptor2,PAR2)激活可促进PKD/2膜定位的增多。 激酶( phosphatidylinositol-3 -kinase,P3K)2和Ca2/该研究为PKD/2调控TRPV功能并参与炎症热 钙调素依赖型蛋白激酶Ⅱ(Ca/ calmodulin-depen-痛敏的形成提供了进一步的依据 dent protein kinase, CaMKII)等对TPRV1的磷 除PKD1外,我们还发现另外一种在神经系统 酸化及在其功能敏化中的作用。本研究组前期在稳高表达的蛋白激酶Cdks( cyclin- dependnet kinase5) 定表达TRPV的CHO细胞进行的免疫共沉淀研究参与炎症热痛觉敏化,TRPⅤ1是其作用靶点之 显示,TRPV可以和PKCμ即蛋白激酶Dl( protein与Cdk家族的其它成员不同,Cdk5的激活不依赖 kinase di,PKDl)形成复合物,而未检测到TRPV于周期素( cyclin),而有其独特的激活子p35和p39 与其他PKC亚型直接的相互作用的。因此,本研(或其降解产物p25和p29)。我们以及国外一研究 究组最终将目标锁定在PKD1上。PKD1最初被归组最先报道了Cdk5参与炎症热痛敏的作用到 为PKC家族,称为非典型ⅣKC亚型。但由于其在在CFA诱导炎症痛模型鼠中,外周DRG和脊髓背 激酶特性和蛋白结构上与PKC差异显著,而在底角Cdk5有显著激活,经鞘内注射过表达Cdk5可 物特异上与CaMK家族保持较高的相似性,因此明显加重炎症痛模型鼠热痛敏行为,而过表达负显 PKD1最终被归为CaMK家族。我们的研究结果性突变的Cdk5( dominant negative Cdk5,D144N-Cdk5) 显示,PKD不仅可以与TRPV氨基端发生结合,或给予Cdk5的抑制剂 roscovitine可减轻热痛敏 还可以直接对其S116进行磷酸化,并且这种磷酸行为 化作用显著増加了 TRPVI对辣椒素刺激的反应在随后对Cdk5调控炎症热痛敏的靶点寻找上, 性。该研究为当时尚处空白的PKD1生理功能研国外研究组抢先报道了Cdk5对TRPV1-1407(此为 究提供了重要依据,也为我们今后探讨在体情况下,小鼠序列,对应大鼠序列为T406)的磷酸化作用 PKDI对TRPV1的功能调控及其在炎症热痛敏中的考虑到 TRPVI作为一种膜受体发挥功能,而当时 可能作用奠定了基础 尚未见关于 TRPVI膜转运机制的相关报道,我们 我们随后的研究工作表明,在足底注射完全弗转而研究 TRPVI的膜转运机制及Cdk5在其中可能 佐剂( complete Freund' s adjuvant,CFA)诱导的大发挥的调控作用。我们的工作首次证明动力蛋 鼠炎症痛模型中,通过鞘内注射使DRG神经元过白——驱动蛋白样蛋白13B( kinesin- clike protein 表达PKD1能显著加重大鼠热痛敏行为,而过表达13B,KIF13B)参与TRPV膜转运,并且Cdk5可 负显性突变的PKDl( dominant negative PKd1,D727A-磷酸化KIF13B的FHA结构域( forkhead- associated PKD1)或注射PKDl反义寡核苷酸则可以起到缓解 domain)T506,促进TRPV1与KIF13B的结合以及 热痛敏行为的作用,同时对机械痛敏没有影响。在TRPV1的膜表达。在此基础上,我们还利用Tat 炎症痛模型鼠的DRG神经元中,可以观察到PKD( trans- activating transcriptional activator)技术构建了 膜定位的增多及其与TRPV的共定位,同时生化穿膜肽Tat-KIF13B-T506。Tat是人类I型免疫缺陷 检测可发现二者的相互结合。在急性分离的DRG病毒的一种转录激活蛋白,它是一段富含碱性氨基 神经元中的研究显示,当增强PKDI活性时,酸(主要为精氨酸和赖氨酸)的短肽,长度为9~1l TRPⅤⅠ的膜表达增多,辣椒素诱发的电流幅度增个氨基酸残基不等。Tat具有很强的细胞穿透性, 大叼。该研究首次揭示了在体情况下“PKD1-温度适应性很广,能负载包括小分子物质、核酸、 TRPV1”之间的相互作用及其促进炎症热痛敏行为肽和蛋白质在内的各种形式及分子量的物质进入细 产生的效应,也是首次在整体动物水平阐明PKD1胞内,并且不影响后者的功能。通过 Tat-KIE13B- 在神经系统中的功能。随后, Amadesi等人的研究T506特异性干扰KF13B在T506位点的磷酸化, 进一步验证了PKD1和TRPⅤ1在DRG神经元中的可显著减少TRPV的膜表达,降低细胞对辣椒素

张 瑛等：TRPV1：一种同时参与慢性痛外周敏化和疼痛中枢调制的重要分子 679 敏化是 TRPV1 通道最显著的功能特征之一， 也是热痛觉敏化形成的关键因素，其形成可归因于 转录和转录后水平的调控，其中磷酸化修饰是 TRPV1 最为重要的一种转录后调控机制。有文献相 继报道了蛋白激酶 A (protein kinase A, PKA)[21]、蛋 白激酶 C (protein kinase C, PKC)[22]、磷脂酰肌醇 -3 激 酶 (phosphatidylinositol-3-kinase, PI3K)[23] 和 Ca2+/ 钙调素依赖型蛋白激酶 II (Ca2+/calmodulin-depen￾dent protein kinase II, CaMKII)[24] 等 对 TPRV1 的 磷 酸化及在其功能敏化中的作用。本研究组前期在稳 定表达 TRPV1 的 CHO 细胞进行的免疫共沉淀研究 显示，TRPV1 可以和 PKCµ 即蛋白激酶 D1 (protein kinase D1, PKD1) 形成复合物，而未检测到 TRPV1 与其他 PKC 亚型直接的相互作用 [25]。因此，本研 究组最终将目标锁定在 PKD1 上。PKD1 最初被归 为 PKC 家族，称为非典型 PKC 亚型。但由于其在 激酶特性和蛋白结构上与 PKC 差异显著，而在底 物特异上与 CaMK 家族保持较高的相似性，因此 PKD1 最终被归为 CaMK 家族 [26]。我们的研究结果 显示，PKD1 不仅可以与 TRPV1 氨基端发生结合， 还可以直接对其 S116 进行磷酸化，并且这种磷酸 化作用显著增加了 TRPV1 对辣椒素刺激的反应 性 [25]。该研究为当时尚处空白的 PKD1 生理功能研 究提供了重要依据，也为我们今后探讨在体情况下， PKD1 对 TRPV1 的功能调控及其在炎症热痛敏中的 可能作用奠定了基础。 我们随后的研究工作表明，在足底注射完全弗 氏佐剂 (complete Freund’s adjuvant, CFA) 诱导的大 鼠炎症痛模型中，通过鞘内注射使 DRG 神经元过 表达 PKD1 能显著加重大鼠热痛敏行为，而过表达 负显性突变的 PKD1 (dominant negative PKD1, D727A￾PKD1) 或注射 PKD1 反义寡核苷酸则可以起到缓解 热痛敏行为的作用，同时对机械痛敏没有影响。