自体颗粒细胞线粒体移植 侯煜15301050212 技术简介 技术名称自体颗粒细胞线粒体移植 英文名称 self-mitochondria transfer ③技术实质吸取自体颗粒细胞线粒体,注入到卵子内 技术目的旨在改善卵子质量,提高妊娠率 发展背景 随着社会经济高速发展、“二胎”政策全面执行,晚婚晩育的 浪潮致使高龄产妇不断增多,“卵子质量差、妊娠率低”也成为了 困扰着千千万万家庭的一大难题。让卵子“返老还童”的诉求 度激发了“卵巢控制性超促排卵(CoH)”、“卵子体外成熟(wM)” 技术的全面盛行。它们虽然使妊娠率得到了明显的提高,却依然不 完美 “卵巢控制性超促排卵(coH)”技术的主角一一外源性促性腺激素(Gn)可能导致卵 巢过度刺激综合征(OHSs)。随之应运而生的“卵子体外成熟(WM)”技术在一定程度上解 答了难题,却又发现:相比于体内成熟卵子,wM卵子的发育潜能较为低下。科学家们经研 究发现,其中的关键问题在于:VM极度缩短的成熟时间使得细胞质中的“动力车间” 线粒体DNA的数量锐减,干扰了卵子细胞质成熟进程,从而导致了ⅣM卵子具有较低的发 育潜能。[1] 在上述种种问题的推动下,“自体颗粒细胞线粒体移植”技术出现,在一定程度上缓解 了上述难题,为众多“求子”家庭带来了新的希望 、技术原理 线粒体是细胞的“动力车间”,其产生的ATP是细胞生 长发育主要的能量来源。如果线粒体数目减少、产生ATP 的能力降低,就很难维持细胞正常的染色体分离、生物合成、 有丝分裂及胚胎细胞的各种生理功能,由此可导致种植期胚 胎细胞发育异常、停滞或凋亡。因此,如果解决了老化、弱 小卵细胞的“线粒体”问题,就为卵子“返老还童”带来了 另一方面,包围在卵母细胞周围的一层菱形或扁平状的颗粒细胞,在卵子发育过程中可 提供营养物质和调节因子,其线粒体的功能形态与卵子有着极大的相似度, “自体颗粒细胞线粒体移植”技术即通过抽取自体颗粒细胞的线粒体,与精子一同注入 老化卵细胞的胞浆内。这样一来,原本“不振”的卵细胞依靠外源补充增加了胞浆线粒体数 目,增加ATP产量、提供继续发育的能量、重振卵子活力、保障了细胞内一系列生化反应及 各种生理功能的有序进行,同时补充受精,明显改善了胚胎的质量、提高了妊娠率。[2]
自体颗粒细胞线粒体移植 侯煜 15301050212 一、技术简介 技术名称 自体颗粒细胞线粒体移植 英文名称 self-mitochondria transfer 技术实质 吸取自体颗粒细胞线粒体，注入到卵子内 技术目的 旨在改善卵子质量，提高妊娠率 二、发展背景 随着社会经济高速发展、“二胎”政策全面执行，晚婚晚育的 浪潮致使高龄产妇不断增多，“卵子质量差、妊娠率低”也成为了 困扰着千千万万家庭的一大难题。让卵子“返老还童”的诉求，一 度激发了“卵巢控制性超促排卵（COH）”、“卵子体外成熟（IVM）” 技术的全面盛行。它们虽然使妊娠率得到了明显的提高，却依然不 完美。 “卵巢控制性超促排卵（COH）”技术的主角——外源性促性腺激素（Gn）可能导致卵 巢过度刺激综合征（OHSS）。随之应运而生的“卵子体外成熟（IVM）”技术在一定程度上解 答了难题，却又发现：相比于体内成熟卵子，IVM 卵子的发育潜能较为低下。科学家们经研 究发现，其中的关键问题在于：IVM 极度缩短的成熟时间使得细胞质中的“动力车间”—— 线粒体 DNA 的数量锐减，干扰了卵子细胞质成熟进程，从而导致了 IVM 卵子具有较低的发 育潜能。[1] 在上述种种问题的推动下，“自体颗粒细胞线粒体移植”技术出现，在一定程度上缓解 了上述难题，为众多“求子”家庭带来了新的希望。 三、技术原理 线粒体是细胞的“动力车间”，其产生的 ATP 是细胞生 长发育主要的能量来源。如果线粒体数目减少、产生 ATP 的能力降低，就很难维持细胞正常的染色体分离、生物合成、 有丝分裂及胚胎细胞的各种生理功能，由此可导致种植期胚 胎细胞发育异常、停滞或凋亡。