第五章种子贮藏原理和技术 本章教学时数：4学时（第21-24讲） 第五节种子低温贮藏技术 (第24讲) 一、低温库种类 低温库是要利用人为或自动控制的制冷设备及装置保持和控制 种子仓库内的温度、湿度稳定，使种子长期贮藏在低温干燥的条件下， 延长种子的寿命，保持种子的活力的一种贮种库型 低温贮藏库分三种： 种类 温度范围 相对湿度种子含量水量种子寿侖 长期库 -20--10℃ 低于50% 5%一6% 30~50年 中期库 0-10℃ 低于60% 6%一9% 10-30年 短期库 15~200 55%~65% 于12%2~5年 中、长期库用于品种资源的保存，短期库可用原种、原原种的贮 藏，也可用于生产用杂交种的贮藏。 二、低温库的建筑特点 1.高度隔热保冷 2.隔气防潮 3.结构严密 三、低温库的原理与设施 1.制冷低温贮藏库的低温来自机械制冷。制冷机主要有压缩 机、冷凝器、膨胀阀和蒸发器四部分组成。 2.除湿除湿机械有冷冻除湿机和氯化锂除湿机两类。 冷冻除湿机用冷凝方法除湿。湿空气与冷却盘接触后，因温度
降低，水气变成过饱和状态而凝结成液态水，沿管道排出库外，从而 降低了库内湿度。 氯化锂除湿机氯化锂作为吸收剂，被喷淋在库内，吸收库内空 气中水分，从而降低了库内的湿度，吸湿潮解的氯化锂再被吸收，沿 管道进入加热器，加热去湿。如此循环。氯化锂性质稳定，吸湿力强， 波动小。吸湿变稀的氯化锂只要加热到7090℃，就可把水气蒸发， 得到浓缩，再度使用。 四、低温贮藏注意事项 1.采用低温贮藏可以能比干燥贮藏更经济一些，但高水分种子靠 大幅度降温来贮藏，还得要考虑防止冻害的发生及其他不良后果。如 玉米种子含水量超过19%，花生种子含量超过11%，温度降至-18℃左 右就可能发生冻害。所以低温贮藏时必须把安全、冻害、效益结合起 来考虑。 2.低温贮藏时，因库内、外温差太大，必须注意出入库时防止种 子结露。有些种子在低温条件下，可能进入二次休眠。播种前要进行 晒种或其他打破休眠的处理。 3.品种资源或其他贵重种子的低温贮藏，一般要采用密封容器包 装，以保持种子的干燥状态。防湿容器有金属罐玻璃罐、铝铂袋或 聚乙烯塑料袋。密封容器内充满二氧化碳、氮气或真空，对贮藏更为 有利 4.低温贮藏的检测周期长，所以低温度内的温度检测要采用自动 记录与自动报警装置。发芽率检测周期可依贮藏温度、种子品质而定， 长者达10年，短则5年甚至1-2年。 第六节超低温和超干燥贮藏 一、超低温贮藏 所谓超低温贮藏是指在-80℃以下的冷冻贮存，一般以液态氮 (-196℃)为冷源，生物材料在此温度下新陈代谢活动基本停止，处于 相当稳定的生物学状态，故不可能产生遗传变异
超低温可以保存各种不同的植物材料，但材料不同，其冷冻技术 与程度也是不完全相同的。现就种子、花粉与植物营养器官（包括组 织、细胞)三大类材料的冷冻来说明其一般技术。 (一)超低温贮存的植物种子 利用液氮进行超低温(-196℃)贮存植物种子能极大地延长种子 的贮存寿命，而且液氨本身就是冷源，液氨罐就是贮存容器。除1-2 个月补充一次液氮外，不再需要制冷、除湿等设备及其他管理，相当 表5.8几种作物种子冷树含水量的临界值 植物种 含水量临界值 种子存活 含水量在告界值以 含水量在临界值以上 的 下发芽宰侧 段死温度心)发芽率侧 大麦 20.80.2) 98 -12;-13 菜豆 27.21.2) 99 25 品 白菊 13.80.3 90 -28 0 胡萝} 21.70.60 83 -5 0 花网英 14.20.1) 97 -5 0 三叶其 25.60.5) -15 2 黄瓜 16.40.9 -23;-28 1 羊茅 23.03.8) 98 -25 洋范 2470.8) 70 -18;22 0 胡胞 18.60.2) 99 22;-25 0 萝卜 16.80.9) -5 芝麻 9.31.6) 97 -18;-26 0 番茄 18.51.6) -20;25 0 小情 26.847) 雪 2 的 括号内的数值为标注差；St如w0od,1985. 省事而经济。 根据种子在液氮温度下的反应，可将种子分为三种类型 (P.C.Stanwood,1985):①忍耐干燥（低水分）又忍耐液氮（超低温）的