在 炎症痛模型鼠的 DRG 神经元中，可以观察到 PKD1 膜定位的增多及其与 TRPV1 的共定位，同时生化 检测可发现二者的相互结合。在急性分离的 DRG 神 经 元 中 的 研 究 显 示， 当 增 强 PKD1 活 性 时， TRPV1 的膜表达增多，辣椒素诱发的电流幅度增 大 [27]。 该 研 究 首 次 揭示 了 在 体 情 况 下“PKD1- TRPV1”之间的相互作用及其促进炎症热痛敏行为 产生的效应，也是首次在整体动物水平阐明 PKD1 在神经系统中的功能。随后，Amadesi 等人的研究 进一步验证了 PKD1 和 TRPV1 在 DRG 神经元中的 共定位 [28]。他们的研究显示，PKD1/2 在 DRG 小 直径肽能和非肽能神经元以及中大直径神经元中有 着广泛的分布，其中 PKD1/2 阳性神经元中约有 30%~40% 同时为 TRPV1 阳性，并且在组织损伤或 炎症过程中，蛋白酶活化受体 2 (protease-activated receptor 2, PAR2)激活可促进PKD1/2膜定位的增多。 该研究为 PKD1/2 调控 TRPV1 功能并参与炎症热 痛敏的形成提供了进一步的依据。 除 PKD1 外，我们还发现另外一种在神经系统 高表达的蛋白激酶 Cdk5 (cyclin-dependnet kinase 5) 参与炎症热痛觉敏化，TRPV1 是其作用靶点之一。 与 Cdk 家族的其它成员不同，Cdk5 的激活不依赖 于周期素 (cyclin)，而有其独特的激活子 p35 和 p39 ( 或其降解产物 p25 和 p29)。我们以及国外一研究 组最先报道了 Cdk5 参与炎症热痛敏的作用 [29,30]。 在 CFA 诱导炎症痛模型鼠中，外周 DRG 和脊髓背 角 Cdk5 有显著激活，经鞘内注射过表达 Cdk5 可 明显加重炎症痛模型鼠热痛敏行为，而过表达负显 性突变的 Cdk5 (dominant negative Cdk5, D144N-Cdk5) 或给予 Cdk5 的抑制剂 roscovitine 可减轻热痛敏 行为。 在随后对 Cdk5 调控炎症热痛敏的靶点寻找上， 国外研究组抢先报道了 Cdk5 对 TRPV1-T407 ( 此为 小鼠序列，对应大鼠序列为 T406) 的磷酸化作用 [31]。 考虑到 TRPV1 作为一种膜受体发挥功能，而当时 尚未见关于 TRPV1 膜转运机制的相关报道，我们 转而研究 TRPV1 的膜转运机制及 Cdk5 在其中可能 发挥的调控作用。我们的工作首次证明动力蛋 白 —— 驱动蛋白样蛋白 13B (kinesin-like protein 13B, KIF13B)参与 TRPV1膜转运，并且 Cdk5可 磷酸化 KIF13B 的 FHA 结构域 (forkhead-associated domain) T506，促进 TRPV1 与 KIF13B 的结合以及 TRPV1 的膜表达 [32]。在此基础上，我们还利用 Tat (trans-activating transcriptional activator) 技术构建了 穿膜肽 Tat-KIF13B-T506。Tat 是人类 I 型免疫缺陷 病毒的一种转录激活蛋白，它是一段富含碱性氨基 酸 ( 主要为精氨酸和赖氨酸 ) 的短肽，长度为 9~11 个氨基酸残基不等。Tat 具有很强的细胞穿透性， 温度适应性很广，能负载包括小分子物质、核酸、 肽和蛋白质在内的各种形式及分子量的物质进入细 胞内，并且不影响后者的功能。通过 Tat-KIF13B￾T506 特异性干扰 KIF13B 在 T506 位点的磷酸化， 可显著减少 TRPV1 的膜表达，降低细胞对辣椒素

680 生理学报 Acta Physiologica Sinica, October25,2017,695):677-684 的反应性,行为学上表现出缓解炎症热痛敏行为的2痛情绪的中枢机制研究及TRPV1在其中可 效应。 能的作用探讨 对于Cdk5调控炎症热痛敏的机制,除上述 慢性痛作为困扰临床的一大顽疾,往往表现出 cdk5-KIF13B-TRPV”通路之外,我们还根据文献 迁延不愈、反复发作的特点,而关于慢性痛和焦虑、 报道,对Cdk5对TRPV直接的磷酸化作用进行抑郁共病( comorbidity)的现象受到越来越多的关 了相关研究。结果表明,Cdk5对TRPV1-T406的磷 注3,这也促使我们对慢性痛尤其是痛情绪的中 酸化可促进TRPⅥ1的膜定位,针对该位点的磷酸 化干扰肽 Tat-TRPV1-T406可发挥与 Tat-KIF3B.枢机制展开探讨 前额叶皮质( prefrontal cortex)是一个在决策 减少TRPV的膜表达,降目标导向行为和工作记忆等高级神经活动中发挥重 低细胞对辣椒素的反应性,缓解炎症痛大鼠热痛敏 要作用的脑区,同时又参与痛觉信息处理,那么其 行为。最近有文献对Cdk5通过磷酸化对TRPV 是否可能参与慢性痛中痛感觉或痛情绪的调控呢? 发挥的功能调控作用进行了详细研究叫。结果表明,我们在CFA诱导炎症痛模型上的研究显示,CFA TRPV拟磷酸化突变体TRPV1-T406D与野生型相注射后1天,大鼠即可产生焦虑样行为,化学损毁 比,通道激活动力学减慢,但失敏现象被显著抑制,对侧前边缘皮质可同时发挥缓解热痛敏和焦虑样行 并表现出使用依赖的激活特性( use-dependent acti为的效应。电生理学记录显示,模型鼠对侧前边 vation pattern,即在初始状态,突变体对低剂量激缘皮质Ⅲ层锥体神经元活性明显下降,如果应 动剂的反应性显著减弱,几近完全消失,而当其被用光遗传学技术激活这些神经元,可有效缓解模型 大剂量激动剂充分激活之后,突变体对不同剂量激鼠热痛敏和焦虑样行为,相反地,如果抑制这些神 动剂的反应性显著升高。同时,该研究还揭示经元的活性,能够在正常小鼠中诱导焦虑样行为 TRPV1406的磷酸化状态与通道的门控特性有关。而对其痛感受无明显影响。在分子机制上,蛋白激 上述参与TRPV1磷酸化调控的蛋白激酶需要酶Cdk5的激活介导了这些神经元内在兴奋性的下 稳定的细胞骨架结构帮助其锚定于胞膜或近胞膜区降。敲减对侧前额叶皮质Cdk5表达或注射其抑制 域,以接近作用底物。因此,我们注意到一种微丝剂能够翻转CFA诱导的神经元活性下降,同时模 动力学的调节分子一LM( LIM motif-containing型鼠的热痛敏和焦虑样行为得到缓解。该研究是继 protein kinase)蛋白激酶。与其他蛋白激酶具有多样前扣带回( anterior cingulate cortex))被提出作为慢性 性的底物不同,LMK激酶目前只有唯一的作用底痛和焦虑相互作用的重要脑区之后甽,首次提出前 物—一肌动蛋白解聚因子/丝切蛋白 cofilin e。我们额叶皮质的前边缘皮质亚区在二者的相互作用中发 在CFA诱导大鼠炎症痛模型上,对LMK在炎症挥关键作用 热痛敏过程及其对TRPV1可能发挥的调控作用进 与我们的研究结果相一致,Le等几乎在同期 行了研究。