MLPA技术 徐程明14307130055 、生物技术名称及简介 多重连接探针扩增技术( multiplex ligation- dependent probe amplification,MLPA),是近几年发展起来的一种针对待检DNA序列进行定 性和半定量分析的新技术 设计好的探针 引物X杂交序列杂交序列填充片段引物Y 该技术高效、特异,在一合成的 M13衍生的 寡核苷酸 寡核苷酸 次反应中可以检测45个 甲基化 非甲基化 研究序列 核苷酸序列拷贝数的改变 多探针杂交 目前已经应用于多个领域 ↓ 连连 多种疾病的研究。 性内切酶消 MLPA的原理 MLPA的基本原理包括探针 仅连接的探针扩增出产物 和靶序列DMA进行杂交,之 片段分析 通过连接、PCR扩增,产物通 过毛细管电泳分离及数据收集,DNA分析软件对收集的数据进行分析最后得出结 论。每个MLPA探针包括两个荧光标记的寡核苷酸片段,一个由化学合成,一个 由M13噬菌体衍生法制备;每个探针都包括一段引物序列和一段特异性序列。在 MLPA反应中,两个寡核苷酸片段都与靶序列进行杂交,之后使用连接酶连接两 部分探针。连接反应高度特异,只有当两个探针与靶序列完全杂交,即靶序列与 探针特异性序列完全互补,连接酶才能将两段探针连接成一条完整的核酸单链 反之,如果靶序列与探针序列不完全互补,即使只有一个碱基的差别,就会导致 杂交不完全,使连接反应无法进行。连接反应完成后,用一对通用引物扩增连接 好的探针,每个探针的扩增产物的长度都是唯一的,范围在130~480bp。最后 通过毛细管电泳分离扩增产物, Genemarker软件分析,得出结论。只有当连接 反应完成,才能进行随后的PCR扩增并收集到相应探针的扩增峰,如果检测的靶 序列发生点突变或缺失、扩増突变,那么相应探针的扩増峰便会缺失、降低或增 加,因此,根据扩增峰的改变就可判断靶序列是否有拷贝数的异常或点突变存在。 、MLPA的应用
MLPA 技术 徐程明 14307130055 一、生物技术名称及简介 多 重 连 接 探 针 扩 增 技 术 （ multiplex ligation-dependent probe amplification ,MLPA），是近几年发展起来的一种针对待检 DNA 序列进行定 性和半定量分析的新技术。 该技术高效、特异，在一 次反应中可以检测 45 个 核苷酸序列拷贝数的改变， 目前已经应用于多个领域、 多种疾病的研究。 二、MLPA 的原理 MLPA的基本原理包括探针 和靶序列 DNA 进行杂交，之后 通过连接、PCR 扩增，产物通 过毛细管电泳分离及数据收集，DNA 分析软件对收集的数据进行分析最后得出结 论。每个 MLPA 探针包括两个荧光标记的寡核苷酸片段，一个由化学合成，一个 由 M13 噬菌体衍生法制备；每个探针都包括一段引物序列和一段特异性序列。在 MLPA 反应中，两个寡核苷酸片段都与靶序列进行杂交，之后使用连接酶连接两 部分探针。连接反应高度特异，只有当两个探针与靶序列完全杂交，即靶序列与 探针特异性序列完全互补，连接酶才能将两段探针连接成一条完整的核酸单链； 反之，如果靶序列与探针序列不完全互补，即使只有一个碱基的差别，就会导致 杂交不完全，使连接反应无法进行。连接反应完成后，用一对通用引物扩增连接 好的探针，每个探针的扩增产物的长度都是唯一的，范围在 130～480bp。最后， 通过毛细管电泳分离扩增产物，Genemarker 软件分析，得出结论。只有当连接 反应完成，才能进行随后的 PCR 扩增并收集到相应探针的扩增峰，如果检测的靶 序列发生点突变或缺失、扩增突变，那么相应探针的扩增峰便会缺失、降低或增 加，因此，根据扩增峰的改变就可判断靶序列是否有拷贝数的异常或点突变存在。 三、MLPA 的应用
背景假肥大型进行性肌营养不良症( Duchenne and Becker muscular ystrophy,DMD/BD)、脊髓性肌肉萎缩症( Spinal muscular atrophy,SMA)都 是常见的的致死性单基因遗传病,目前暂无有效的治疗手段,所以检测患者致病 基因,开展携带者筛查和产前诊断以避免患儿的出生显得尤为重要。传统的SMA 基因诊断方法为PCR-酶切法,仅限于检测SMN1基因7号外显子纯合缺失,未能检 出携带者。基于上述方法的缺陷和临床需要,我们急需建立高效、准确、灵敏并 适用于临床大样本检测、不依赖患者信息的携带者筛査平台,完善 DMD/BMD、SMA 基因诊断体系。目的建立单基因遗传病DMD/B⑩D与SMA的多重连接依赖性探针 扩增技术(MLPA)检测平台,提高患者诊断率和携带者检出率,并指导再生育。MPA 的应用不依赖患者信息,可有效对DