浅谈转基因动物生物反应器 以乳腺生物反应器为例 孙扬帆15300680201 摘要:20世纪70年代初,随着限制性内切酶的发展和DNA分子杂交技术的建立, 分子生物学进入了技术化时代,基因工程学也有所发展,出现了基因重组技术, 从而开创了基因工程这一生物技术的新领域,而转基因动物生物反应器正是建立 在基因工程原理和技术的基础上发展而来的。本文将以动物乳腺生物反应器(由 于转基因动物表达重组蛋白多以乳腺、唾液腺和膀胱为靶位,而乳腺生物反应器 的研究最为引人注目)为例,探究转基因动物生物反应器的原理、应用与优缺点 关键词:乳腺生物反应器、原理、应用、优缺点 技术原理 生物反应器是指用微生物、植物、动物或人细胞,或者用专一性酶通过生物方 法将原料转化为特定产品的容器:而转基因动物(转基因动物是指经人的有意干 涉,通过实验手段,将外源基因导入动物细胞中,稳定地整合到动物基因组中, 并能遗传给子代的动物)生物反应器是以转基因动物为反应器,生产出人类所需 要的药用蛋白等 动物乳腺生物反应器是转基因动物生物反应器的一种,是指将外源基因(外源 基因在乳腺特异性表达需要乳蛋白基因的一个启动子和调控区,即引导泌乳蛋白 基因表达的序列)置于乳腺特异性调节序列之下,使之在乳腺中表达,通过回收 乳汁来获得具有重要价值的生物活性蛋白。从目前的研究成果看,与传统的原核 系统及细胞发酵系统相比,动物乳腺生产的重组蛋白产品具有以下特点:生物活 性高,无污染,纯化简单,产量高,成本低 具体操作步骤如下图所示(从融合基因转入胚胎细胞到收集蛋白质有一个过程, 包括胚胎植入、分娩和转基因动物的生长) 药用蛋白因 启动子 BamHI 启动子、 民载体万mdm 将注入 复制原点 重组①供 受精卵 羊受精卵 5份 BamhI Smal Hind ll 勤白 人乳铁蛋白基因 代孕母 的乳汁 蛋白乳汁基因牛“代孕牛胚胎
浅谈转基因动物生物反应器 ——以乳腺生物反应器为例 孙扬帆 15300680201 摘要：20 世纪 70 年代初，随着限制性内切酶的发展和 DNA 分子杂交技术的建立， 分子生物学进入了技术化时代，基因工程学也有所发展，出现了基因重组技术， 从而开创了基因工程这一生物技术的新领域，而转基因动物生物反应器正是建立 在基因工程原理和技术的基础上发展而来的。本文将以动物乳腺生物反应器（由 于转基因动物表达重组蛋白多以乳腺、唾液腺和膀胱为靶位，而乳腺生物反应器 的研究最为引人注目）为例，探究转基因动物生物反应器的原理、应用与优缺点。 关键词：乳腺生物反应器、原理、应用、优缺点 一、技术原理 生物反应器是指用微生物、植物、动物或人细胞，或者用专一性酶通过生物方 法将原料转化为特定产品的容器；而转基因动物（转基因动物是指经人的有意干 涉，通过实验手段，将外源基因导入动物细胞中，稳定地整合到动物基因组中， 并能遗传给子代的动物）生物反应器是以转基因动物为反应器，生产出人类所需 要的药用蛋白等。 动物乳腺生物反应器是转基因动物生物反应器的一种，是指将外源基因（外源 基因在乳腺特异性表达需要乳蛋白基因的一个启动子和调控区，即引导泌乳蛋白 基因表达的序列）置于乳腺特异性调节序列之下，使之在乳腺中表达，通过回收 乳汁来获得具有重要价值的生物活性蛋白。从目前的研究成果看，与传统的原核 系统及细胞发酵系统相比，动物乳腺生产的重组蛋白产品具有以下特点：生物活 性高，无污染，纯化简单，产量高，成本低。 具体操作步骤如下图所示（从融合基因转入胚胎细胞到收集蛋白质有一个过程， 包括胚胎植入、分娩和转基因动物的生长）：