结果显示,随着炎症热痛敏的发生, 揭示,光激活前边缘皮质神经元可缓解选择性神经 组织中LMK激酶活性显著升高, cofilin磷酸化增损伤( spared nerve injury,SN)模型大鼠机械触诱发 强而活性降低,肌动蛋白聚合为微丝的能力增强。痛、热和冷痛敏行为,同时对这些大鼠在糖水偏好 相反地,如果抑制LMK激酶活性或敲减其表达,和强迫游泳等实验中表现出的抑郁样行为具有显著 或通过磷酸化干扰肽 Tat-cofilir-s3千扰其底物 cofilin缓解作用。随着中枢TRPV1的功能被越来越多 的磷酸化不仅可抑制微丝聚合,还可以发挥对热痛的研究所揭示,这种在外周热痛觉敏化中发挥关键 敏行为的缓解作用。随着LIMK功能或 cofilin磷酸作用的分子是否也可能参与到疼痛的中枢调控,尤 化被抑制( cofilin活性增强→微丝聚合减弱→蛋白其是在我们前述所关注的前额叶皮质部位?在对痛 激酶锚定减少), TRPVI通道对辣椒素刺激的反应感觉的影响方面, de novellas等报道,脊神经结扎 性下降,其丝氨酸磷酸化水平降低。综上所述,如( spinal nerve ligation,SNL)术后7天大鼠前额叶皮 果说Cdk5促进 TRPVI膜定位是通过一种主动的膜质之前/下边缘皮质亚区TRPⅤ1蛋白含量显著上 转运调控机制实现的,那么LIMK增强 TRPVI功调,此时若向该部位注射TRPV1拮抗剂LRTX可 能则是通过一种被动的促进受体或离子通道膜定位产生即刻(<40min)的镇痛效应,大鼠机械抬足阈 的机制来实现 值升高约50%,触诱发痛( allodynia)现象减轻

680 生理学报 Acta Physiologica Sinica, October 25, 2017, 69(5): 677–684 的反应性，行为学上表现出缓解炎症热痛敏行为的 效应。 对于 Cdk5 调控炎症热痛敏的机制，除上述 “Cdk5-KIF13B-TRPV1” 通路之外，我们还根据文献 报道，对 Cdk5 对 TRPV1 直接的磷酸化作用进行 了相关研究。结果表明，Cdk5 对 TRPV1-T406 的磷 酸化可促进 TRPV1 的膜定位，针对该位点的磷酸 化干扰肽 Tat-TRPV1-T406 可发挥与 Tat-KIF13B￾T506 类似的效应 —— 减少 TRPV1 的膜表达，降 低细胞对辣椒素的反应性，缓解炎症痛大鼠热痛敏 行为 [33]。最近有文献对 Cdk5 通过磷酸化对 TRPV1 发挥的功能调控作用进行了详细研究[34]。结果表明， TRPV1 拟磷酸化突变体 TRPV1-T406D 与野生型相 比，通道激活动力学减慢，但失敏现象被显著抑制， 并表现出使用依赖的激活特性 (use-dependent acti￾vation pattern)，即在初始状态，突变体对低剂量激 动剂的反应性显著减弱，几近完全消失，而当其被 大剂量激动剂充分激活之后，突变体对不同剂量激 动剂的反应性显著升高。同时，该研究还揭示 TRPV1-T406 的磷酸化状态与通道的门控特性有关。 上述参与 TRPV1 磷酸化调控的蛋白激酶需要 稳定的细胞骨架结构帮助其锚定于胞膜或近胞膜区 域，以接近作用底物。因此，我们注意到一种微丝 动力学的调节分子 ——LIMK (LIM motif-containing protein kinase) 蛋白激酶。与其他蛋白激酶具有多样 性的底物不同，LIMK 激酶目前只有唯一的作用底 物 —— 肌动蛋白解聚因子 / 丝切蛋白 cofilin。我们 在 CFA 诱导大鼠炎症痛模型上，对 LIMK 在炎症 热痛敏过程及其对 TRPV1 可能发挥的调控作用进 行了研究。结果显示，随着炎症热痛敏的发生，DRG 组织中 LIMK 激酶活性显著升高，cofilin 磷酸化增 强而活性降低，肌动蛋白聚合为微丝的能力增强 [35]。 相反地，如果抑制 LIMK 激酶活性或敲减其表达， 或通过磷酸化干扰肽 Tat-cofilin-S3 干扰其底物 cofilin 的磷酸化不仅可抑制微丝聚合，还可以发挥对热痛 敏行为的缓解作用。随着 LIMK 功能或 cofilin 磷酸 化被抑制 (cofilin 活性增强→微丝聚合减弱→蛋白 激酶锚定减少 )，TRPV1 通道对辣椒素刺激的反应 性下降，其丝氨酸磷酸化水平降低。综上所述，如 果说 Cdk5 促进 TRPV1 膜定位是通过一种主动的膜 转运调控机制实现的，那么 LIMK 增强 TRPV1 功 能则是通过一种被动的促进受体或离子通道膜定位 的机制来实现。 2 痛情绪的中枢机制研究及TRPV1在其中可 能的作用探讨 慢性痛作为困扰临床的一大顽疾，往往表现出 迁延不愈、反复发作的特点，而关于慢性痛和焦虑、 抑郁共病 (comorbidity) 的现象受到越来越多的关 注 [36, 37]，这也促使我们对慢性痛尤其是痛情绪的中 枢机制展开探讨。 前额叶皮质 (prefrontal cortex) 是一个在决策、 目标导向行为和工作记忆等高级神经活动中发挥重 要作用的脑区，同时又参与痛觉信息处理，那么其 是否可能参与慢性痛中痛感觉或痛情绪的调控呢？ 我们在 CFA 诱导炎症痛模型上的研究显示，CFA 注射后 1 天，大鼠即可产生焦虑样行为，化学损毁 对侧前边缘皮质可同时发挥缓解热痛敏和焦虑样行 为的效应 [38]。电生理学记录显示，模型鼠对侧前边 缘皮质 II/III 层锥体神经元活性明显下降，如果应 用光遗传学技术激活这些神经元，可有效缓解模型 鼠热痛敏和焦虑样行为，相反地，如果抑制这些神 经元的活性，能够在正常小鼠中诱导焦虑样行为， 而对其痛感受无明显影响。在分子机制上，蛋白激 酶 Cdk5 的激活介导了这些神经元内在兴奋性的下 降。敲减对侧前额叶皮质 Cdk5 表达或注射其抑制 剂能够翻转 CFA 诱导的神经元活性下降，同时模 型鼠的热痛敏和焦虑样行为得到缓解。该研究是继 前扣带回 (anterior cingulate cortex) 被提出作为慢性 痛和焦虑相互作用的重要脑区之后 [39]，首次提出前 额叶皮质的前边缘皮质亚区在二者的相互作用中发 挥关键作用。 与我们的研究结果相一致，Lee 等几乎在同期 揭示，光激活前边缘皮质神经元可缓解选择性神经 损伤 (spared nerve injury, SNI) 模型大鼠机械触诱发 痛、热和冷痛敏行为，同时对这些大鼠在糖水偏好 和强迫游泳等实验中表现出的抑郁样行为具有显著 缓解作用 [40]。随着中枢 TRPV1 的功能被越来越多 的研究所揭示，这种在外周热痛觉敏化中发挥关键 作用的分子是否也可能参与到疼痛的中枢调控，尤 其是在我们前述所关注的前额叶皮质部位？在对痛 感觉的影响方面，de Novellis 等报道，脊神经结扎 (spinal nerve ligation, SNL) 术后 7 天大鼠前额叶皮 质之前 / 下边缘皮质亚区 TRPV1 蛋白含量显著上 调，此时若向该部位注射 TRPV1 拮抗剂 I-RTX 可 产生即刻 (< 40 min) 的镇痛效应，大鼠机械抬足阈 值升高约 50%，触诱发痛 (allodynia) 现象减轻 [41]

