实验四ISTA小麦种子醇溶蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴 定品种纯度 一、目的要求 通过本实验，了解种子醇溶蛋白酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定品种的原理，掌握具体电 泳方法，明了该方法的先进性和实用性。 二、原理 从种子中提取出来的小麦和大麦籽粒的醇溶蛋白，可用H值3.2的聚丙烯酰胺凝胶电 泳PAGE)进行分离。其电泳所出现的蛋白质谱带类型，与同品种的遗传组成有关，并可作为 品种的指纹“(fingerprint).即为鉴定品种的生化性状。因此，就可利用这种品种指纹" 来鉴定未知品种的真实性，以及分析单粒种子个体的“指纹“来测定品种的纯度。 三、仪器和试剂 1.仪器 (1)电泳仪可用北京六一仪器厂制造的DY一型电泳仪（电压范围1-600），或用江 苏丹阳无线电一厂生产的SCR-4型高压电泳仪（电压范围1~1500V)。 (2)电泳槽可用北京六一仪器厂生产的六一牌夹心式垂直电泳槽，其样品梳为11~12 个齿，也可用1▣厚度的有机玻璃板或橡胶板自制成15-16个齿的样品梳。 (3)离心机可用上海安亭科学仪器厂生产的TGL-16B型高速台式离心机，其最高转速 为16000r/in,定时器定时1-20min。 (4)离心管必须用与离心机配套使用的离心管。通常用1L。的聚丙烯塑料离心管， 以用作样品提取的容器。 (⑤)天平1/1000的电子天平或分析天平。 (⑥)样品钳这是用于夹碎种子的工具，可用轻便老虎钳代替。 ()其他物品还需有存放有关试剂的广口瓶、移液管及移液管架、移液球或吸耳球、 滴瓶、微量进样器(1~50L。)、注射器等电泳用品 2.试剂 所有使用的化学试剂都需是分析级或更好的等级。 丙烯酰胺(AC)、亚甲基丙烯酰胺(Bis)、尿素、冰酯酸、甘氨酸、硫酸亚铁、抗坏血酸 过氧化氢、2-巯基乙醇、甲基绿、三氯醋酸、乙醇、2-氯乙醇、考马斯亮蓝250或G250
实验四 ISTA 小麦种子醇溶蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴 定品种纯度 一、目的要求 通过本实验，了解种子醇溶蛋白酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定品种的原理，掌握具体电 泳方法，明了该方法的先进性和实用性。 二、原理 从种子中提取出来的小麦和大麦籽粒的醇溶蛋白，可用 pH 值 3．2 的聚丙烯酰胺凝胶电 泳(PAGE)进行分离。其电泳所出现的蛋白质谱带类型，与同品种的遗传组成有关，并可作为 品种的“指纹”(fingerprint)。即为鉴定品种的生化性状。因此，就可利用这种“品种指纹” 来鉴定未知品种的真实性，以及分析单粒种子个体的“指纹”来测定品种的纯度。 三、仪器和试剂 1．仪器 (1)电泳仪 可用北京六一仪器厂制造的 DYY 一Ⅲ型电泳仪(电压范围 1—600V)，或用江 苏丹阳无线电一厂生产的 SCR—4 型高压电泳仪(电压范围 l～1500V)。 (2)电泳槽 可用北京六一仪器厂生产的六一牌夹心式垂直电泳槽，其样品梳为 11～12 个齿，也可用 l mm 厚度的有机玻璃板或橡胶板自制成 15-16 个齿的样品梳。 (3)离心机 可用上海安亭科学仪器厂生产的 TGL—16B 型高速台式离心机，其最高转速 为 16 000r／min，定时器定时 1—20 min。 (4)离心管 必须用与离心机配套使用的离心管。通常用 1 mL。的聚丙烯塑料离心管， 以用作样品提取的容器。 (5)天平 1／1 000 的电子天平或分析天平。 (6)样品钳 这是用于夹碎种子的工具，可用轻便老虎钳代替。 (7)其他物品 还需有存放有关试剂的广口瓶、移液管及移液管架、移液球或吸耳球、 滴瓶、微量进样器(1～50L。)、注射器等电泳用品。 2．试剂 所有使用的化学试剂都需是分析级或更好的等级。 丙烯酰胺(Acr)、亚甲基丙烯酰胺(Bis)、尿素、冰醋酸、甘氨酸、硫酸亚铁、抗坏血酸、 过氧化氢、2—巯基乙醇、甲基绿、三氯醋酸、乙醇、2—氯乙醇、考马斯亮蓝 R250 或 G250