技术应用 牛、羊等大型家畜能对药用蛋白进行正确的后加工,使之具有较高的生物活性, 同时这些家畜产奶量大,易于大规模的生产,因而成为乳腺生物反应器理想的动 物类型。该技术的应用主要是利用乳腺生物反应器生产药用蛋白。下面举例说明: (1)抗凝血酶Ⅲ 第一个进入临床试验的转基因蛋白产物是抗凝血酶Ⅲ(它是血液中活性凝血因 子最重要的阻碍因子,它控制着血液的凝固和纤维蛋白的溶解)将半乳糖β-酪 蛋白的启动子和含抗凝血酶Ⅲ基因序列相连,转入绵羊胚胎细胞,在转基因绵羊 的乳液中得到有生物活性的蛋白产量可达7g/。目前该蛋白正用于冠状动脉旁 路手术患者的二期临床验证。 (2)β-乳球蛋白 在实验过程中人们发现牛的β-乳球蛋白(BLG)基因非常稳定,并能在乳腺中 特异性表达。 Hyttinen等将含有5端28kb和3端19kb的牛BLG基因片段构建 成载体,转入小鼠胚胎细胞,可在转基因小鼠的乳腺中特异表达高水平的BLG 此外,还发现CpG位点的甲基化程度与BLG的表达量有关,甲基化少的转基因 小鼠乳液中BLG分泌量较大,可达1~2mg/m,而其他转基因小鼠分泌量小于 0.1mg/ml 三、技术优缺点 (一)优点 (1)生物活性高且稳定 生物反应器经历三个发展阶段包括细菌基因工程、细胞基因工程、转基因动物 生物反应器,而其中细菌基因工程的产物往往不具备生物活性,必须经过糖基化 羟基化等一系列修饰加工后才能成为有效药物的缺陷;属于转基因动物生物反应 器中的乳腺生物反应器则克服了这个缺陷,其表达产物能充分修饰且具有稳定的 生物活性。 (2)培养条件、成本低 生物反应器中的细胞基因工程因为哺乳动物细胞的培养条件要求相当苛刻、成 本太高而限制了规模生产。但是转基因哺乳动物作为个体,它的培养条件与一般 哺乳动物无异,且如果大量培养还可以产生规模效应,在一定程度上可以节约成 本 (3)纯度高、易提纯 由动物生物反应器生产的药品为纯的生物制品,避免了化学试剂及生物毒素的 污染。目前,某些药用蛋白生产可以达到每千克乳汁含有几十克,生物活性与天 然蛋白几乎完全一样,能比较容易地提纯 (二)缺点 (1)转基因动物的健康隐患 1袁建民,胡建宏,李青旺,等动物乳腺生物反映器研究进展中国农学通报,20063:2025 张忠诚动物乳腺生物反映器的原理及研究进展[中国奶牛,2006,4:912
二、 技术应用 牛、羊等大型家畜能对药用蛋白进行正确的后加工，使之具有较高的生物活性， 同时这些家畜产奶量大，易于大规模的生产，因而成为乳腺生物反应器理想的动 物类型。该技术的应用主要是利用乳腺生物反应器生产药用蛋白。下面举例说明： （1）抗凝血酶Ⅲ 第一个进入临床试验的转基因蛋白产物是抗凝血酶Ⅲ（它是血液中活性凝血因 子最重要的阻碍因子，它控制着血液的凝固和纤维蛋白的溶解）将半乳糖β-酪 蛋白的启动子和含抗凝血酶Ⅲ基因序列相连，转入绵羊胚胎细胞，在转基因绵羊 的乳液中得到有生物活性的蛋白产量可达 7g/L [1]。目前该蛋白正用于冠状动脉旁 路手术患者的二期临床验证。 （2）β-乳球蛋白 在实验过程中人们发现牛的β-乳球蛋白（BLG）基因非常稳定，并能在乳腺中 特异性表达。Hyttinen 等[2]将含有 5'端 2.8kb 和 3'端 1.9kb 的牛 BLG 基因片段构建 成载体，转入小鼠胚胎细胞，可在转基因小鼠的乳腺中特异表达高水平的 BLG， 此外，还发现 CpG 位点的甲基化程度与 BLG 的表达量有关，甲基化少的转基因 小鼠乳液中 BLG 分泌量较大，可达 1～2mg/ml，而其他转基因小鼠分泌量小于 0.1mg/ml。 