张瑛等: TRPVI:一种同时参与慢性痛外周敏化和疼痛中枢调制的重要分子 而另一方面,对于前额叶皮质及其前边缘皮质亚过改变辣椒素及其类似物结构中的一些化学基团 区 TRPVI激活参与焦虑情绪的产生也有相关报得到了两种高效、特异的TRPV1受体竞争性拮抗 道2。这些工作虽然只是单方面地对痛感觉或焦剂—KJM429和JYL1421。其中,JYL1421的 虑情绪进行了研究,并未对痛相关的焦虑情绪进行效应更为强大,在抑制辣椒素诱导钙内流方面的 直接的研究,但至少提示了前额叶皮质TRPV1可效应较 capsazepine强60倍,并且JYLl421可同时 能参与痛情绪的产生。 阻断辣椒素、热和低pH值三种不同刺激诱导的 上述过程中TRPV1的激活依赖于其内源性激TRPV激活,而 capsazepine对热和低pH诱导的 动剂 anandamide水平的升高。当 anandamide含量TRPV1反应表现出较弱的拮抗作用。与此同时, 较低时,会优先作用于其高亲和力的大麻素受体1JYL1421避免了 capsazepine所具有的对ATP诱导 ( cannabinoid receptor type I,CB1),抑制焦虑、恐惧钙内流的非特异性抑制效应。因此,JYL1421可能 则可引起 TRPVI的激活并促进焦虑情绪的表·成为较 capsazepine更为优化的 TRPVI受体拮抗剂。 等情绪的表达,而当 anandamide水平进一步升高时 此外,我们还发现两种TRPV1受体部分激动 因此在中枢,发挥兴奋性作用的TRPV1往往与具剂—YL827和JYL1511。这些部分激动剂在 有抑制性作用的大麻素受体发挥着相反或拮抗的作标准条件下仅表现出弱激动剂的特性,容易被误认 用,这也就提示中枢 TRPVI的功能与内源性大麻为拮抗剂,而一旦pH值、温度、受体密度或PKC 素系统有着密切的关系。 激活程度发生变化,它们对TRPV1受体的激动程 度也会随之发生改变,甚至转变为完全激动剂。这 3镇痛药物相关研究 一现象的发现,一方面为今后TRPV1受体拮抗剂 慢性痛是一种难治性疾病,现有镇痛药物疗效的药物筛选起到了警示作用,即筛选过程中需严格 有限,或具有显著的毒副作用而限制其在临床上的控制筛选条件如pH值、温度和受体密度等:另 广泛应用。因此,改善现有镇痛药物,减少其副作用,方面也提示部分激动剂可能具有潜在的临床应用前 比如增强 TRPVI激动剂——辣椒素的镇痛效应,景,在炎症或某些病理情况下,它们的激动作用可 减弱或消除烧灼痛的副作用,也是疼痛研究领域的能随着组织环境的变化而増强,而在正常组织中仍 重要问题 然保持弱的激动作用,因此可能减少药物的毒副作 辣椒素用于镇痛治疗有着悠久的历史,可用于用。该研究为靶向TRPV1受体的镇痛药物研发提 复杂性区域疼痛综合征、疱疹后神经痛、痛性糖供了新思路。 尿病外周神经病和慢性肌肉关节痛等多种疼痛的治 疗。其镇痛作用的主要机制为诱导TRPV失敏,4总结与展望 而在用药初始即受体失敏之前出现的短暂激活现 十余年来的,我们围绕伤害性信息整合分子 象,可使病人产生强烈的烧灼痛,从而妨碍病人的 TRPVI,对其磷酸化调控和膜转运机制展开了 进一步用药。此时,若将辣椒素受体拮抗剂与辣椒系列研究工作,开发出了Tat-KIF13B-T506,Tat- 素合用,拮抗剂可能通过短暂的受体封闭作用而缓TRPV1-T406和Tat- cofilin-S3等具有镇痛作用的短 解烧灼痛感,同时不影响辣椒素诱导TRPV失敏肽物质;在靶向 TRPVI的镇痛药物硏发方面 的效应。遗憾的是,应用最为广泛的TRPV受体得到了两种高效、特异的TRPV1受体竞争性拮抗 拮抗剂— -capsazepine作用强度中等,并且特异剂—KJM429和JYL1421,同时阐明了 TRPVI 性较差,除TRPV1外还可以作用于超极化激活环受体部分激动剂—JYL827和JYL1511的功能特 核苷酸门控通道( hyperpolarization-activated cyclic性(图1)。近年来,我们还在痛情绪的中枢机制研 nucleotide- gated channel,HCN)、上皮钠通道( epithe-究方面取得了一定进展。我们预计,未来慢性痛的 lial Na channel,ENaC)通道和ATP受体等,因外周和脊髓敏化机制以及靶向TRPV的药物研究 此开发作用强、特异性高的TRPV1受体拮抗剂十仍将是疼痛研究领域的重要问题,而随着光遗传学 分必要。 化学遗传学、活体小动物成像等新兴技术的广泛开 我们与美国的 Peter M Blumberg实验室( National展,关于慢性痛的中枢机制也将得到越来越充分的 ancer Institute, Bethesda, Maryland,USA)合作,通认识

张 瑛等：TRPV1：一种同时参与慢性痛外周敏化和疼痛中枢调制的重要分子 681 而另一方面，对于前额叶皮质及其前边缘皮质亚 区 TRPV1 激活参与焦虑情绪的产生也有相关报 道 [42–44]。这些工作虽然只是单方面地对痛感觉或焦 虑情绪进行了研究，并未对痛相关的焦虑情绪进行 直接的研究，但至少提示了前额叶皮质 TRPV1 可 能参与痛情绪的产生。 上述过程中 TRPV1 的激活依赖于其内源性激 动剂 anandamide 水平的升高。当 anandamide 含量 较低时，会优先作用于其高亲和力的大麻素受体 1 (cannabinoid receptor type 1, CB1)，抑制焦虑、恐惧 等情绪的表达，而当 anandamide 水平进一步升高时， 则可引起 TRPV1 的激活并促进焦虑情绪的表达 [43]， 因此在中枢，发挥兴奋性作用的 TRPV1 往往与具 有抑制性作用的大麻素受体发挥着相反或拮抗的作 用，这也就提示中枢 TRPV1 的功能与内源性大麻 素系统有着密切的关系。 3 镇痛药物相关研究 慢性痛是一种难治性疾病，现有镇痛药物疗效 有限，或具有显著的毒副作用而限制其在临床上的 广泛应用。因此，改善现有镇痛药物，减少其副作用， 比如增强 TRPV1 激动剂 —— 辣椒素的镇痛效应， 减弱或消除烧灼痛的副作用，也是疼痛研究领域的 重要问题。 辣椒素用于镇痛治疗有着悠久的历史，可用于 复杂性区域疼痛综合征、疱疹后神经痛、痛性糖 尿病外周神经病和慢性肌肉关节痛等多种疼痛的治 疗 [45]。其镇痛作用的主要机制为诱导 TRPV1 失敏， 而在用药初始即受体失敏之前出现的短暂激活现 象，可使病人产生强烈的烧灼痛，从而妨碍病人的 进一步用药。此时，若将辣椒素受体拮抗剂与辣椒 素合用，拮抗剂可能通过短暂的受体封闭作用而缓 解烧灼痛感，同时不影响辣椒素诱导 TRPV1 失敏 的效应。