种子，大多数农作物、园艺作物种子属于这一类。许多研究者己成功 地将这些种子冷冻到液氮温度，再回升到室温而不损害种子活力：② 忍耐干燥对液氮敏感的种子，许多果树和坚果类种子属于这一类。如 李属、胡桃属、榛属和咖啡属种子等。这类种子的大多数是含脂肪量 高的种子。它们能干燥到含水量10%以下，但不能忍耐-10℃以下低 温，所以这类种子只能进行一般低温贮藏，而不能进行超低温贮存： ③干燥敏感、液氮敏感型种子，这类种子就是顽拗型种子。它们寿命 短，贮存技术尚在研究中，目前还不能超低温贮存。 耐干燥又耐液氮的种子，其冷冻贮存也同样受外在因素、种子的 含水量和冷冻、解冻速度等因素影响，而种子含水量是关键因素。种 子含水量高，在冷冻和解冻过程中，因水分结晶而使细胞膜受损造成 死亡，种子水分过低也会影响种子的生活力。不同植物种子都有一个 适于冷冻的含水量范围。适于冷冻贮存的种子最高含水量(FL),就 是液氮贮存的含水量的最高极限值。 (二)植物种子的液氨贮存的重要技术 1.种子干燥新收种子首先要进行干燥处理，使其含量达到适于 冷冻的含水量范围。 2.掌握好冷冻、解冻速度冷冻速度，大多数种子只要在适宜的 含水量范围内，冷冻速度对成活率影响并不很大，但多数人认为采用 -20℃/min的速率较为可靠。 解冻速度，大多数种子适宜在30℃环境中解冻，当种子回升到 室温度前要在液氮蒸气上停留一段时间，可以减少破裂。 快速冷冻的好处在于冷冻材料可以迅速越过-10-一140℃的温度 危险区，在-10-140℃温度危险区内，是细胞内冰晶形成、增大时期， 对细胞破坏性很大，在-140℃以下，冰晶不再增长，在-196℃时，材 料不是冰，而是玻璃化状态，对细胞结构不产生破坏作用。但对一些 成熟的生长状态的组织，因细胞内液泡大，含水多，就需要在保护剂 的配合下，采用慢速冷冻的方法使液泡内水分充分外渗到细胞外结 晶，以减少对细胞的破坏
3.关于冷冻保护剂的使用，种子冷冻保护剂有二甲基亚砜 (DMSO)、甘油、PEG、脯氨酸等。保护剂的作用是增加材料的外渗压， 使细胞内水分渗出，防止细胞内结晶，降低冰点，促进“玻璃化”形 成，稳定细胞膜结构。冷冻保护剂使用量要得当，既能使材料内水分 渗出，又不能渗出过量以防降低生活力。所以在冷贮存植物组织时使 用较多，而在种子上使用较少，只在顾拗性种子的研究上应用较多。 (三)花粉的超低温贮存 花粉的超低温贮存有以下几个关键技术： 1.花粉生活力的测定选用生活力高的贮存材料。 2.冷冻保存前的预处理花粉材料冷冻致死的原因也是细胞内 水分结晶，导致细胞膜的破坏。新采集的花粉含水量高(40-60%)超低 温处理必然冻死。为了避免冷冻时的细胞内结晶，提高花粉成活率， 冷冻前必须干燥脱水。脱水方法有：①冷冻干燥。即将花粉冷冻到零 下进行真空除湿：②真空干燥。即不经冷冻直接进行真空除湿：③风 干脱水。即吹风2-3小时，自然干燥到要求的含水量范围。前两种方 法在冷冻与干燥过程中花粉不同程度的受损或部分死亡，且脱水时间 长，后者脱水时间短且安全。 脱水也并不是脱得越干越好，而是脱到既不形成冰晶又能保护其 生活力为宜，这个含水量叫水分下限。各种植物花粉的下限值是不同 的，桃和松的花粉水分下限值为1-2%，椰子花粉为2%，玉米花粉为 2-3%。 3.关于冷冻保护剂（有PEG、葡萄糖、DMS0、氯化钠等）的使用 一般不使用冷冻保护剂。不少研究证明，使用冷冻保护不如干燥到合 适水分，直接浸入液氮效果好。 4.冷冻和解冻速度许多研究者证明，花粉只要干燥到合适程 度，其冷冻或解冻速度并不重要，马铃薯花粉快速或慢速冷冻到-196 ℃，9个月后，成活率都很好。喜马拉雅杉花粉含水量低于20%，在 液氨中保存后，不控制解冻速度，成活都很好。其他用玉米、黑麦花
