第六章种子检验原理和技术 本章教学时数：8学时（第25-32讲） 第七节种子生活力测定 (第32讲) 种子生活力是指种子萌发的潜在能力。其测定通常采用化学染色 或物理方法，鉴定结果不如发芽试验的幼苗鉴定准确，但也可用以下 两种情况：一是己知供检样品尚处于休眠状态或试验终期发现尚有较 多休眠种子，二是在短期内急需了解种子发芽力时采用生活力测定进 行估计。目前在国际种子检验上较为通有的标准方法有四唑染色图形 技术，离体胚培养技术，不过其它方法，尤其软X射线造影技术，也 有一定实际应用价值，我们以四唑染色图形技术来加以说明： 四唑染色法是当前国内外较广泛应用的一种具快速、简便、准确 和稳定的方法，可广泛地应用于各种作物。 一、方法原理 种子活体细胞内有脱氢酶，可与氧化还原指示剂三苯基氯化四氮 唑或三苯基溴化四氮唑反应显色，这种无色物质从脱氢酶接受氢，在 活细胞或组织里产生稳定而不扩散的红色物质三苯基甲臜，染成红色 表示有生命的组织，而末染色的则代表无生命组织：此外还有部分染 色种子，说明不同部位存在有不同比例的坏死组织。在胚和胚乳或配 子体组织中，这种坏死面积的大小和部位，以及颜色深浅要据对形成 幼苗主要结构的影响来判断健康和死亡，综合鉴定种子是否有生活 力。 二、测定方法 1.试剂配制：应用四唑的0.1%-1.0%(m/w)溶液，1.0%溶液用于 不切开胚的种子染色，而0.1%-0.5%溶液用于已经切开胚的种子染色
配成的溶液须贮存在黑暗处或棕色瓶里。如用蒸馏水配制溶液，H 值不在6.5-7.5范围内，则采用磷酸缓冲液配制，方法如下： 溶液I:称取9.078g磷酸二氢钾(KHP0)溶于1000ml蒸馏水中： 溶液IⅡ：称取9.472g磷酸氢二钠(NaHP0,)或11.876g磷酸氢二 钠(NaHP0,·2L0)溶于1000ml蒸馏水中。 取溶液I2份和溶液Ⅱ3份混合即成缓冲液，在该缓冲液中溶解 准确数量的四唑盐类，以获准确的浓度。如每100ml缓冲液中溶入 1g四唑盐即1%浓度的溶液。 2.数取试样：；从经净度分析后并充分混合的净种子中随机数取 2份，名100粒或少于100粒的若干副重复。如测发芽末期休眠种子 生活力，则单用试验末期的休眠种子。 3.预措预湿： (1)月的使种子加快和充分吸湿，软化种皮，方便样品准备和促 进活组织酶系统的活化，以提高染色的均匀度、鉴定的可靠性和正确 性。 (2)预措除去种子外部的附属物。其方法包括剥去果壳和在种 子非要害部位弄破种皮，但必须注意，不能损伤种子内部胚的主要构 造。 (3)预湿 ①快速水浸预湿适用于直接浸入水中不会造成组织破裂损伤，不 会影响鉴定正确性的种子。 ②缓慢纸床预湿适用于直接浸在水中容易破裂和损伤的种子，以 及衰弱的种子或过分干燥的种子。 ③202溶液浸种为加快种子吸胀和促进酶的活化以及缩短预 湿时间。 4.染色前准备： (1)月的 为使四唑溶液快速和充分渗入种子的全部活组织，加快染色反应 和正确鉴定胚的主要构造，必须按其胚和营养组织的位置和特性，采
用适当的方法使胚的主要构造和（或）活的营养组织暴露出来 (2)样品准备方法 每种种子要求选择最适合的方法来制备种子样品 5.染色： (1)月的通过染色反应，能将胚和活的营养组织里的健壮、衰 弱和死亡部分的差异正确地显现出来，以便进行确切的鉴别 (2)染色程序将经过样品准备或不需准备的规定数量的种子 分别放入四唑溶液里染色。 (3)染色的温度和时间染色时间因种子种类、样品准备方法、 本身生活力的强弱、四唑溶液浓度、p州值和温度等因素的不同而有 差异，其中特别是温度影响为最大。 (4)暂停染色因没有按时进行鉴定，可将正在进行染色的样品 移到低温或冰冻条件下，以中止或延缓染色反应进程。 (⑤)染色失调当染色溶液变为混浊，并出现泡沫或粉红色的沉 淀，可能原因： ①样品中含有死亡、衰弱、热伤、冻害或机械损伤的种子 ②样品的胚与营养组织在预湿前已在水中或四唑溶液里浸过。 ③染色溶液温度过高而引起种子组织（特别是衰弱组织）的严重 劣变，导致外溢物增加和微生物的活动， (6)真空技术的应用 可加速四唑还原成甲臜的速度：能加速 四唑溶液渗入胚组织 6.鉴定前处理： 再进一步使胚的主要构造和活的营养组织明显地暴露出来，以便 观察、鉴定 (1)不需处理，直接观察 (2)轻压出胚，观察鉴定 (3)扯开营养组织，暴露出胚 (4)切去一层营养组织，暴露出胚和活营养组织 (5)沿胚中轴纵切，暴露出胚的构造