遗憾的是，应用最为广泛的 TRPV1 受体 拮抗剂 ——capsazepine 作用强度中等，并且特异 性较差，除 TRPV1 外还可以作用于超极化激活环 核苷酸门控通道 (hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel, HCN)、上皮钠通道 (epithe￾lial Na+ channel, ENaC) 通道和 ATP 受体等 [46–48]，因 此开发作用强、特异性高的 TRPV1 受体拮抗剂十 分必要。 我们与美国的Peter M Blumberg实验室(National Cancer Institute, Bethesda, Maryland, USA) 合作，通 过改变辣椒素及其类似物结构中的一些化学基团， 得到了两种高效、特异的 TRPV1 受体竞争性拮抗 剂 ——KJM429 和 JYL1421[49]。其中，JYL1421 的 效应更为强大，在抑制辣椒素诱导钙内流方面的 效应较 capsazepine 强 60 倍，并且 JYL1421 可同时 阻断辣椒素、热和低 pH 值三种不同刺激诱导的 TRPV1 激活，而 capsazepine 对热和低 pH 诱导的 TRPV1 反应表现出较弱的拮抗作用。与此同时， JYL1421 避免了 capsazepine 所具有的对 ATP 诱导 钙内流的非特异性抑制效应。因此，JYL1421 可能 成为较 capsazepine 更为优化的 TRPV1 受体拮抗剂。 此外，我们还发现两种 TRPV1 受体部分激动 剂 ——JYL827 和 JYL1511[50]。这些部分激动剂在 标准条件下仅表现出弱激动剂的特性，容易被误认 为拮抗剂，而一旦 pH 值、温度、受体密度或 PKC 激活程度发生变化，它们对 TRPV1 受体的激动程 度也会随之发生改变，甚至转变为完全激动剂。这 一现象的发现，一方面为今后 TRPV1 受体拮抗剂 的药物筛选起到了警示作用，即筛选过程中需严格 控制筛选条件如 pH 值、温度和受体密度等 ；另一 方面也提示部分激动剂可能具有潜在的临床应用前 景，在炎症或某些病理情况下，它们的激动作用可 能随着组织环境的变化而增强，而在正常组织中仍 然保持弱的激动作用，因此可能减少药物的毒副作 用。该研究为靶向 TRPV1 受体的镇痛药物研发提 供了新思路。 4 总结与展望 十余年来的，我们围绕伤害性信息整合分子 —— TRPV1，对其磷酸化调控和膜转运机制展开了 系 列 研究工作，开发出了 Tat-KIF13B-T506，Tat￾TRPV1-T406 和 Tat-cofilin-S3 等具有镇痛作用的短 肽物质 ；在靶向 TRPV1 的镇痛药物研发方面， 得到了两种高效、特异的 TRPV1 受体竞争性拮抗 剂 ——KJM429 和 JYL1421，同时阐明了 TRPV1 受体部分激动剂 ——JYL827 和 JYL1511 的功能特 性 ( 图 1)。近年来，我们还在痛情绪的中枢机制研 究方面取得了一定进展。我们预计，未来慢性痛的 外周和脊髓敏化机制以及靶向 TRPV1 的药物研究 仍将是疼痛研究领域的重要问题，而随着光遗传学、 化学遗传学、活体小动物成像等新兴技术的广泛开 展，关于慢性痛的中枢机制也将得到越来越充分的 认识

生理学报 Acta Physiologica Sinica, October25,2017,695):677-684 partial agonist titive antagonist JYL827 and JYL1511 JYL1421 Na’,c cellula hosphorylational modification TRPV1 ntracellula Cdk5 PKD1 PKA, PKC and CaMKll et membrane localization motor protein Cdk5 cytoskeleton near the plasma membrane KF13B+T506 Tat-T506 actin polymerization post-Golgi trafficking icles cont TRPV1 Tat-S3 图1.本研究组关于TRPV1外周调控机制的工作总结图 Fig. 1. Summary of the studies on the regulatory mechanisms of peripheral TRPVI in our lab. TRPVI can be phosphory lated by rotein kinases, including Cdk5 and PKDl, and the anchoring of these protein kinases on the cytoskeleton is modulated by LIMK. On the other hand, Cdks can phosphorylate the motor protein KIF13B and promotes the membrane trafficking of TRPVI. Application of the technique of Tat-transmembrane peptide can specifically disrupt the above phosphorylation process. In addition, our lab partici- pated in the development of the partial agonists of TRPV1, JYL827 and JYL1511, and the competitive antagonist JYL1421. CaMKll, alcium-calmodulin dependent kinase Il; Cdk5, cyclin-dependent kinase 5; KIF 13B, kinesin-like protein 13B; LIMK, LIM-motif containing kinase; PKA, protein kinase A; PKC, protein kinase C; PKDl, protein kinase DI; Tat-T506, Tat-KIF13B-T506 Tat-T406 Tat-TRPV1-T406: Tat-S3. Tat-cofilin-S3 参考文献 therapy for management of chronic pain: from bench to I Williams AC, Craig KD. Updating the definition of pain. bedside. Lancet Neurol 2013: 12(11): 1084-1095 Pan2016;157(11):2420-2423 8 Julius D. TRP channels and pain. Annual Rev Cell Dev biol 2 Goldberg DS, McGee SJ, Pain as a global public health priority. BMC