四、溶液的配制 1.提取液 (1)小麦提取液(100mL),称取甲基绿粉剂0.05g,加入25ml2-氯乙醇，再加入无离 子水，定容至100ml,低温保存。 (2)大麦提取液(100mL)称取甲基绿粉剂0.05g,加入20ml2-氯乙醇加人18g尿 素，再加入1ml2-蔬基乙醇，然后加入无离子水，定容至100mL,低温保存。 2.电极缓冲原液(500mL 吸取20mL冰醋酸，加入2g甘氨酸，再加入无离子水，定容至500mL,低温保存，使用 时再稀释10倍。 3.凝胶缓冲液(250mL) 吸取冰醋酸5mL,加入0.25g甘氨酸，再加入无离子水定容至250mL,低温保存。 4.0.6%过氧化氢液(30mL) 吸取30%过氧化氢原液0.6L,加无离子水，定容至30mL,装入100m1滴瓶，低温保 存。 5.染色液 (1)10%三氯醋酸液(500mlL)称取50g三氯醋酸，加入无离子水，定容500mL。 (2)1%考马斯亮蓝液(50m)称取0.5g考马斯亮蓝，溶于50mL无水酒精。 6.凝胶溶液(200mL 称取丙烯酰胺20g、亚甲基丙烯酰胺0.8g、尿素12g抗坏血酸0.2g、硫酸亚铁0.01g, 再加入120mL凝胶缓冲液溶解，并用该液定容至200mL,低温保存备用。 注：配制试剂需用去离子水或重蒸水。 五、操作程序 1.样品醇溶蛋白提取 取若干个清洁干燥的1L聚丙烯离心管，分别插入合适的试管架圆孔内，取小麦或大 麦种子样品逐粒用样品钳夹碎，在夹种子时，最好垫上小片清洁的纸，以免清理钳头和防止 样品之间污染，每粒夹碎的种子粉块放人一个离心管。真实性鉴定时，每个样品重复3一5 次：品种纯度测定时，每个样品测定50-100粒种子，然后加入样品提取液，每管小麦加入 0.2mL,每管大麦加入0.3ml,盖好后在室温下将其浸提一夜，加样前用5500r/min,离心 15min。 2.凝胶玻璃封缝
四、溶液的配制 1．提取液 (1)小麦提取液(100mL)，称取甲基绿粉剂 0.05g，加入 25 ml 2—氯乙醇，再加入无离 子水，定容至 100ml,低温保存。 (2)大麦提取液(100mL) 称取甲基绿粉剂 0.05 g，加入 20ml 2—氯乙醇加人 18 g 尿 素，再加入 1 ml 2—巯基乙醇，然后加入无离子水，定容至 100mL，低温保存。 2．电极缓冲原液(500mL) 吸取 20mL 冰醋酸，加入 2g 甘氨酸，再加入无离子水，定容至 500mL，低温保存，使用 时再稀释 10 倍。 3．凝胶缓冲液(250mL) 吸取冰醋酸 5mL，加入 0.25g 甘氨酸，再加入无离子水定容至 250mL，低温保存。 4．0.6％过氧化氢液(30mL) 吸取 30％过氧化氢原液 0.6 mL，加无离子水，定容至 30mL，装入 100ml 滴瓶，低温保 存。 5．染色液 (1)10％三氯醋酸液(500mL) 称取 50g 三氯醋酸，加入无离子水，定容 500mL。 (2)1％考马斯亮蓝液(50mL) 称取 0.5g 考马斯亮蓝，溶于 50mL 无水酒精。 6．凝胶溶液(200mL) 称取丙烯酰胺 20g、亚甲基丙烯酰胺 0.8 g、尿素 12 g 抗坏血酸 0.2 g、硫酸亚铁 0．0lg， 再加入 120mL 凝胶缓冲液溶解，并用该液定容至 200mL，低温保存备用。 注：配制试剂需用去离子水或重蒸水。 五、操作程序 1．样品醇溶蛋白提取 取若干个清洁干燥的 1 mL 聚丙烯离心管，分别插入合适的试管架圆孔内，取小麦或大 麦种子样品逐粒用样品钳夹碎，在夹种子时，最好垫上小片清洁的纸，以免清理钳头和防止 样品之间污染，每粒夹碎的种子粉块放人一个离心管。真实性鉴定时，每个样品重复 3～5 次；品种纯度测定时，每个样品测定 50—100 粒种子，然后加入样品提取液，每管小麦加入 0.2mL，每管大麦加入 0.3mL，盖好后在室温下将其浸提一夜，加样前用 5 500r／min，离心 15 min。 2．凝胶玻璃封缝
