氯仿/异戊醇 50ml 11)周定/终止液 冰醋酸150mL,蒸馆水1350mL 12)显影液（使用前5h配制） 2L蒸馏水中加60ga2C03,冷却至4℃。使用前5min加A37%甲醛3L,10g /mLNa2S203400ul。 13)染色液（使用前10min配制 2L水中加入2 gAgNO:3和37%甲醛3L,混合后即可使用。 三、方法和步彈 1.种子或幼苗DNA提取纯化 取干种子，放入研体内，迅速磨碎并转入1.5ml的离心管中，加600ul2×Extraction Buffer,55℃水浴40min。冷却至室温，加入等体积的氯仿/异戊醇，13000rpm、15℃离心 15min。取上清液加入1/10体积的10%CTAB Solution、等体积的氯仿/异戊醇，13000rpm、 15℃离心l5min。取上清液加入等体积的preeiritation Buffer,室温下静置30min以上， 5500rpm、4C离心10min,沉淀DNM。沉淀稍干后，加入300 ul high salt TE溶解，37℃ 水浴1r以上。酚/氯仿抽提一次，异丙醉沉淀DA,70%酒精、无水酒精清洗，空气干燥， 加入50ulTE,-20C贮存备用。 玉米种子的DNA简易提取：将单粒干种子的胚剥下，放入1.5ml离心管中，加入300u1 氯仿后研磨，然后加入300 u1DNA提取液(100 mMTris--HCL,100 mM EDTA8.0,500 mM NaCl, 1.5%SDS)混匀后于1000r/ain离心2min,吸上清液加入预先装有300u1异丙醇和300 ulNaC1 500Mm离心管中，等DNM成团后用灭菌枪尖挑出，经70%乙醇洗涤后加入200u1TE8.0,待 充分溶解后备用。 2.DNA质量检测 紫外分光光度计测定模板DNA的0D260/OD280值和浓度 3.PCR反应条件和扩增程序： (1)PCR反应条件10ul反应体积包括2.0ul5 XPCRBuffer,0.6 ul MgC12,0.8 ldNTP 1.0ul3'和5段引物，0.1 ulTaqDNA聚合酶，1.0ul(约10ng)的模板DNA。 (2)扩增程序在PTC-200 Peltier Thermal cycler上进行扩增，扩增程序为：94℃ 预变性45s,94℃下45s:56℃下45s:72℃下1min:30个循环，最后728min,4℃保存。 (3)随机引物 氯仿/异戊醇 50ml 11）固定／终止液 冰醋酸 150 mL，蒸馏水 1350 mL。 12）显影液(使用前 5 h 配制) 2 L 蒸馏水中加 60 gNa2CO3，冷却至 4℃。使用前 5 min 加 A 37％甲醛 3 mL，10 mg ／mL Na2S203 400 uL。 13）染色液(使用前 10 min 配制) 2 L 水中加入 2 gAgNO3 和 37％甲醛 3 mL，混合后即可使用。 三、方法和步骤 1.种子或幼苗 DNA 提取纯化 取干种子，放入研钵内，迅速磨碎并转入 1.5ml 的离心管中，加 600ul 2×Extraction Buffer，55℃水浴 40 min。冷却至室温，加入等体积的氯仿/异戊醇，13000rpm、15℃离心 15 min。取上清液加入 l/10 体积的 10％ CTAB Solution、等体积的氯仿/异戊醇，13000 rpm、 15℃离心 15min。取上清液加入等体积的 preeiritation Buffer，室温下静置 30min 以上， 5500rpm、4℃离心 10min，沉淀 DNA。沉淀稍干后，加入 300 ul high salt TE 溶解，37℃ 水浴 lhr 以上。酚/氯仿抽提一次，异丙醉沉淀 DNA，70％酒精、无水酒精清洗，空气干燥, 加入 50 ul TE，-20℃贮存备用。 玉米种子的 DNA 简易提取：将单粒干种子的胚剥下，放入 1.5ml 离心管中，加入 300ul 氯仿后研磨，然后加入 300ulDNA 提取液（100mMTris-HCL,100mM EDTA 8.0, 500mM NaCl, 1.5%SDS）混匀后于 1000r/min 离心 2min，吸上清液加入预先装有 300ul 异丙醇和 300ulNaCl 500Mm 离心管中，等 DNA 成团后用灭菌枪尖挑出，经 70%乙醇洗涤后加入 200ulTE 8.0，待 充分溶解后备用。 2.DNA 质量检测 紫外分光光度计测定模板 DNA 的 OD260/OD280 值和浓度 3.PCR 反应条件和扩增程序： （1）PCR 反应条件 10ul 反应体积包括 2.0ul 5XPCR Buffer，0.6ul MgCl2，0.8ul dNTP， 1.0ul3'和 5'段引物，0.1ulTaqDNA 聚合酶，1.0ul(约 10ng)的模板 DNA。 （2）扩增程序 在 PTC-200 Peltier Thermal cycler 上进行扩增，扩增程序为:94℃ 预变性 45s，94℃下 45s;56℃下 45s;72℃下 lmin;30 个循环，最后 72 8min，4℃保存。 （3）随机引物