Public Health 2011; 11: 770 9 Caterina M, Leffler A, Malmberg AB, Martin WJ, Trafton J 3 Knaster P, Karlsson H, Estlander AM, Kalso E Psychiatric Petersen-Zeitz KR, Koltzenburg M, Basbaum Al, Julius D disorders as assessed with SCid in chronic pain patients: the Impaired nociception and pain sensation in mice lacking the anxiety disorders precede the onset of pain. Gen Hosp capsaicin receptor. Science 2000; 288(5464): 306-313 Psychiatry2012;34(1):46-52 10 Davis JB, Gray J, Gunthorpe MJ, Hatcher JP, Davey PT, Nociceptor sensitization in pain Overend P, Harries MH, Latcham J, Clapham C, Atkinson K, pathogenesis. Nat Med 2010: 16(11): 1248-1257 Hughes SA, Rance K, Grau E, Harper AJ, Pugh PL, Rogers 5 Kuner R Central mechanisms of pathological pain. Nat Med DC, Bingham S, Randall A, Sheardown SA Vanilloid recep- 2010,16(11):1258-1266 tor-l is essential for inflammatory thermal hyperalgesia 6 Rask-Andersen M, Zhang j, Fabbro D, HB. Advances ature2000,405(6783):183-187 in kinase targeting: current clinical 11 Park U, Vastani N, Guan Y, Raja SN, Koltzenburg M, Caterina Trends Pharmacol Sci 2014; 35(11): 604-620 MJ. TRP vanilloid 2 knock-out mice are susceptible to peri- 7 Gilron I, Jensen TS, Dickenson AH Combination pharmaco- natal lethality but display normal thermal and mechanical

682 生理学报 Acta Physiologica Sinica, October 25, 2017, 69(5): 677–684 参考文献 1 Williams AC, Craig KD. Updating the definition of pain. Pain 2016; 157(11): 2420–2423. 2 Goldberg DS, McGee SJ. Pain as a global public health priority. BMC Public Health 2011; 11: 770. 3 Knaster P, Karlsson H, Estlander AM, Kalso E. Psychiatric disorders as assessed with SCID in chronic pain patients: the anxiety disorders precede the onset of pain. Gen Hosp Psychiatry 2012; 34(1): 46–52. 4 Gold MS, Gebhart GF. Nociceptor sensitization in pain pathogenesis. Nat Med 2010; 16(11): 1248–1257. 5 Kuner R. Central mechanisms of pathological pain. Nat Med 2010; 16(11): 1258–1266. 6 Rask-Andersen M, Zhang J, Fabbro D, Schioth HB. Advances in kinase targeting: current clinical use and clinical trials. Trends Pharmacol Sci 2014; 35(11): 604–620. 7 Gilron I, Jensen TS, Dickenson AH. Combination pharmaco￾therapy for management of chronic pain: from bench to bedside. Lancet Neurol 2013; 12(11): 1084–1095. 8 Julius D. TRP channels and pain. Annual Rev Cell Dev Biol 2013; 29: 355–384. 9 Caterina MJ, Leffler A, Malmberg AB, Martin WJ, Trafton J, Petersen-Zeitz KR, Koltzenburg M, Basbaum AI, Julius D. Impaired nociception and pain sensation in mice lacking the capsaicin receptor. Science 2000; 288(5464): 306–313. 10 Davis JB, Gray J, Gunthorpe MJ, Hatcher JP, Davey PT, Overend P, Harries MH, Latcham J, Clapham C, Atkinson K, Hughes SA, Rance K, Grau E, Harper AJ, Pugh PL, Rogers DC, Bingham S, Randall A, Sheardown SA. Vanilloid recep￾tor-1 is essential for inflammatory thermal hyperalgesia. Nature 2000; 405(6783): 183–187. 