从冰箱内取出凝胶溶液和过氧化氢液、每块胶板吸取这种凝胶溶液3L,放入小烧杯后 立刻加入0.6%过氧化氢液小半滴，摇匀后迅速倒入封口处，稍加晃动，使整条缝口充满胶 液，让其在5-l0加i聚合。但必须注意，灌胶动作应快速，否则会因为倒得太慢，在倒入 缝口处前，胶就开始聚合。 3.灌制分离胶和插入样品梳 从冰箱内取出凝胶溶液和过氧化氢液，每块胶板吸取凝胶液17-18l,放入烧杯后立即 加入1滴0.6%过氧化氢液，迅速摇匀，倒人凝胶玻板之间，马上插好样品梳，并用铁夹子 夹正，直放，让其在5-10min内完全聚合。 4.加样 在加样前，小心平衡地按出样品杭，用滤纸吸去多余的水分，然后用微量进样器吸取醇 溶蛋白提取液。一般每个样品加样10-20g,若加样量太多，会使蛋白质谱带模糊而难以分 辨。 5.电泳 在电泳前，先将电极缓冲液稀释10倍。一般每个电泳槽取80m1电极缓冲原液，加无离 子水稀释到800mL,分别注入前槽和后槽。注意要确保前、后槽电极能连通 接好电极引线，前槽接正极，后槽接负极，然后打开电源，逐渐将电压调到500V。电 泳时，要求在15-20温度下进行。如气温高于这一温度范围时，可放在冰箱内、空调室或 接通自来水冷却。电泳时间一般为60-80min。具体时间可按甲基绿迁移时间来推算。如果 甲基绿前沿提示剂在25-30min迁移至胶板底部(10cm左右)，那么，醇蛋白电泳时间为甲基 绿迁移时间的2~2.5倍，即60~80min左右。 6.固定和染色 在固定和染色前，按每块胶板吸取3.5ml1.0%考马斯亮蓝液，再加上100m110%三 氯醋酸液，配成染色液。 小心地剥下胶板，切去样品槽部分的胶板，并切去胶板一小角以做左右标记，然后用无 离子水漂洗后，浸入染色液染色1-2d。 7.保存 倒去染色液，用清水漂洗，并用湿软毛笔刷去胶板表面的沉淀物，然后用7%醋酸液保 存。 也可制成干胶板或装在聚乙烯薄膜袋里在4℃冰箱内保存数个月而不变质。 六、电泳图谱鉴定
从冰箱内取出凝胶溶液和过氧化氢液、每块胶板吸取这种凝胶溶液 3mL，放入小烧杯后 立刻加入 0.6％过氧化氢液小半滴，摇匀后迅速倒入封口处，稍加晃动，使整条缝口充满胶 液，让其在 5—10min 聚合。但必须注意，灌胶动作应快速，否则会因为倒得太慢，在倒入 缝口处前，胶就开始聚合。 3．灌制分离胶和插入样品梳 从冰箱内取出凝胶溶液和过氧化氢液，每块胶板吸取凝胶液 17-18ml，放入烧杯后立即 加入 1 滴 0.6％过氧化氢液，迅速摇匀，倒人凝胶玻板之间，马上插好样品梳，并用铁夹子 夹正，直放，让其在 5—10min 内完全聚合。 4．加样 在加样前，小心平衡地拨出样品梳，用滤纸吸去多余的水分，然后用微量进样器吸取醇 溶蛋白提取液。一般每个样品加样 10-20 g，若加样量太多，会使蛋白质谱带模糊而难以分 辨。 5．电泳 在电泳前，先将电极缓冲液稀释 10 倍。一般每个电泳槽取 80mL 电极缓冲原液，加无离 子水稀释到 800mL，分别注入前槽和后槽。注意要确保前、后槽电极能连通。 接好电极引线，前槽接正极，后槽接负极，然后打开电源，逐渐将电压调到 500V。电 泳时，要求在 15—20℃温度下进行。如气温高于这一温度范围时，可放在冰箱内、空调室或 接通自来水冷却。电泳时间一般为 60-80min。具体时间可按甲基绿迁移时间来推算。如果 甲基绿前沿提示剂在 25—30min 迁移至胶板底部(10cm 左右)，那么，醇蛋白电泳时间为甲基 绿迁移时间的 2～2.5 倍，即 60～80 min 左右。 6．固定和染色 在固定和染色前，按每块胶板吸取 3.5 mL 1.0％考马斯亮蓝液，再加上 100ml 10％三 氯醋酸液，配成染色液。 小心地剥下胶板，切去样品槽部分的胶板，并切去胶板一小角以做左右标记，然后用无 离子水漂洗后，浸入染色液染色 1—2d。 7．保存 倒去染色液，用清水漂洗，并用湿软毛笔刷去胶板表面的沉淀物，然后用 7％醋酸液保 存。 也可制成干胶板或装在聚乙烯薄膜袋里在 4 ℃冰箱内保存数个月而不变质。 六、电泳图谱鉴定