粉试验结果也是这样。 (四)超低温冷冻保存植物营养器官、组织及细胞 1.对材料的选择植物的基因型、组织和细胞的年龄、生理状态 等对超低温贮存效果影响巨大。不同材料要用不同保护剂。茎尖的分 生组织细胞液泡小，水分少，可以快速冷冻，而细胞含水量大的组织 则要慢速冷冻，否则效果不佳。 2.预处理月的是增加细胞分裂、分化的同步化，减少细胞内自 由水，增加细胞抗寒力等。如进行组织预培养、提高培养基渗透压、 减少培养物水分，细胞继代培养时选择有丝分裂的有利时期、低温锻 炼等 3.冷冻保护剂的使用二甲基亚砜(DMSO)、甘油、糖、糖醇类物 质、一些氨基酸、多肽聚乙二醇等都可以作为不同植物、不同材料的 冷冻保护剂。 4.降温冷冻材料经保护剂处理后，在0℃预处理30-40分钟后， 分四种途径冰冻：①快速冰冻。即预处理后直接投入液氨。②慢速冰 冻。通常成熟细胞具有大的液泡，含有大量的水，对大多数植物材料 来说，不适宜快速冰冻，而需要在保护剂存在情况下的慢速冰冻。以 每分钟0.1-10℃速度降温（以每分钟降温1-2℃最好），降到-100℃左 右即浸入液氮，这样可以使细胞内水分充分渗透到细胞外结冰。③两 步冰冻法。是慢冻与速冻相结合的方法。即第一步慢冻到0℃，再慢 冻（每分钟下降0.5-4℃）到预冻温度(-30℃-40℃)，使细胞得到保 护性脱水。第二步投入液氮。④逐级冰冻法。先制备不同等级温度的 冰浴装置（如-10℃、-15℃、-23℃、-35℃、-40℃），在保护剂保护 下的材料，在0℃预处理后逐步通过这些等级的温度（每级停留4-6 分钟)然后浸入液氨，对成熟细胞的组织效果更好一些。 5.解冻解冻过程中要防止细胞内次生结冻及解冻吸水过程中， 由于吸水速度过快而形成对细胞膜的破坏。解冻方法有快速解冻法， 即从液氮中取出的材料立即投入37-40℃水浴中解冻，以防再生结冰。 6
对大多数材料来说是成功的，但对禾本植物的冬芽等必须在0℃低温 下慢速解冻。因为这些组织细胞已经在慢速冰冻过程中最大限度地失 水，快速解冻易形成大的渗透压的冲击，引起细胞膜的破坏。 二、超干燥贮藏 1.种子超干贮藏的概念超干种子贮藏(ultra--dry seed storage),亦称超低含水量贮存(ultra-low moisture seed storage)。是指种子水分降至5%以下，密封后在室温条件下或稍微 降温的条件下贮存种子的一种方法。常用于种质资源保存和育种材料 的保存。 2.种子超干贮藏的研究概况 1985年，国际植物遗传资源委员会首先提出对某些作物种子采 用超干贮存的设想，并作为重点资助的研究项目。1986年，英国里 丁大学首先开始种子超干研究。从20世纪80年代后期开始，浙江农 业大学、北京植物园、中国农业科学院国家种质库也相继开展了种子 超干研究并取得一些研究结果： (1)适合超干贮藏种子种类多数正常型作物可以进行超干燥 贮存，但不同类型的种子耐干程度不同。脂肪类作物种子具有较强的 耐干性，可以进行超干贮存。淀粉类和蛋白类作物种子耐干程度差异 较大，有待进行深入研究。 (2)种子忍耐超干的限度种子超干不是越干越好，存在一个 超干水分的临界值。当种子水分低于临界值，种子寿命不再延长，并 出现干燥损伤。不同作物种子水分的超干临界值不同，需逐个进行试 验。从20世纪80年代后期开始，已经研究出的不同作物种子超干含 水量临界值 表5.9不同作物种子超干燥含水量临界值 作物种子临界含水量(%)资料来源作物种子临界含水量(%)资料来源 粳稻 4.4 E1lis(1992) 西瓜 1.25 季志仙(1993) 籼稻 4.3 E1lis(1992) 南瓜 2.46 委志仙(1993) 瓜娃稻 4.5 Eis(1992 冬瓜 1.79 季志仙(1993》