11 Park U, Vastani N, Guan Y, Raja SN, Koltzenburg M, Caterina MJ. TRP vanilloid 2 knock-out mice are susceptible to peri￾natal lethality but display normal thermal and mechanical 图 1. 本研究组关于TRPV1外周调控机制的工作总结图 Fig. 1. Summary of the studies on the regulatory mechanisms of peripheral TRPV1 in our lab. TRPV1 can be phosphorylated by protein kinases, including Cdk5 and PKD1, and the anchoring of these protein kinases on the cytoskeleton is modulated by LIMK. On the other hand, Cdk5 can phosphorylate the motor protein KIF13B and promotes the membrane trafficking of TRPV1. Application of the technique of Tat-transmembrane peptide can specifically disrupt the above phosphorylation process. In addition, our lab partici￾pated in the development of the partial agonists of TRPV1, JYL827 and JYL1511, and the competitive antagonist JYL1421. CaMKII, calcium-calmodulin dependent kinase II; Cdk5, cyclin-dependent kinase 5; KIF13B, kinesin-like protein 13B; LIMK, LIM-motif containing kinase; PKA, protein kinase A; PKC, protein kinase C; PKD1, protein kinase D1; Tat-T506, Tat-KIF13B-T506; Tat-T406, Tat-TRPV1-T406; Tat-S3, Tat-cofilin-S3

张瑛等:TRPV1:一种同时参与慢性痛外周敏化和疼痛中枢调制的重要分子 nociception. J Neurosci 2011; 31(32): 11425-11436 Phosphorylation of vanilloid receptor I by Ca /calmodulin- 12 Peier AMI, Reeve AJ, Andersson DA, Moqrich A, Earley dependent kinase Il regulates its vanilloid binding. J Biol TJ, Hergarden AC, Story GM, Colley S, Hogenesch JB Chem2004;279(8):7048-7054 Mclntyre P, Bevan S, Patapoutian AA heat-sensitive TRP 25 Wang Y, Kedei N, Wang M, Wang QJ, Huppler AR, Toth A hannel expressed in keratinocytes. Science 2002: 296 Tran R, Blumberg PM. Interaction between protein kinase (5575):2046-2049 Cmu and the vanilloid receptor type 1. J Biol Chem 2004 13 Cheng X, Jin J, Hu L, Shen D, Dong XP, Samie MA, Knoff J, 279(51):53674-53682 Eisinger B, Liu ML, Huang SM, Caterina MJ, Dempsey P, 26 Sundram V, Chauhan SC, Jaggi M. Emerging roles of protein Michael LE, Dlugosz AA, Andrews NC, Clapham DE, Xu H kinase DI in cancer. Mol Cancer Res 2011; 9(8): 985-996 TRP channel regulates EGFR signaling in hair morphogenesis 27 Zhu H, Yang Y, Zhang H, Han Y, Li Y, Zhang Y, Yin D, He Q, and skin barrier formation. Cell 2010, 141(2): 331-343 Zhao z, Blumberg PM, Han J, Wang Y Interaction between 14 Guler AD, Lee H, lida T, Shimizu l, Tominaga M, Caterina M. protein kinase DI and transient receptor potential VI in primary Heat-evoked activation of the ion channel. trPv4. J Neurosci sensory neurons is involved in heat hypersensitivity. Pain 2002;22(15):6408-6414 2008,137(3):574-588 15 Liedtke W, Friedman JM. Abnormal osmotic regulation in 28 Amadesi S, Grant AD, Cottrell GS, Vaksman N, Poole DP, trpv4-/-mice. Proc Natl Acad Sci U S A 2003: 100(23) Rozengurt E, Bunnett NW. Protein kinase D isoforms are 13698-13703 expressed in rat and mouse primary sensory neurons and are 16 Cho H, Yang YD, Lee J, Lee b, Kim T, Jang Y, Back SK, Na activated by agonists of protease-activated receptor 2.J HS, Harfe BD, Wang F, Raouf R, Wood JN, Oh