1.真实性鉴定 按电泳胶板蛋白质显色的蓝色谱带绘下电泳图谱，并计算出雕值，与其品种的标准图 谱比较，以鉴别品种的真伪。 2.品种纯度测定 按品种标准图谱别出图谱不同的异品种种子粒数，计算出品种纯度百分率。 七、注意事项 为了使电冰工作顺利进行和效果更好，特别应注意下列问题 (1)在提取样品醇溶蛋白过程中，在取种子时，不能取霉烂的、蛋白质己分解或变质的 病粒，以免造成误检。同时夹碎每粒种子的程序或细度应基本一致，以保证各管样品提取蛋 白质含量基本一致，种子含水最也应基本一致。种子越干燥，越易夹碎，那么，醇溶蛋白含 量就多，反之则少，这样会影响谱带的出现或丢失，以及造成谱带浓淡程序的差异。 此外，每管所加入提取液的量也应基本一致。 (②)凝胶溶液必须保存在冰箱内近零度的温度下，并且存放时间不宜过长，否则会变质 而失效。在封缝和灌分离胶时，从吸取胶液，加入过氧化氢溶液、混匀、灌胶、直至插人样 品梳等全部过程必须迅速，以免在灌胶前，胶液己开始聚合而失收，浪费胶液和时间。 (3)加样数量应学握好。一般为10-20L。严防加样过多或过少。因为加样过多，则谱 带相连续，难以分辨：加样过少，则有的谱带可能丢失，均难以保证电泳图谱的质量。 (④)电泳温度原保持在15-20G范围内，当室内气温超过这一温度范围时，应放在冰箱内 空调室或接通自来水等措施冷却，以防蛋白变质而影响电泳图谱的质量。 (⑤)该标准电泳程序是利用10%浓度凝胶，胶板较脆，并且在快速聚合时，与玻板粘得 较牢。因此在剥胶板时，应尽量小心，以防剥破表面而前功尽弃。 八、作业 根据电泳结果图谱，分析计算小麦品种的真实性和品种纯度
1.真实性鉴定 按电泳胶板蛋白质显色的蓝色谱带绘下电泳图谱，并计算出 Rf 值，与其品种的标准图 谱比较，以鉴别品种的真伪。 2．品种纯度测定 按品种标准图谱别出图谱不同的异品种种子粒数，计算出品种纯度百分率。 七、注意事项 为了使电泳工作顺利进行和效果更好，特别应注意下列问题。 (1)在提取样品醇溶蛋白过程中，在取种子时，不能取霉烂的、蛋白质已分解或变质的 病粒，以免造成误检。同时夹碎每粒种子的程序或细度应基本一致，以保证各管样品提取蛋 白质含量基本一致，种子含水量也应基本一致。种子越干燥，越易夹碎，那么，醇溶蛋白含 量就多，反之则少，这样会影响谱带的出现或丢失，以及造成谱带浓淡程序的差异。 此外，每管所加入提取液的量也应基本一致。 (2)凝胶溶液必须保存在冰箱内近零度的温度下，并且存放时间不宜过长，否则会变质 而失效。在封缝和灌分离胶时，从吸取胶液，加入过氧化氢溶液、混匀、灌胶、直至插人样 品梳等全部过程必须迅速，以免在灌胶前，胶液已开始聚合而失败，浪费胶液和时间。 (3)加样数量应掌握好。一般为 10—20 L。严防加样过多或过少。因为加样过多，则谱 带相连续，难以分辨；加样过少，则有的谱带可能丢失，均难以保证电泳图谱的质量。 (4)电泳温度原保持在 15—20℃范围内，当室内气温超过这一温度范围时，应放在冰箱内、 空凋室或接通自来水等措施冷却，以防蛋白变质而影响电泳图谱的质量。 (5)该标准电泳程序是利用 10％浓度凝胶，胶板较脆，并且在快速聚合时，与玻板粘得 较牢。因此在剥胶板时，应尽量小心，以防剥破表面而前功尽弃。 八、作业 根据电泳结果图谱，分析计算小麦品种的真实性和品种纯度