四、技术应用 1操作 ①超促排卵: 全部患者采用促性腺激素释放激素激动剂(GnRH-a)长周期超促排卵方案;即于黄体 中期肌内注射曲普瑞林(商品名达菲林)1.875g,14d左右垂体功能受到抑制后,给予促卵 泡激素(商品名果纳芬)促排卵。于出现直径达到18mm的2个卵泡的当晚,肌内注射人 绒毛膜促性腺激素(hCG)1000U,3h后在阴道B超导引下取卵。将卵丘复合体放入含有5% 人血白蛋白(HAS)的人输卵管培养液(HTF)内,在37℃二氧化碳培养箱中培养。 ②颗粒细胞线粒体提取: 卵丘复合体经80μ/m透明质酸酶消化后,拆除卵子周围的颗粒细胞。颗粒细胞用HTF 培养液离心、洗涤后,记数并调整浓度为105/ml。卵丘颗粒细胞数量少的,从卵泡液中收集 颗粒细胞。取1m冰浴后的细胞匀浆器将颗粒细胞匀浆46次,采用4℃的冷冻离心机,200g 离心20min;弃上清液,沉淀物即为线粒体。用0.5μ平衡后,经人输卵管培养液悬浮,并 放入4℃冰箱保存备用 ③线粒体移植: 移植的准备工作同行卵细胞浆内单精子注射(Cs)。将制动的精子吸入直径为7um的 显微注射针,并移入线粒体微滴即吸入相当于约1-1.5个卵子直径长度的液体。然后将线粒 体与精子一同注入卵细胞胞浆内。反复吸吐1~2次,使线粒体与卵细胞浆混匀,防止精子处 在线粒体的液泡中不利受精。用这种方法移植到每个卵子的液体约是卵子体积的1%,线粒 体约3000个左右。 ④卵子受精和胚胎质量的观察: 在受精后的第16~20h,观察卵子的受精情况,计数卵子的受精率(即出现的2个原核占 所有卵子的比例)。在第2天和第3天观察胚胎的发育情况,包括发育速度、细胞形态和碎 片,计数良好胚胎(即在第3天胚胎移植时,每个胚胎内的细胞数目不少于6个,细胞碎片 不超过胚胎总体积的20%)的形成率(即良好胚胎占正常受精卵子的比例)四、技术应用 1.操作 ①超促排卵： 全部患者采用促性腺激素释放激素激动剂（GnRH-a）长周期超促排卵方案；即于黄体 中期肌内注射曲普瑞林（商品名达菲林）1.875g，14d 左右垂体功能受到抑制后，给予促卵 泡激素（商品名果纳芬）促排卵。于出现直径达到 18mm 的 2 个卵泡的当晚，肌内注射人 绒毛膜促性腺激素（hCG）1000IU,34h 后在阴道 B 超导引下取卵。将卵丘复合体放入含有 5% 人血白蛋白（HAS）的人输卵管培养液（HTF）内，在 37℃二氧化碳培养箱中培养。 ②颗粒细胞线粒体提取： 卵丘复合体经 80μ/ml 透明质酸酶消化后，拆除卵子周围的颗粒细胞。颗粒细胞用 HTF 培养液离心、洗涤后，记数并调整浓度为 10 6/ml。卵丘颗粒细胞数量少的，从卵泡液中收集 颗粒细胞。取 1ml 冰浴后的细胞匀浆器将颗粒细胞匀浆 4~6 次，采用 4℃的冷冻离心机，200g 离心 20min；弃上清液，沉淀物即为线粒体。用 0.5μl 平衡后，经人输卵管培养液悬浮，并 放入 4℃冰箱保存备用。 ③线粒体移植： 移植的准备工作同行卵细胞浆内单精子注射（ICSI）。将制动的精子吸入直径为 7μm 的 显微注射针，并移入线粒体微滴即吸入相当于约 1~1.5 个卵子直径长度的液体。然后将线粒 体与精子一同注入卵细胞胞浆内。反复吸吐 1~2 次，使线粒体与卵细胞浆混匀，防止精子处 在线粒体的液泡中不利受精。用这种方法移植到每个卵子的液体约是卵子体积的 1%，线粒 体约 3000 个左右。 ④卵子受精和胚胎质量的观察： 在受精后的第 16~20h，观察卵子的受精情况，计数卵子的受精率(即出现的 2 个原核占 所有卵子的比例)。在第 2 天和第 3 天观察胚胎的发育情况，包括发育速度、细胞形态和碎 片，计数良好胚胎(即在第 3 天胚胎移植时，每个胚胎内的细胞数目不少于 6 个，细胞碎片 不超过胚胎总体积的 20%）的形成率（即良好胚胎占正常受精卵子的比例）