实验七品种真实性的SSR分子标记分析 一、目的要求 (①)通过实验操作或现场参观了解品种真实性SSR分子标记分析的基本仪器设备、引物 和步骤。 (②)学会从紫外光观察识别分子标记电泳图谱或照片图谱，能识别和判断品种图谱的差 异。 二、材料用具 1.试材种子或幼苗 2.用具离心机、离心管、紫外分光光度计、微量移液器、吸头、吸水纸、水浴锅、 冰箱、研体、液氨能、电子天平、州计、高压灭菌锅、一次性手套和口罩、电泳仪及电泳 槽、PCR仪、各种规格的微量移液器及吸管、PCR管及管架、L.5L离心管及管架、记号笔、 磁力搅拌器、三角瓶、紫外透射仪及凝胶成像系统等。 3.试剂 三经甲基氨基甲烷们(Tris),CTAB,十二烷基硫酸钠(SDS),乙二胺四乙酸二钠盐 (DT),HCI,硼酸，氯化钠，氧化纳，硫基乙醉OE),无水乙醇，氯仿，异丙醇，异戊醇 饱和酚，RnaseA,5 X PCR Buffer:80mol/L(NH)S04,335mo/1Tris-HCIph8.8), MgC12(25mol/1,dNTP(1.25mol/1),Taq酶(5U/1),SSR引物，溴化乙锭 4.溶液配制 1)1M Tris-HCI (PH8.0) 称取Tris30.275g溶于200ml水，用浓HCI调PH至8.0，降到室温后，定溶至250ml, 高压灭菌，4℃保存。 2)0.5MDTA(PH8.0) 称取EDTA18.61g溶于80ml水，磁力搅拌器搅拌，用a0H调PH至8.0，定溶至100 ml,高压灭菌，4℃保存。 3)2X Extracation Buffer 100ML 2%CTAB 2.0g 100mM Tris-HCI(PH8.0) 10 ml IM Tris-HCI(PH8.0) 20 mM EDTA (PH8.0) 4ml 0.5M EDTA(PH8.0) 1.4 M NaCI 8.186g
实验七 品种真实性的 SSR 分子标记分析 一、目的要求 (1)通过实验操作或现场参观了解品种真实性 SSR 分子标记分析的基本仪器设备、引物 和步骤。 (2)学会从紫外光观察识别分子标记电泳图谱或照片图谱，能识别和判断品种图谱的差 异。 二、材料用具 1．试材 种子或幼苗 2．用具 离心机、离心管、紫外分光光度计、微量移液器、吸头、吸水纸、水浴锅、 冰箱、研钵、液氮罐、电子天平、pH 计、高压灭菌锅、一次性手套和口罩、电泳仪及电泳 槽、PCR 仪、各种规格的微量移液器及吸管、PCR 管及管架、1.5 mL 离心管及管架、记号笔、 磁力搅拌器、三角瓶、紫外透射仪及凝胶成像系统等。 3．试剂 三经甲基氨基甲烷们(Tris)，CTAB，十二烷基硫酸钠(SDS)，乙二胺四乙酸二钠盐 (EDTA)，HCl，硼酸，氯化钠，氧化纳，硫基乙醉(ME)，无水乙醇，氯仿，异丙醇，异戊醇， 饱和酚，RnaseA， 5 X PCR Buffer：80mmol/L（NH4）SO4，335mmo/l Tris-HCIph8.8）， MgC12(25mmol/l， dNTP(1.25nmol/l)，Taq 酶（5U/ul），SSR 引物，溴化乙锭 4. 溶液配制 1）1M Tris-HCI(PH8.0) 称取 Tris 30.275g 溶于 200 ml 水，用浓 HCI 调 PH 至 8.0，降到室温后，定溶至 250ml， 高压灭菌，4℃保存。 2）0.5 M EDTA(PH8.0) 称取 EDTA 18.61g 溶于 80 ml 水，磁力搅拌器搅拌，用 NaOH 调 PH 至 8.0，定溶至 100 ml，高压灭菌，4℃保存。 3）2X Extracation Buffer 100ML 2%CTAB 2.0g 100mM Tris-HCI(PH8.0) 10 ml 1M Tris-HCI(PH8.0) 20 mM EDTA(PH8.0) 4ml 0.5M EDTA(PH8.0) 1.4 M NaCI 8.186g