三、技术优缺点 （一）优点 （1）生物活性高且稳定 生物反应器经历三个发展阶段包括细菌基因工程、细胞基因工程、转基因动物 生物反应器，而其中细菌基因工程的产物往往不具备生物活性，必须经过糖基化、 羟基化等一系列修饰加工后才能成为有效药物的缺陷；属于转基因动物生物反应 器中的乳腺生物反应器则克服了这个缺陷，其表达产物能充分修饰且具有稳定的 生物活性。 （2）培养条件、成本低 生物反应器中的细胞基因工程因为哺乳动物细胞的培养条件要求相当苛刻、成 本太高而限制了规模生产。但是转基因哺乳动物作为个体，它的培养条件与一般 哺乳动物无异，且如果大量培养还可以产生规模效应，在一定程度上可以节约成 本。 （3）纯度高、易提纯 由动物生物反应器生产的药品为纯的生物制品，避免了化学试剂及生物毒素的 污染。目前，某些药用蛋白生产可以达到每千克乳汁含有几十克，生物活性与天 然蛋白几乎完全一样，能比较容易地提纯。 （二）缺点 （1）转基因动物的健康隐患 1 袁建民，胡建宏，李青旺，等.动物乳腺生物反映器研究进展[J].中国农学通报，2006,3：20-25. 2 张忠诚.动物乳腺生物反映器的原理及研究进展[J].中国奶牛，2006,4：9-12
这是转基因技术所面临的一大问题。出生后的部分转基因个体会表现出各种生 理和免疫上的缺陷,例如为提高生产性能而制备的转基因猪出现了雌性不育、胃 溃疡和关节炎等病症。 (2)间断性 转基因动物从出生到第一次分泌乳汁,猪、羊、牛各需12、14、16个月;并 且只有雌性动物泌乳并且不连续,一般可持续2、6、10个月。乳汁分泌具有间 断性,不利于连续的生产。而转基因动物生物反应器中的如膀胱生物反应器则巧 妙避开了这一缺点:可从动物一出生就收集产物,不论动物的性别和是否处于生 殖期 (3)安全性不足 转基因动物的研究在理论和技术上尚有不完善之处,使得转入的外源基因在动 物基因组中随机整合、调节失控、遗传不稳定,表达率不高。要提高转基因的效 率,保证外源基因的有效表达,关键是基因构建的定点整合,因此安全性问题的 解决是推广这一生物技术的前提和保障 四、总结 乳腺生物反应器生产的药用蛋白可用于预防和治疗疾病,尽管在乳腺生物反应 器的研究仍面临着许多需要解决的问题,但它潜在的社会价值是无可估量的;同 时,以转基因家畜生产珍贵的药用蛋白具有重大的经济价值和社会效益。在未来 相信会有多乳种由乳腺生物反应器生产的重组蛋白上市,并且会形成市场前景广 阔和利润巨大的新生物制药行业
这是转基因技术所面临的一大问题。出生后的部分转基因个体会表现出各种生 理和免疫上的缺陷，例如为提高生产性能而制备的转基因猪出现了雌性不育、胃 溃疡和关节炎等病症。 （2）间断性 转基因动物从出生到第一次分泌乳汁，猪、羊、牛各需 12、14、16 个月；并 且只有雌性动物泌乳并且不连续，一般可持续 2、6、10 个月。乳汁分泌具有间 断性，不利于连续的生产。而转基因动物生物反应器中的如膀胱生物反应器则巧 妙避开了这一缺点：可从动物一出生就收集产物，不论动物的性别和是否处于生 殖期。 （3）安全性不足 转基因动物的研究在理论和技术上尚有不完善之处，使得转入的外源基因在动 物基因组中随机整合、调节失控、遗传不稳定，表达率不高。要提高转基因的效 率，保证外源基因的有效表达，关键是基因构建的定点整合，因此安全性问题的 解决是推广这一生物技术的前提和保障。 四、总结 乳腺生物反应器生产的药用蛋白可用于预防和治疗疾病，尽管在乳腺生物反应 器的研究仍面临着许多需要解决的问题，但它潜在的社会价值是无可估量的；同 时，以转基因家畜生产珍贵的药用蛋白具有重大的经济价值和社会效益。在未来， 相信会有多乳种由乳腺生物反应器生产的重组蛋白上市，并且会形成市场前景广 阔和利润巨大的新生物制药行业