U. The Comp Neurol2009;516(2):141-156 calcium-activated chloride channel anoctamin I acts as a 29 Pareek TK, Keller J, Kesavapany S, Pant HC, ladarola MJ, heat sensor in nociceptive neurons. Nat Neurosci 2012 Brady RO, Kulkarni AB Cyclin-dependent kinase 5 activity 15(7):1015-1021 regulates pain signaling. Proc Natl Acad Sci U S A 2006, 17 Noel J, Zimmermann K, Busserolles J, Deval E, Alloui A, 103(3):791-796 Diochot S, Guy N, Borsotto M, Reeh P, Eschalier A, Laz- 30 Yang YR, He Y, Zhang Y,Li Y, Li Y, Han Y, Zhu H, Wang Y. dunski M. The mechano-activated K channels TRAAK and Activation of cyclin-dependent kinase 5(Cdk5) in primary TREK-1 control both warm and cold perception. EMBO J sensory and dorsal horn neurons by peripheral inflammation 2009,28(9):1308-1318. contributes to heat hyperalgesia. Pain 2007: 127(1-2): 109- 18 Viens J, Owsianik G, Hofmann T, Philipp SE, Stab J, Chen X, Benoit M, Xue F, Janssens A, Kerselaers S, Oberwinkler 31 Pareek TK, Keller J, Kesavapany S, Agarwal N, Kuner R, J, Vennekens R, Gudermann T, Nilius B, Voets T TRPM3 is Pant HC, ladarola MJ, Brady RO, Kulkarni AB Cyclin- a nociceptor channel involved in the detection of noxious dependent kinase 5 modulates nociceptive signaling through heat. Neuron2011;7003):482494 direct phosphorylation of transient receptor potential vanil- 19 Pogorzala LA, Mishra SK, Hoon MA. The cellular code for loid 1. Proc Natl Acad SciU SA2007: 104(2): 660-665. mammalian thermosensation. J Neurosci 2013: 33(13): 32 Xing BM, Yang YR, Du JX, Chen HJ, Qi C, Huang ZH, 5533-5541 Zhang Y, Wang Y Cyclin-dependent kinase 5 controls 20 Ran C, Hoon MA, Chen X. The coding of cutaneous TRPVI membrane trafficking and the heat sensitivity of temperature in the spinal cord. Nat Neurosci 2016: 19(9) ociceptors through KIF13B. J Neurosci 2012; 32(42) 1201-1209 14709-14721 21 Bhave G, Zhu W, Wang H, Brasier DJ, Oxford GS, Gereau 33 Liu J, Du J, Yang Y, Wang Y Phosphorylation of TRPVI by RW 4th CAMP-dependent protein kinase regulates desensi- cyclin-dependent kinase 5 promotes TRPVI surface local- tization of the capsaicin receptor (VRi) by direct phosph ization, leading to inflammatory thermal hyperalgesia. Exp vation. Neuron2002;35(4):721-731 22 Premkumar LS, Ahern GP. Induction of vanilloid receptor 34 Jendryke T, Prochazkova M, Hall BE, Nordmann GC channel activity by protein kinase C. Nature 2000: 408 Schladt m. milenkovic vM. Kulkarni aB. Wetzel Ch (6815):985-990. TRPVI function is modulated by Cak5-mediated phosphor- 23 Bonnington JK, McNaughton PA. Signalling pathways ylation: insights into the molecular mechanism of nocicep- nvolved in the sensitisation of mouse nociceptive neurones tion. Sci Rep 2016: 6: 22007 by nerve growth factor J Physiol 2003: 551(Pt 2): 433-446. 35 Li Y, Hu F, Chen H, Du YJ, Xie ZY, Zhang Y, Wang J, 24 Jung J, Shin JS, Lee SY, Hwang Sw, Koo J, Cho H, Oh U Wang Y. LIMK-dependent actin polymerization in primary

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