2%ME 1.8ml 4)10%CTAB Solutionl 0.7M NaCl 2.046g 10%CTAB 1.0g 5)Preeiritaion Buffer 100ml 1%CTAB 1.0g 50mMTris-HCl(PH8.0)5ml 1M Tris-HCl(PH8.0) 10mM EDTA(PH8.0) 2ml 0.5M EDTA (PH8.0) 1%ME 0.9a1 6)High Salt TE 100ml 10mM Tris-HCl(PH8.0)1.0ml 1MTris-HCl(PH8.0) 1mM EDTA (PH8.0) 0.2 ml 0.5M EDTA (PH8.0) 1M NaCl 5.844g 0.1%SS 0.1g lug/ml RNase 10.0ul 10mg/ml RnaseA 7)TE Buffer 100ml 10mM Tris-HCI (PH8.0)1.0ml 1M Tris-HCI(PH8.0) 1mM EDTA(PH8.O) 0.2m1 0.5M EDTA (FH8.0) 8)TBE Buffer(5X)1000ml Tris 54.0g 硼酸 27.5g EDTA 20.0ml 0.5M EDTA(PH8.0) 9)上样Buffer(6x) 100a1 0.25%溴酚兰 0.2g 40%旅糖 40.0g 10)氯仿/异戊醉(24：1)100ml 氯仿 96ml 异戊醉 41 11)酚氯仿(25：24：1)100ml 饱和酚
2% ME 1.8ml 4）10% CTAB Solutionl 0.7M NaCl 2.046g 10% CTAB 1.0g 5）Preeiritaion Buffer 100ml l%CTAB 1.0g 50mMTris-HCl(PH8.0) 5ml 1M Tris-HCl(PH8.0) 10mM EDTA(PH8.0) 2ml O.5M EDTA〔PH8.O〕 1%ME 0.9ml 6）High Salt TE 100ml 10mM Tris-HCl(PH8.0) 1.0ml 1MTris-HCl(PH8.0) 1mM EDTA(PH8.0) 0.2 ml 0.5M EDTA(PH8.0) 1M NaCl 5.844g 0.1%SDS 0.1g 1ug/ml RNase 10.0ul 10mg/ml RnaseA 7）TE Buffer 100ml 10mM Tris-HCl(PH8.0) 1.0ml 1M Tris-HCl(PH8.0) lmM EDTA(PH8.O) 0.2ml 0.5M EDTA(FH8.0) 8）TBE Buffer(5X) l000ml Tris 54.0g 硼酸 27.5g EDTA 20.0ml 0.5M EDTA(PH8.0) 9）上样 Buffer(6x) 100ml 0.25%溴酚兰 0.2g 40%蔗糖 40.0g 10）氯仿/异戊醉(24:1) 100ml 氯仿 96ml 异戊醉 4ml 11）酚氯仿(25:24:l) l00ml 饱和酚 50ml
氯仿/异戊醇 50ml 11)周定/终止液 冰醋酸150mL,蒸馆水1350mL 12)显影液（使用前5h配制） 2L蒸馏水中加60ga2C03,冷却至4℃。使用前5min加A37%甲醛3L,10g /mLNa2S203400ul。 13)染色液（使用前10min配制 2L水中加入2 gAgNO:3和37%甲醛3L,混合后即可使用。 三、方法和步彈 1.种子或幼苗DNA提取纯化 取干种子，放入研体内，迅速磨碎并转入1.5ml的离心管中，加600ul2×Extraction Buffer,55℃水浴40min。冷却至室温，加入等体积的氯仿/异戊醇，13000rpm、15℃离心 15min。取上清液加入1/10体积的10%CTAB Solution、等体积的氯仿/异戊醇，13000rpm、 15℃离心l5min。取上清液加入等体积的preeiritation Buffer,室温下静置30min以上， 5500rpm、4C离心10min,沉淀DNM。沉淀稍干后，加入300 ul high salt TE溶解，37℃ 水浴1r以上。酚/氯仿抽提一次，异丙醉沉淀DA,70%酒精、无水酒精清洗，空气干燥， 加入50ulTE,-20C贮存备用。 玉米种子的DNA简易提取：将单粒干种子的胚剥下，放入1.5ml离心管中，加入300u1 氯仿后研磨，然后加入300 u1DNA提取液(100 mMTris--HCL,100 mM EDTA8.0,500 mM NaCl, 1.5%SDS)混匀后于1000r/ain离心2min,吸上清液加入预先装有300u1异丙醇和300 ulNaC1 500Mm离心管中，等DNM成团后用灭菌枪尖挑出，经70%乙醇洗涤后加入200u1TE8.0,待 充分溶解后备用。 2.DNA质量检测 紫外分光光度计测定模板DNA的0D260/OD280值和浓度 3.PCR反应条件和扩增程序： (1)PCR反应条件10ul反应体积包括2.0ul5 XPCRBuffer,0.6 ul MgC12,0.8 ldNTP 1.0ul3'和5段引物，0.1 ulTaqDNA聚合酶，1.0ul(约10ng)的模板DNA。 (2)扩增程序在PTC-200 Peltier Thermal cycler上进行扩增，扩增程序为：94℃ 预变性45s,94℃下45s:56℃下45s:72℃下1min:30个循环，最后728min,4℃保存。 (3)随机引物