(6)剥去半透明的种皮或种子组织，暴露出胚 (7)乳酸苯酚透明液的应用 7.观察鉴定： (1)目的 ①确切计算种子能产生正常幼苗的能力，即种子生活力百分率 ②按种子样品染色程度和组织特征，判断其强壮程度，将种子分 为强或弱2一3个等级，以便统计种子活力。 ③按局部解剖染色图形，观察染色部位，查明种子劣变和生活力 丧失的原因，为种子生理、种子加工、种子贮藏和种子处理提供指导 情报。 (2)一般鉴定原则 凡是胚的主要构造及有关活营养组织染成有光泽的鲜红色，且组 织状态正常的，为有生活力种子。凡是胚的主要构造局部不染色或染 成异常的颜色和光泽，并且活营养组织不染色部分己超过二分之一， 或超过允许范围以及组织软化的，为不正常种子。 凡是完全不染色或染成无光泽的淡红色或灰白色，且组织已软腐 或异常、虫蛀、损伤、腐烂的为死种子 022902 公0g200
图6,3小麦种子四唑测定结果的鉴定标准 8.结果表示 计算各重复中有生活力种子数，重复间最大差距不得超过表 12.19规定，平均百分率计算到最近似的整数。 第八节其它测定 一、种子健康度测定方法 (一)末经培养的检验 1.直接检查：适用于较大的病原体或杂质外表有明显症状的病 害，如麦角、线虫瘿，螨类等。必要时，可应用双目显微镜对试样进 行检查，取出病原体或病粒，称重或计数。 2.吸胀种子检查，为使子实体、病症或害虫更易观察到或促进孢 子释放，把试验样品浸入水中或其他溶液中，吸胀后检查表面或内部， 最好用双目显微镜 3.洗涤检查： 用于检查附着在种子表面的病菌孢子或颖壳上的病原线虫。 分取样品两份，每份5g分别倒入100mL,三角瓶内，加无菌水 10mL如使病原体洗涤更彻底，可加入0.1%润滑剂（如磺化二羧酸酯）。 置振荡机上振荡，光滑种子振荡5min,粗糙种子振荡10min。将洗涤 液移入离心管内，在1000-1500×g离心3-5min。用吸管吸去上清 液，留1mL的沉淀部分，稍加振荡。用干净的细玻璃棒将悬浮液分别 滴于5片载玻片上。盖上盖玻片，用40-500倍的显微镜检查，每片 检查10个视野，并计算每视野平均孢子数，据此可计算病菌孢子负 荷量。 4.剖粒检查 取试样5-10g(小麦等中粒种子5g,玉米、豌豆大粒种子10g)用 刀剖开或切开种子的被害或可疑部分，检查害虫。 5.染色检查
高锰酸钾染色法：适用检查隐蔽米象、谷象。取试样15g,除去 杂质，倒入铜丝网中，于30℃水中浸泡1min,再移入1%高锰酸钾溶 液中染色lmin。然后用清水洗涤，倒在白色吸水纸上用放大镜检查， 挑出粒面上带有直径0.5mm的斑点即为害虫籽粒。计算害虫含量。 碘或碘化钾染色法：适用于检验豌豆象。取试样50g,除去杂质，放 入铜丝网中或用纱布包好，浸入1%碘化钾或2%碘酒溶液中1-1.5min。 取出放入0.5%的氢氧化钠溶液中，浸30s,取出用清水洗涤15-20s, 立即检验，如豆粒表面有1-2m直径的圆斑点，即为豆象感染。计算 害虫含量。 6.比重检验法 取试样100g,除去杂质，倒入食盐饱和液中（含盐35.9g溶于 1000ml水中)，搅拌10-15min,静止1-2min,将悬浮在上层的种子 取出，结合剖粒检验，计算害虫含量 7.软x射线检验 用于检查种子内隐匿的虫害（如蚕豆象、玉米象、麦蛾等），通过 照片或直接从荧光屏上观察。 (二)培养后检查 试验样品经一定时间培养后，检查种子内外部和幼苗上是否存在 病原菌或其症状。常用的培养基有三类： 1.吸水纸法 吸水纸法适用于许多类型种子的种传真菌病害的检验，尤其是对 于许多半知菌，有利于分生孢子的形成和致病真菌在幼苗上的症状的 发展。 稻瘟病(Pyriculana oryzae Cav..） 取试样400粒种子，将培养皿内的吸水纸用水湿润，每个培养皿 播25粒种子，在22℃下用12h黑暗和12h近紫外光照的交替周期培 养7d。在12-50倍放大镜下检查每粒种子上的稻瘟病分生孢子。 般这种真菌会在颖片上产生小而不明显、灰色至绿色的分生孢子，这