因此，如果解决了老化、弱 小卵细胞的“线粒体”问题，就为卵子“返老还童”带来了 可能。 另一方面，包围在卵母细胞周围的一层菱形或扁平状的颗粒细胞，在卵子发育过程中可 提供营养物质和调节因子，其线粒体的功能形态与卵子有着极大的相似度。 “自体颗粒细胞线粒体移植”技术即通过抽取自体颗粒细胞的线粒体，与精子一同注入 老化卵细胞的胞浆内。这样一来，原本“不振”的卵细胞依靠外源补充增加了胞浆线粒体数 目，增加 ATP 产量、提供继续发育的能量、重振卵子活力、保障了细胞内一系列生化反应及 各种生理功能的有序进行，同时补充受精，明显改善了胚胎的质量、提高了妊娠率。[2]
四、技术应用 1操作 ①超促排卵: 全部患者采用促性腺激素释放激素激动剂(GnRH-a)长周期超促排卵方案;即于黄体 中期肌内注射曲普瑞林(商品名达菲林)1.875g,14d左右垂体功能受到抑制后,给予促卵 泡激素(商品名果纳芬)促排卵。于出现直径达到18mm的2个卵泡的当晚,肌内注射人 绒毛膜促性腺激素(hCG)1000U,3h后在阴道B超导引下取卵。将卵丘复合体放入含有5% 人血白蛋白(HAS)的人输卵管培养液(HTF)内,在37℃二氧化碳培养箱中培养。 ②颗粒细胞线粒体提取: 卵丘复合体经80μ/m透明质酸酶消化后,拆除卵子周围的颗粒细胞。颗粒细胞用HTF 培养液离心、洗涤后,记数并调整浓度为105/ml。卵丘颗粒细胞数量少的,从卵泡液中收集 颗粒细胞。取1m冰浴后的细胞匀浆器将颗粒细胞匀浆46次,采用4℃的冷冻离心机,200g 离心20min;弃上清液,沉淀物即为线粒体。用0.5μ平衡后,经人输卵管培养液悬浮,并 放入4℃冰箱保存备用 ③线粒体移植: 移植的准备工作同行卵细胞浆内单精子注射(Cs)。将制动的精子吸入直径为7um的 显微注射针,并移入线粒体微滴即吸入相当于约1-1.5个卵子直径长度的液体。然后将线粒 体与精子一同注入卵细胞胞浆内。反复吸吐1~2次,使线粒体与卵细胞浆混匀,防止精子处 在线粒体的液泡中不利受精。用这种方法移植到每个卵子的液体约是卵子体积的1%,线粒 体约3000个左右。 ④卵子受精和胚胎质量的观察: 在受精后的第16~20h,观察卵子的受精情况,计数卵子的受精率(即出现的2个原核占 所有卵子的比例)。在第2天和第3天观察胚胎的发育情况,包括发育速度、细胞形态和碎 片,计数良好胚胎(即在第3天胚胎移植时,每个胚胎内的细胞数目不少于6个,细胞碎片 不超过胚胎总体积的20%)的形成率(即良好胚胎占正常受精卵子的比例)
四、技术应用 1.操作 ①超促排卵： 全部患者采用促性腺激素释放激素激动剂（GnRH-a）长周期超促排卵方案；即于黄体 中期肌内注射曲普瑞林（商品名达菲林）1.875g，14d 左右垂体功能受到抑制后，给予促卵 泡激素（商品名果纳芬）促排卵。于出现直径达到 18mm 的 2 个卵泡的当晚，肌内注射人 绒毛膜促性腺激素（hCG）1000IU,34h 后在阴道 B 超导引下取卵。将卵丘复合体放入含有 5% 人血白蛋白（HAS）的人输卵管培养液（HTF）内，在 37℃二氧化碳培养箱中培养。 ②颗粒细胞线粒体提取： 卵丘复合体经 80μ/ml 透明质酸酶消化后，拆除卵子周围的颗粒细胞。颗粒细胞用 HTF 培养液离心、洗涤后，记数并调整浓度为 10 6/ml。卵丘颗粒细胞数量少的，从卵泡液中收集 颗粒细胞。取 1ml 冰浴后的细胞匀浆器将颗粒细胞匀浆 4~6 次，采用 4℃的冷冻离心机，200g 离心 20min；弃上清液，沉淀物即为线粒体。用 0.5μl 平衡后，经人输卵管培养液悬浮，并 放入 4℃冰箱保存备用。 ③线粒体移植： 移植的准备工作同行卵细胞浆内单精子注射（ICSI）。将制动的精子吸入直径为 7μm 的 显微注射针，并移入线粒体微滴即吸入相当于约 1~1.5 个卵子直径长度的液体。