白芝麻 2.0 Ellis(1996) 花生 IBPGR(1990) 甘蓝油菜3.0 E11is1996 大 支巨振(1991) 油菜 .0 E1is(1996) 白棠 程红焱(199) 33 Eis(1996) 萝卜 03 周祥胜(1991D 向山葵 2.04 E1lis(1996 黑芝麻 0.6 周样胜(1991 亚麻 2.7 E11is(1996 甜椒 1.32 沈等(1994) 黄瓜 1.02 季志仙(1993)章大葱 1.67 沈等(1994) (3)种子干燥的适合速率种子的干燥速率因干燥剂的种类和 剂量不同而不同。种子在P0,/Ca0、CaCl:和硅胶中的千燥速率依次递 减，在P0中最快，在硅胶中最慢。干燥速率对种子活力的影响尚有 不同的看法，有待深入研究。 (4)种子含油量与脱水速率的关系种子含油量的高低与其脱 水速率及耐干性能均成正相关，此系种子胶体化学特性所决定。 3.种子超干燥贮藏的技术关键 (1)超低含水量种子的获得要使种子含水量降至5%以下， 采用一般的干燥条件是难以做到的。如用高温烘干，则要降低活力以 至丧失生活力。目前采用的方法有冰冻真空干燥、鼓风硅胶干燥、干 燥剂室温下干燥，一般对生活力没影响。 为避免种子因强烈过度脱水而造成形态和组织结构上的损伤，郑 光华等找到了有效的干前预处理方法，使其在亚细胞和分子水平上， 特别是膜体系构型的重组方面有效进行。同时采取先低温(15℃)后高 温(35℃)的逐步升温干燥法，使大豆种子（对照）的干裂率由87%降 为0%，而且毫不损伤种子活力。 (2)超干种子萌发前的预处理由于对种子吸胀损伤的认识不 足，以往误将超干种子直接浸水萌发的不良效果归于种子的干燥损 伤。为此，根据种子“渗控”和“修补”的原理，采用G引发处理 或回干处理和逐级吸湿平衡水分的预措能有效地防止超干种子的吸 胀损伤，获得高活力的种苗。 第七节顽拗型种子贮藏 一、顽拗型种子的生理特征
顽拗型种子(recalcitrant seeds)指那些不耐干燥和零上低温 的种子，也即对干燥和低温敏感的种子 1.干燥脱水易损伤 2.易遭受冷害和冻害 3.属大型和大粒种子 4.不耐贮藏、寿命短 5.多数属于热带和水生植物 二、顽拗型种子贮藏的关键措施 1.控制水分 使种子水分略高于致死临界水分。通常用木炭粉、木屑及干苔藓 等加水与种子混存，然后把它们贮藏在聚乙烯袋里。绝对不能密封（袋 口散开或袋上打孔)。为了防止微生物、菌类的旺盛生长，贮藏前用 杀菌剂处理是必要的。如采用克菌丹、0.5%氯化汞等处理 2.防止发芽 (1)使种子水分刚刚低子种子发芽所需的水分 (2)抑制发芽或使种子保持休眠 3.适宜低温 根据顽拗型种子对贮藏温度反应的不同，可把顽拗型种子分为两 类：一类是易遭冷害的种子，包括热带、亚热带和水生植物种子，如 榴莲、芒果、红毛丹、菠萝蜜、坡垒等种子最好采用高于15℃而低 于20℃的贮藏温度。另一类是不会产生冷害的种子，温度可低至5 ℃（或更低）。不管那一类类型，贮藏温度都不能低于0℃。 三、顽拗型种子的贮藏方法 1.短期保存 由于顽拗型种子不耐脱水及低温，因此人们注意到在不影响种子 活力前提下，尽可能降低种子贮藏温度及其含水量，以降低种子贮藏 过程中的代谢，并添加杀菌剂保存种子。如自然条件下，黄皮种子寿 9
命只有10天，木波罗也仅一个月，陆旺金等(1988)将新鲜黄皮种子 部分脱水后加入4一6%百菌清（杂菌）装入塑料袋内贮于15℃，600天 后发芽率达90%，800天后仍达70%：唐林风等(1993)将木汲罗部分 脱水后置于能适度换气的塑料袋内，15℃贮存850天后仍保持90%发 芽率。这些方法虽能延长种子寿命，但是有限的 2.超低温保存 近年来人们先后对可可、椰子、橡胶等十多种顽拗型种质的超低 温保存进行探索性研究，其中仅可可幼胚、椰子胚、麦茶的胚轴经超 低温贮存后产生了幼苗，其余的如橡胶、龙眼、栎、等均只保持生根、 茎或产生愈伤组织的能力，因此顽拗型种子的超低温贮存只是初步 的，与实际应用还有很大的距离