种分生孢子成束地着生短而纤细的分生孢子梗的顶端。菌丝很少覆盖 整粒种子。如有怀疑，可在200倍显微镜下检查分生孢子来核实。典 型的分生孢子是倒梨形，透明，基钝圆具有短齿，分两隔通常具有尖 锐的顶端，大小为(20-25)um×(9-12)um。 水稻胡麻叶斑病(Drechslera oryzae Subram&Jain) 取试样400粒种子，将培养皿里的吸水纸用水湿润，每个培养皿 播25粒种子。在22℃下用12h黑暗和12h近紫外光照的交替周期培 养7d。在12-50倍放大镜下检查每粒种子的胡麻叶斑病的分生孢子。 在种皮上形成分生孢子梗和淡灰色气生菌丝，有时病菌会蔓延到吸水 纸上。如有怀疑，可在200倍显微镜下检查分生孢子来核实。其分生 孢子为月牙形(35-170)um×(11-17)um,淡棕色至棕色，中部或近中部 最宽，两端渐渐变细变圆。 十字花科的黑胫病(Leptosphaeria maculans Ces.&de Not.) 即甘蓝黑腐病(Phoma lingam Desm.)取试样1000粒种子，每个培养 皿垫入三层滤纸，加入5mL0.2%(m/W)的2,4-二氯苯氧基乙酸钠盐(2， 4-D)溶液，以抑制种子发芽。沥去多余的2,4-D溶液，用无菌水洗 涤种子后，每个培养皿播50粒种子。在20℃用12h光照和12h黑暗 交替周期下培养11d,经6d后在25倍放大镜下，检查长在种子培养 基上的甘蓝黑腐病松散生长的银白色菌丝和分生孢子器原基。经11 后，进行第二次检查感染种子及其周围的分生孢子器。记录已长有的 甘蓝黑腐病分生孢子器的感染种子 2.砂床法 适用于某些病原体的检验。用砂时应去掉砂中杂质并通过1mm孔 径的筛子，将砂粒清洗，高温烘干消毒后，放入培养皿内加水湿润 种子排列在砂床内，然后密闭保持高温，培养温度与纸床相同，待幼 苗顶到培养盖时进行检查（约经7-l0d)。 3.琼脂皿法 主要用于发育较慢的致病真菌，潜伏在种子内部的病原菌，也可 用于检验种子外表的病原菌
小麦颖枯病(Septoria nodorum Berk.) 先数取试样400粒，经1%(m/m)的次氯酸钠消毒10min后，用无 菌水洗涤。在含0.01%硫链霉素的麦芽或马钤薯左旋糖琼脂的培养基 上，每个培养皿播10粒种子于琼脂表面，在20℃黑暗条件下培养7d。 用肉眼检查每粒种子上缓慢长成圆形菌落的情况，该病菌菌丝体为白 色或乳白色，通常稠密地覆盖着感染的种子。菌落的背面呈黄色或褐 色，并随其生长颜色变深。 豌豆褐斑病(Ascohyta pisi Lib) 先数取试样400粒，经1%(m/m)的次氯酸钠消毒10min后，用无 菌水洗涤。在麦芽或马铃薯葡萄糖琼脂的培养基上，每个培养皿播 10粒种子于琼脂表面，在2℃黑暗条件下培养7。用肉眼检查每粒 种子外部盖满的大量白色菌丝体。对有怀疑的菌落可放在25倍放大 镜下观察，根据菌落边缘的波状菌丝来确定。 (三)其他方法 大麦的散黑穗病菌可用整胚检验。 测定样品中是否存在细菌、真菌或病毒等，可用生长植株进行检 查，可在供检的样品中取出种子进行播种，或从样品中取得接种体， 以供对健康幼苗或植株一部分进行感染试验。应注意植株从其他途径 传播感染，并控制各种条件。 二、重量测定方法 (一)种子千粒重的含义和测定的必要性 (二)测定方法 1、试验样品 净度检验后的净种子。 2、测定方法 (1)百粒法(2)千粒重法(3)全量法
三、包衣种子检验 (一)扦样 1、种子批大小：若种子批均匀，同非包衣种子。其允许误差为 5%。 2、样品大小：包衣种子送检样品和试验样品大小见表。由于包 衣种子含有包衣物质，在同样的样品重量中，种子粒数少，所以样品 数量以粒数表示，并在扦样和分样时重视其代表性。 (二)净度分析 严格地说，包衣种子的净度分析并不是规定要做的。 (三)发芽试验 1、目的：测定种子批的最大发芽率：检验包衣过程对种子的影 响。 2、程序：①实验样品的取得仅做发芽实验，随机取丸化种子 400粒，4次重复：若先做净度检验，则从净丸化种子随机取400粒。 ②发芽床的选用可用纸床和砂床，或土壤。但砂床最好。因丸 化种子需水较多。 ③发芽持续时间可能比未丸化长些。 ④幼苗记数和鉴定可根据幼苗长势判断丸化种子活力和包衣 物质的好坏。 ⑤置床培养条件同一般 ⑥计算同一般