氯仿/异戊醇 50ml 11）固定／终止液 冰醋酸 150 mL，蒸馏水 1350 mL。 12）显影液(使用前 5 h 配制) 2 L 蒸馏水中加 60 gNa2CO3，冷却至 4℃。使用前 5 min 加 A 37％甲醛 3 mL，10 mg ／mL Na2S203 400 uL。 13）染色液(使用前 10 min 配制) 2 L 水中加入 2 gAgNO3 和 37％甲醛 3 mL，混合后即可使用。 三、方法和步骤 1.种子或幼苗 DNA 提取纯化 取干种子，放入研钵内，迅速磨碎并转入 1.5ml 的离心管中，加 600ul 2×Extraction Buffer，55℃水浴 40 min。冷却至室温，加入等体积的氯仿/异戊醇，13000rpm、15℃离心 15 min。取上清液加入 l/10 体积的 10％ CTAB Solution、等体积的氯仿/异戊醇，13000 rpm、 15℃离心 15min。取上清液加入等体积的 preeiritation Buffer，室温下静置 30min 以上， 5500rpm、4℃离心 10min，沉淀 DNA。沉淀稍干后，加入 300 ul high salt TE 溶解，37℃ 水浴 lhr 以上。酚/氯仿抽提一次，异丙醉沉淀 DNA，70％酒精、无水酒精清洗，空气干燥, 加入 50 ul TE，-20℃贮存备用。 玉米种子的 DNA 简易提取：将单粒干种子的胚剥下，放入 1.5ml 离心管中，加入 300ul 氯仿后研磨，然后加入 300ulDNA 提取液（100mMTris-HCL,100mM EDTA 8.0, 500mM NaCl, 1.5%SDS）混匀后于 1000r/min 离心 2min，吸上清液加入预先装有 300ul 异丙醇和 300ulNaCl 500Mm 离心管中，等 DNA 成团后用灭菌枪尖挑出，经 70%乙醇洗涤后加入 200ulTE 8.0，待 充分溶解后备用。 2.DNA 质量检测 紫外分光光度计测定模板 DNA 的 OD260/OD280 值和浓度 3.PCR 反应条件和扩增程序： （1）PCR 反应条件 10ul 反应体积包括 2.0ul 5XPCR Buffer，0.6ul MgCl2，0.8ul dNTP， 1.0ul3'和 5'段引物，0.1ulTaqDNA 聚合酶，1.0ul(约 10ng)的模板 DNA。 （2）扩增程序 在 PTC-200 Peltier Thermal cycler 上进行扩增，扩增程序为:94℃ 预变性 45s，94℃下 45s;56℃下 45s;72℃下 lmin;30 个循环，最后 72 8min，4℃保存。 （3）随机引物
参考有关文献序列合成 (4)扩增产物观察： ①琼酯糖电泳 反应物在3.0%的Metaphor琼脂糖凝胶上电泳，分子量标准为10 Obp DNA ladder Plus(MB),经溴化乙锭染色，紫外灯下观察并照相记录或用凝胶成像系统扫描，并输入计 算机进行编辑处理。 ②变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 A凝胶的制备及电泳 1)玻璃板处理 用去污剂和清水将玻璃板洗涤干净，并用去离子水冲洗，最后用95%乙醇擦拭、干燥： 取0.4m的边条，置于左右两侧，将短板压于其上，用夹子固定，插好梳子，准备灌胶。 2)制备凝胶 配置100L6%的变性聚丙烯酰胺凝胶：加入40%丙烯酰胺15L,尿素42g,5XTBE 20.0L,10%过硫酸铵0.45L,0.1 mLTEMED,用蒸馏水定容到100L,充分混匀。 3》灌胶 用注射器吸取上述溶液，排除针管内的空气，将注射器嘴插入两块玻璃板的空隙处，把 溶液注入其中，避免产生气泡。把玻璃板斜靠在试管架上，可减少泄露和凝胶的变形。立即 插入梳子，避免梳齿下产生气泡。让丙烯酰胺于室温下聚合1。聚合好的凝胶可在使用前 贮放1-2d,需用1XTBE浸湿的纸巾包住梳子及凝胶顶端，再用保鲜膜包好，贮于4℃。 4)预电泳 胶聚合以后，将玻璃板安装在电泳仪上，电泳槽中加入足最的1XTBE缓冲液。小心移 去梳子，用蒸馏水清洗加样孔，80W恒功率预电泳30mn,以去除气泡， 5)点样 把DA样品与适量6X凝胶加样缓冲液混合，95℃变性5in,立即置于冰上冷却待用， 每个加样孔3-5ul样品DNA。 6)电泳 70恒功率电泳，溴酚蓝至胶的3/4处时，终止电泳。 B.银染检测 1)固定（脱色） 在托盘1中加入1.5L固定/终止液，将有胶的玻璃板放入托盘中，轻摇直到胶全部脱
