荧光原位杂交(f1 uorescence in situ hybridization,FISH)在产 前诊断中的应用 12307100098侯鑫博 It I b Ne 仅信同 1.荧光原位杂交技术原理: FISH的基本原理是利用已知核酸序列作为探针,以 荧光素直接标记或以非放射性物质标记后与靶DNA进行 杂交,再通过免疫细胞化学过程连接上荧光素标记物,最 后在荧光显微镜下观察杂交信号,从而对标本待测核酸进③ 行定量、定性及定位分析。 2荧光原位杂交技术优势 在评价重大出生缺陷性疾病的影响时,染色体异常尤其重要,其中染色体数目异常占大 多数。其中最常见的非整倍体是第21、18、13和X、Y染色体数目改变。胎儿染色体数 异常可导致胎儿流产、死胎或死产,存活的患儿常表现为各种综合征,涉及多发畸形、智 力低下等 荧光原位杂交技术应用于产前诊断具有多方面的优势 ①利用特异性探针,可在1~2天内对21、18、13、X、Y等常见的染色体数目 异常进行快速诊断,且可靠性达99.8%以上,为产前诊断的快速检测提供了新的有效手段
荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH）在产 前诊断中的应用 12307100098 侯鑫博 1.荧光原位杂交技术原理： FISH 的基本原理是利用已知核酸序列作为探针，以 荧光素直接标记或以非放射性物质标记后与靶 DNA 进行 杂交，再通过免疫细胞化学过程连接上荧光素标记物，最 后在荧光显微镜下观察杂交信号，从而对标本待测核酸进 行定量、定性及定位分析。 2.荧光原位杂交技术优势 在评价重大出生缺陷性疾病的影响时，染色体异常尤其重要，其中染色体数目异常占大 多数。其中最常见的非整倍体是第 21、 18、 13 和 X、 Y 染色体数目改变。胎儿染色体数 目 异常可导致胎儿流产、死胎或死产，存活的患儿常表现为各种综合征，涉及多发畸形、智 力低下等。 荧光原位杂交技术应用于产前诊断具有多方面的优势。 ①利用特异性探针，可在 1 ～2 天内对 21、 18、 13、 X、 Y 等常见的染色体数目 异常进行快速诊断，且可靠性达 99. 8% 以上，为产前诊断的快速检测提供了新的有效手段
FISH可在24~48h内提供结果,结果的可靠性和准确性较髙。其假阳性或假阴性的发 生率约为0.1 2%;与传统核型分析相符率达99.8%。 ②FISH技术操作简单,所需样本量少,诊断结果快,避免患者在焦虑中等待较长时间 让医生尽早做出诊断,制定诊疗方案。应用该技术进行产前诊断逐渐被妊娠妇女所接受,并 得到社会公认。 3.FISH检测步骤 ①样本玻片制备:离心收集细胞,去上清,胶原酶B消化,KCl低渗溶液温育,预固定,固 定,去上清制成细胞悬液,滴片并老化 ②玻片预处理:SSC溶液漂洗,胃蛋白酶工作液浸泡1σmin,SSC溶液漂洗,置于梯度乙醇 中脱水,自然干燥 ③变性杂交:探针配制,离心,将10μ1探针混合物滴加于玻片杂交区域,立即加盖盖玻 片,用橡皮胶封边,75℃共变性5min,42℃杂交16h ④玻片洗涤:SSC溶液漂洗,乙醇漂洗。 ⑤复染:暗处自然干燥,DAPI复染剂复染,暗处放置。 ⑥结果观察与判断:随机计数50个羊水细胞,判断标准为 正常:90%以上的细胞显示正常信号类型; 异常:60%以上细胞出现异常信号类型 无法判读:扩大计数至100个细胞,以判断最后结果。 4荧光原位杂交技术在我国的发展前景 出生缺陷已成为制约我国经济发展、影响我国人口素质的严重卫生问题,因此,加强产 前诊断的研究应用及普及开展刻不容缓。与传统G显带核型分析比较,FISH操作简单,需 要样本量少,诊断结果快,而且灵敏度高、特异性强,适应了临床快速诊断的需要。在国外 些产前诊断中心,FISH和PCR在产前诊断上的应用己经逐步替代了部分传统的核型分析, 而且自动化系统的出现更提高了FISH效率,不仅缩短了患者等待诊断报告的时间,而且节 省了费用,解放了人力。但在我国大多数实验室,相对于传统的核型分析,FISH由于设备、 试剂成本较高,费用昂贵,尚未大规模应用于临床诊断,但随着技术的日渐成熟和发展,方 法的稳定性不断提高,试剂国产化带来的成本不断降低,FISH技术将在产前诊断领域发挥越 来越大的作用
