基因编辑技术 毛苇12307130186 基因编辑技术是一种能精确修饰生物基因组,实现对基因定点敲除和外源基 因定点整合的技术。早期的技术主要依赖于基因同源重组(基因打靶,Gene Targeting)及体细胞核移植技术来完成对特定基因的改造及个体的发育,但用此 技术制备基因工程动物模型过程较长和花费较大,且由于基因的修饰是在ES细 胞中进行,目前的基因打靶技术还只能用于制备基因改变的小鼠和大鼠动物模型。 近年来,新的靶向基因组编辑工具不断被发现,其中包括锌指核酸酶(Zinc Finger Nucleases,ZFN)、转录激活子样效应因子核酸酶( Transcription Activator- like Effector Nucleases, TALENs)和规律成簇间隔短回文重复 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPRS/Cas 9) 系统。由于篇幅所限,本文主要介绍 TALEN(转录激活子样效应因子核酸酶)技 术 技术原理 TALE蛋白家族是黄单胞杆菌感染植物时分泌的蛋白分子,其分子结构由 NA结合结构域,核定位信号和靶基因转录催化结构域组成。其中,DNA结合结 构域由多个单体组成,每个单体可以与一个靶位点的核苷酸结合。每个单体是 34个氨基酸残基串联重复组成,第12和13位氨基酸高度特异(RⅦD),决定了 对特异性核苷酸的识别。科硏人员发现TAL蛋白DNA结合域的氨基酸序列与其靶 位点的核酸序列有较恒定的对应关系。利用此恒定对应关系,构建与核酸内切酶 的融合蛋白,在特异位点打断目标基因组DNA序列,从而可在该位点进行DNA 编辑修饰操作。 人工构建的 TALEN系统由核定位信号,TALE蛋白,半重复片段,N-末端结 构域和FokI催化结构域组成。(见下图) TALE Fokl A2 CTGCAAC里cA為c N工→A N □°m LTPDAVVAIASNIGGKQALETVORLLPVLCQD HG
基因编辑技术 毛苇 12307130186 基因编辑技术是一种能精确修饰生物基因组，实现对基因定点敲除和外源基 因定点整合的技术。早期的技术主要依赖于基因同源重组( 基因打靶，Gene Targeting)及体细胞核移植技术来完成对特定基因的改造及个体的发育，但用此 技术制备基因工程动物模型过程较长和花费较大，且由于基因的修饰是在 ES 细 胞中进行，目前的基因打靶技术还只能用于制备基因改变的小鼠和大鼠动物模型。 近年来，新的靶向基因组编辑工具不断被发现，其中包括锌指核酸酶(Zinc Finger Nucleases，ZFN)、转录激活子样效应因子核酸酶(Transcription Activator-like Effector Nucleases, TALENs)和规律成簇间隔短回文重复 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPRS/Cas9) 系统。由于篇幅所限，本文主要介绍 TALEN（转录激活子样效应因子核酸酶）技 术。 一、 技术原理 TALE 蛋白家族是黄单胞杆菌感染植物时分泌的蛋白分子，其分子结构由 DNA 结合结构域，核定位信号和靶基因转录催化结构域组成。其中，DNA 结合结 构域由多个单体组成，每个单体可以与一个靶位点的核苷酸结合。每个单体是 34 个氨基酸残基串联重复组成，第 12 和 13 位氨基酸高度特异（RVD），决定了 对特异性核苷酸的识别。科研人员发现 TAL 蛋白 DNA 结合域的氨基酸序列与其靶 位点的核酸序列有较恒定的对应关系。利用此恒定对应关系，构建与核酸内切酶 的融合蛋白，在特异位点打断目标基因组 DNA 序列，从而可在该位点进行 DNA 编辑修饰操作。 人工构建的 TALEN 系统由核定位信号，TALE 蛋白，半重复片段，N-末端结 构域和 FokI 催化结构域组成。（见下图）