然后将线粒 体与精子一同注入卵细胞胞浆内。反复吸吐 1~2 次，使线粒体与卵细胞浆混匀，防止精子处 在线粒体的液泡中不利受精。用这种方法移植到每个卵子的液体约是卵子体积的 1%，线粒 体约 3000 个左右。 ④卵子受精和胚胎质量的观察： 在受精后的第 16~20h，观察卵子的受精情况，计数卵子的受精率(即出现的 2 个原核占 所有卵子的比例)。在第 2 天和第 3 天观察胚胎的发育情况，包括发育速度、细胞形态和碎 片，计数良好胚胎(即在第 3 天胚胎移植时，每个胚胎内的细胞数目不少于 6 个，细胞碎片 不超过胚胎总体积的 20%）的形成率（即良好胚胎占正常受精卵子的比例）
2案例 实验:选自2002年7月至2003年10月,进行体外受精-胚胎移植(ⅣVF-ET)治疗的患 者18例。患者年龄33~46岁,因胚胎发育质量差,进行3次以上ⅣF-ET均未妊娠,或患者 年龄大于37岁。经超促排卵治疗,取出的成熟卵子少于4个者仅行线粒体移植:多于4个 者随机行线粒体移植及ICSl。 结果:18例患者经过超促排卵后,获得成熟卵子168个,其中行线粒体移植卵子86个, 正常受精64个,受精率为744%;行lCS卵子82个,正常受精63个,受精率为76.8%。两 种方法的受精率比较,差异无显著意义。行线粒体移植的胚胎发育速度正常,细胞碎片较少 移植日良好胚胎形成率为59.4%。行ICS的胚胎质量较差,移植日良好胚胎形成率为34.9% 两种方法良好胚胎形成率比较,差异有显著意义。移植的胚胎全部选择线粒体移植,行ICSl 的胚胎进行冷冻保存。每个患者移植的胚胎数目为1~3个.18例中7例获临床妊娠,4例为 双胎,妊娠率为38.9%,与同期行ICS的平均妊娠率41.7%接近。其中1例香港患者年龄46 岁,在3个卵泡中获得卵子2个,行线粒体移植后1个卵子正常受精,胚胎发育良好,移植 后获临床妊娠。[2] 3应用 迪拜的医生对经历过多次体外受精的40岁女性进行卵子“返老还童”试验时,发现该 技术可使受孕几率提高5倍。世界首个体外受精门诊创始人之一,英国最大的生育连锁中心 主席 Simon fishe教授曾向人类受精与胚胎管理局申请将该技术用于治疗20位女性。通过 微创手术切除健康的年轻女性的卵巢组织边缘的一片组织,将不成熟的卵子去除,捕获线粒 体,并在体外受精时将这些线粒体注入到女性患者的“正常”卵子中,以调动卵子的活性, 增加受孕的几率。 Fishel教授说,“这可能为不孕女性拥有自己基因的孩子提供革命性的选 五、技术优缺点 1优点 就现有的实验结果来看,线粒体移植技术已经为改善老龄生育期妇女以及反复妊娠失败 患者的胚胎质量提供了比较有效和安全的方法;突出解决了以往“卵巢控制性超促排卵 (coH)”、“卵子体外成熟(ⅣWM)”等技术带来的副作用,在解决高龄生育问题的过程中做 出了极大贡献;为人类生殖、遗传等科学技术领域带来了新的灵感 2缺点: ①费用高昂:“自体颗粒细胞线粒体移植”技术成本并不便宜,大概为14000英镑。高
2.案例 实验：选自 2002 年 7 月至 2003 年 10 月，进行体外受精-胚胎移植（IVF-ET）治疗的患 者 18 例。患者年龄 33~46 岁，因胚胎发育质量差，进行 3 次以上 IVF-ET 均未妊娠，或患者 年龄大于 37 岁。经超促排卵治疗，取出的成熟卵子少于 4 个者仅行线粒体移植；多于 4 个 者随机行线粒体移植及 ICSI。 结果：18 例患者经过超促排卵后，获得成熟卵子 168 个，其中行线粒体移植卵子 86 个， 正常受精 64 个，受精率为 74.4%；行 ICSI 卵子 82 个，正常受精 63 个，受精率为 76.8%。两 种方法的受精率比较，差异无显著意义。行线粒体移植的胚胎发育速度正常，细胞碎片较少； 移植日良好胚胎形成率为 59.4%。