FISH 可在 24 ～ 48 h 内提供结果，结果的可靠性和 准确性较高。其假阳性或假阴性的发 生率约为 0. 1 ～ 0. 2%; 与传统核型分析相符率达 99. 8%。 ②FISH 技术操作简单，所需样本量少，诊断结果快，避免患者在焦虑中等待较长时间， 让医生尽早做出诊断，制定诊疗方案。应用该技术进行产前诊断逐渐被妊娠妇女所接受， 并 得到社会公认。 3. FISH 检测步骤 ①样本玻片制备: 离心收集细胞，去上清，胶原酶 B 消化，KCl 低渗溶液温育，预固定，固 定，去上清制成细胞悬液，滴片并老化。 ② 玻片预处理: SSC 溶液漂洗，胃蛋白酶工作液浸泡 10min，SSC 溶液漂洗，置于梯度乙醇 中脱水，自然干燥。 ③ 变性杂交: 探针配制，离心，将 10μl 探针混合物滴加于玻片杂交区域，立即加盖盖玻 片，用 橡皮胶封边，75℃共变性 5min，42℃杂交 16h。 ④ 玻片洗涤: SSC 溶液漂洗，乙醇漂洗。 ⑤复染: 暗处自然干燥，DAPI 复染剂复染，暗处放置。 ⑥结果观察与判断:随机计数 50 个羊水细胞，判断标准为: 正常: 90% 以上的细胞显示正常信号类型； 异常: 60%以上细胞出现异常信号类型； 无法判读: 扩大计数至 100 个细胞，以判断最后结果。 4.荧光原位杂交技术在我国的发展前景 出生缺陷已成为制约我国经济发展、影响我国人口素质的严重卫生问题，因此，加强产 前诊断的研究应用及普及开展刻不容缓。与传统 G 显带核型分析比较，FISH 操作简单， 需 要样本量少，诊断结果快，而且灵敏度高、特异性强，适应了临床快速诊断的需要。在国外 一些产前诊断中心，FISH 和 PCR 在产前诊断上的应用已经逐步替代了部分传统的核型分析， 而且自动化系统的出现更提高了 FISH 效率，不仅缩短了患者等待诊断报告的时间，而且节 省了费用，解放了人力。但在我国大多数实验室，相对于传统的核型分析， FISH 由于设备、 试剂成本较高，费用昂贵，尚未大规模应用于临床诊断，但随着技术的日渐成熟和发展，方 法的稳定性不断提高，试剂国产化带来的成本不断降低，FISH 技术将在产前诊断领域发挥越 来越大的作用
5荧光原位杂交技术的其他应用 I.染色体结构变异与非整倍体的检测: 荧光原位杂交简化了染色体结构变异的检测。利用原位 杂交可比较容易地检测出缺失、附加或替换的染色体。 II.基因扩增和缺失的测: 园组DNA FISH空间分辨率和敏感性使得亲本和扩增基 因在抗病虫害细胞中定位成为可能。同时用 FISH可定位转基因植物中外源基因位置和拷 实检祥本标记 Cy3(绿色荧光 贝数,此法在番茄、烟草、大麦、小麦、黑麦 等作物中已获成功。利用FISH技术也可检 两个样品共同 杂交一张芯片 测一些与遗传性疾病相关的基因缺失,如成 数据分析,检DNA 功检测了 aniridia疾病(一种虹膜缺失的罕 见遗传异常疾病)患者的缺失基因 III.FISH技术为着丝粒结构研究提供了重要手段。同时 应用FISH技术可直接观察染色体端粒,这简化了染色体 在核内的结构和功能研究 兴一 染色 IV.基因作图:用FISH技术可直接检测DNA在染色体上 的位置,所确定位置是基因在染色体上实际的物理位置。 由于原位杂交不受位点内变异和位点间拷贝数的影 响,FISH技术已成为重复序列和多基因家族作图的重要手 段。 V.染色体RNA和基因组进化研究:染色体的主要成分包括 DNA和组蛋白,除此之外,还有非组蛋白和RNA。对这些物 质在染色体中分布进行精确定位是研究染色体高级结构和 构建染色体模型的关键所在。FISH技术为上述研究提供了 有效手段
5.荧光原位杂交技术的其他应用 I．染色体结构变异与非整倍体的检测: 荧光原位杂交简化了染色体结构变异的检测。利用原位 杂交可比较容易地检测出缺失、 附加或替换的染色体。 II．基因扩增和缺失的测: FISH 空间分辨率和敏感性使得亲本和扩增基 因在抗病虫害细胞中定位成为可能。同时用 FISH 可定位转基因植物中外源基因位置和拷 贝数 ,此法在番茄、烟草、大麦、小麦、黑麦 等作物中已获成功。利用 FISH 技术也 可检 测一些与遗传性疾病相关的基因缺失 ,如成 功检测了 aniridia 疾病(一种虹膜缺失的罕 见遗传异常疾病)患者的缺失基因。 III．FISH 技术为着丝粒结构研究提供了重要手段。同时 应用 FISH 技术可直接观察染色体端粒 ,这简化了染色体 在核内的结构和功能研究。 IV．基因作图:用 FISH 技术可直接检测 DNA 在染色体上 的位置 ,所确定位置是基因在染色体上实际的物理位置。 由于原位杂交不受位点内变异和位点间拷贝数的影 响,FISH 技术已成为重复序列和多基因家族作图的重要手 段。 V．染色体 RNA 和基因组进化研究:染色体的主要成分包括 DNA 和组蛋白 ,除此之外，还有非组蛋白和 RNA。对这些物 质在染色体中分布进行精确定位是研究染色体高级结构和 构建染色体模型的关键所在。FISH 技术为上述研究提供了 有效手段