参考有关文献序列合成 (4)扩增产物观察： ①琼酯糖电泳 反应物在 3.0%的 Metaphor 琼脂糖凝胶上电泳。分子量标准为 l00bp DNA ladder Plus(MBI)，经溴化乙锭染色，紫外灯下观察并照相记录或用凝胶成像系统扫描，并输入计 算机进行编辑处理。 ②变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 A.凝胶的制备及电泳 1)玻璃板处理 用去污剂和清水将玻璃板洗涤干净，并用去离子水冲洗，最后用 95％乙醇擦拭、干燥； 取 0.4 mm 的边条，置于左右两侧，将短板压于其上，用夹子固定，插好梳子，准备灌胶。 2)制备凝胶 配置 100 mL 6％的变性聚丙烯酰胺凝胶：加入 40％丙烯酰胺 15 mL，尿素 42 g，5 X TBE 20．0 mL，10％过硫酸铵 0.45 mL，0.1 mLTEMED，用蒸馏水定容到 100 mL，充分混匀。 3)灌胶 用注射器吸取上述溶液，排除针管内的空气，将注射器嘴插入两块玻璃板的空隙处，把 溶液注入其中，避免产生气泡。把玻璃板斜靠在试管架上，可减少泄露和凝胶的变形。立即 插入梳子，避免梳齿下产生气泡。让丙烯酰胺于室温下聚合 1 h。聚合好的凝胶可在使用前 贮放 1-2 d，需用 1 X TBE 浸湿的纸巾包住梳子及凝胶顶端，再用保鲜膜包好，贮于 4℃。 4)预电泳 胶聚合以后，将玻璃板安装在电泳仪上，电泳槽中加入足量的 1 X TBE 缓冲液。小心移 去梳子，用蒸馏水清洗加样孔，80 W 恒功率预电泳 30 min，以去除气泡。 5)点样 把 DNA 样品与适量 6X 凝胶加样缓冲液混合，95℃变性 5 min，立即置于冰上冷却待用， 每个加样孔 3—5ul 样品 DNA。 6)电泳 70 W 恒功率电泳，溴酚蓝至胶的 3／4 处时，终止电泳。 B.银染检测 1)固定(脱色) 在托盘 1 中加入 1.5 L 固定／终止液，将有胶的玻璃板放入托盘中，轻摇直到胶全部脱
色：也可将胶在溶液中浸泡过夜（不摇动）。将溶液回收待用。 2)洗胶 在托盘2中用1.5L蒸馏水洗凝胶3次，每次3mi。在将玻板取出时，让玻板竖直滴 千水10~20s。 3)染色 在托盘3内加入1.5L染色液，将胶板放入托盘中轻摇30min。 4)洗胶 将胶浸入托盘2中，快速摇晃数秒，拿出，滴干水，立即将胶置于配制好的显色液中。 注意，从将胶置于水中到将其放人显色液中，时间不超过5~10s。 5)显影 轻摇显色液，直至胶上所有的条带都出现。 6)定影（终止显色） 将回收的固定/终止液倒人显色液中，反应2~3min。 (7)洗胶 将胶板用蒸馏水洗2次，每次2min。 (8)千胶 室温下自然干燥。 C.快速银染检测： 10%冰醋酸固定3min:双蒸水快速漂洗1次，不超过10s:0.2%AgN03溶液染色5min: 显影液(3%Na0H,0.5%甲醛)显影；10%冰醋酸定影。 四、作业思考题 简述SSR分子标记测定品种真实性的步骤
色；也可将胶在溶液中浸泡过夜(不摇动)。将溶液回收待用。 2)洗胶 在托盘 2 中用 1.5 L 蒸馏水洗凝胶 3 次，每次 3 min。在将玻板取出时，让玻板竖直滴 干水 10～20 s。 3)染色 在托盘 3 内加入 1.5 L 染色液，将胶板放入托盘中轻摇 30 min。 4)洗胶 将胶浸入托盘 2 中，快速摇晃数秒，拿出，滴干水，立即将胶置于配制好的显色液中。 注意，从将胶置于水中到将其放人显色液中，时间不超过 5～10 s。 5)显影 轻摇显色液，直至胶上所有的条带都出现。 6)定影(终止显色) 将回收的固定／终止液倒人显色液中，反应 2～3 min。 (7)洗胶 将胶板用蒸馏水洗 2 次，每次 2 min。 (8)干胶 室温下自然干燥。 C. 快速银染检测： 10％冰醋酸固定 3min；双蒸水快速漂洗 1 次，不超过 10s；0.2%AgNO3 溶液染色 5min；； 显影液（3%NaOH ,0.5%甲醛）显影；10％冰醋酸定影。 四、作业思考题 简述 SSR 分子标记测定品种真实性的步骤