两个 TALEN分子分别结合到靶点两侧,FokI形成二聚体并发挥切割作用 生成双链断端,细胞内的非同源性末端接合(Non- homologous end joining,NEJ) 修复杋制启动,断口被修复同时随机的删除和插入一定数量的碱基,造成移码导 致基因失活,因此也就达到了进行基因敲除的目的。原理图如下 左臂 FokI聚合 右臂 技术应用 在科研领域, TALEN技术主要用于DNA水平的基因敲除、DNA水平的单碱基 修复、DNA水平的定点插入等。一般用于建立基因敲除/敲入的真核细胞系和建 立基因敲除/敲入的真核生物模型。现已经成功应用于细胞、斑马鱼、果蝇、大 鼠、小鼠及植物上,并且被研究者不断地尝试应用到其他更多的物种。 在其他领域,以 TALEN技术为代表的基因编辑技术也扮演着重要的角色。在 农业领域,该技术可以人为改造基因序列,使之符合人们的要求,如改良水稻等 粮食作物;在医疗领域,基因编辑技术可以更加准确、深入地了解疾病发病机理 和探究基因功能,可以改造人的基因,达到基因治疗的目的等。因此,基因组编 辑技术具有极其广泛的发展前景和应用价值。 技术优缺点 TALEN技术有如下优势: 1) TALEN筛选更为简便,不需要复杂的筛选过程,同时只需要简单的分 子克隆技术就可以在实验室制造出高效的 TALEN; 2) TALEN特异识别DNA序列的能力强; 3)由于 TALEN结合DNA序列更为严格,因此特异性更强,相应的效率 也高。 但是目前 TALEN技术也存在一些问题,需进一步去研究解决,主要包括以下 几个方面:首先,识别20个碱基序列的 TALEN蛋白,设计时可能含有一千多个氨 基酸,因而可能会引起机体的免疫反应,这将降低 TALEN在细胞中的作用;其次
两个 TALEN 分子分别结合到靶点两侧，FokI 形成二聚体并发挥切割作用， 生成双链断端，细胞内的非同源性末端接合(Non-homologous end joining, NHEJ) 修复机制启动，断口被修复同时随机的删除和插入一定数量的碱基，造成移码导 致基因失活，因此也就达到了进行基因敲除的目的。原理图如下： 二、 技术应用 在科研领域，TALEN 技术主要用于 DNA 水平的基因敲除、DNA 水平的单碱基 修复、DNA 水平的定点插入等。一般用于建立基因敲除/敲入的真核细胞系和建 立基因敲除/敲入的真核生物模型。现已经成功应用于细胞、斑马鱼、果蝇、大 鼠、小鼠及植物上，并且被研究者不断地尝试应用到其他更多的物种。 在其他领域，以 TALEN 技术为代表的基因编辑技术也扮演着重要的角色。在 农业领域，该技术可以人为改造基因序列，使之符合人们的要求，如改良水稻等 粮食作物；在医疗领域，基因编辑技术可以更加准确、深入地了解疾病发病机理 和探究基因功能，可以改造人的基因，达到基因治疗的目的等。因此，基因组编 辑技术具有极其广泛的发展前景和应用价值。 三、 技术优缺点 TALEN 技术有如下优势: 1) TALEN 筛选更为简便，不需要复杂的筛选过程，同时只需要简单的分 子克隆技术就可以在实验室制造出高效的 TALEN; 2) TALEN 特异识别 DNA 序列的能力强; 3) 由于 TALEN 结合 DNA 序列更为严格，因此特异性更强，相应的效率 也高。 但是目前 TALEN 技术也存在一些问题，需进一步去研究解决，主要包括以下 几个方面:首先，识别 20 个碱基序列的 TALEN 蛋白，设计时可能含有一千多个氨 基酸,因而可能会引起机体的免疫反应，这将降低 TALEN 在细胞中的作用;其次
TAL酬N也存在脱靶的问题,这将导致其效率降低;此外,目前 TALEN技术的应用 主要集中在基因敲除方面,该技术是否适合大片段的基因插入还需进一步研究。 参考文献 1.韩勇,杨杰,李子彬,等.新型基因组编辑技术研究进展[J.动物医学进展, 2015 2.杨发誉,葛香连,谷峰.新型靶向基因组编辑技术硏究进展[J].中国生物 工程杂志,2014,02期.DoI:doi:10.13523/j.cb.20140216
TALEN 也存在脱靶的问题，这将导致其效率降低; 此外，目前 TALEN 技术的应用 主要集中在基因敲除方面，该技术是否适合大片段的基因插入还需进一步研究。 参考文献 1. 韩勇, 杨杰, 李子彬,等. 新型基因组编辑技术研究进展[J]. 动物医学进展, 2015. 2. 杨发誉, 葛香连, 谷峰. 新型靶向基因组编辑技术研究进展[J]. 中国生物 工程杂志, 2014, 02 期. DOI:doi:10.13523/j.cb.20140216