行 ICSI 的胚胎质量较差，移植日良好胚胎形成率为 34.9%。 两种方法良好胚胎形成率比较，差异有显著意义。移植的胚胎全部选择线粒体移植，行 ICSI 的胚胎进行冷冻保存。每个患者移植的胚胎数目为 1~3 个.18 例中 7 例获临床妊娠，4 例为 双胎，妊娠率为 38.9%，与同期行 ICSI 的平均妊娠率 41.7%接近。其中 1 例香港患者年龄 46 岁，在 3 个卵泡中获得卵子 2 个，行线粒体移植后 1 个卵子正常受精，胚胎发育良好，移植 后获临床妊娠。[2] 3.应用 迪拜的医生对经历过多次体外受精的 40 岁女性进行卵子“返老还童”试验时，发现该 技术可使受孕几率提高 5 倍。世界首个体外受精门诊创始人之一，英国最大的生育连锁中心 主席 Simon Fishel 教授曾向人类受精与胚胎管理局申请将该技术用于治疗 20 位女性。通过 微创手术切除健康的年轻女性的卵巢组织边缘的一片组织，将不成熟的卵子去除，捕获线粒 体，并在体外受精时将这些线粒体注入到女性患者的“正常”卵子中，以调动卵子的活性， 增加受孕的几率。Fishel 教授说，“这可能为不孕女性拥有自己基因的孩子提供革命性的选 项。”[3] 五、技术优缺点 1.优点： 就现有的实验结果来看，线粒体移植技术已经为改善老龄生育期妇女以及反复妊娠失败 患者的胚胎质量提供了比较有效和安全的方法；突出解决了以往“卵巢控制性超促排卵 （COH）”、“卵子体外成熟（IVM）”等技术带来的副作用，在解决高龄生育问题的过程中做 出了极大贡献；为人类生殖、遗传等科学技术领域带来了新的灵感。 2.缺点： ①费用高昂：“自体颗粒细胞线粒体移植”技术成本并不便宜，大概为 14000 英镑。高
昂的费用使得不少“卵子不振”的女士望而却步,导致技术应用进程受阻,人们也难享受到 此项新科技带来的福音 ②伦理问题:该技术中取、种卵子的步骤可引发对卵子来源、质量高低的筛选,从而实 现人工设计“完美婴儿”,跨越了医学伦理界线。 ③科学问题:具有活力的卵子,应该从自体获取,还是应该寻找另一母体获取?若从自 体获取,则各个卵子品质相近,仍然难以解决卵子随年龄而发生的遗传问题:而从另一母体 获取,不仅可能产生免疫排斥反应,外源卵子的细胞质遗传及相关疾病仍然会引发医学伦理 问题的讨论[3] 3展望: 目前,此项技术还没有广泛投入临床使用,科学家们将共同探讨基因带来的伦理等问题 并就移植线粒体在卵子内迁移和功能发挥方面,开展进一步研究。[2] 附:参考文献: ]卵子体外成熟对胞质线粒体DNA拷贝和功能的影响 2]自体颗粒细胞线粒体移植对胚胎发育的影响 [3]http://www.biodiscover.com/news/research/172469.html不是神话!新技术让卵子“返 老还童”,再获生殖突破
昂的费用使得不少“卵子不振”的女士望而却步，导致技术应用进程受阻，人们也难享受到 此项新科技带来的福音。 ②伦理问题：该技术中取、种卵子的步骤可引发对卵子来源、质量高低的筛选，从而实 现人工设计“完美婴儿”，跨越了医学伦理界线。 ③科学问题：具有活力的卵子，应该从自体获取，还是应该寻找另一母体获取？若从自 体获取，则各个卵子品质相近，仍然难以解决卵子随年龄而发生的遗传问题；而从另一母体 获取，不仅可能产生免疫排斥反应，外源卵子的细胞质遗传及相关疾病仍然会引发医学伦理 问题的讨论[3]。 3.展望： 目前，此项技术还没有广泛投入临床使用，科学家们将共同探讨基因带来的伦理等问题， 并就移植线粒体在卵子内迁移和功能发挥方面，开展进一步研究。[2] 附：参考文献： [1]卵子体外成熟对胞质线粒体 DNA 拷贝和功能的影响 [2]自体颗粒细胞线粒体移植对胚胎发育的影响 [3] http://www.biodiscover.com/news/research/172469.html 不是神话！新技术让卵子“返 老还童”，再获生殖突破
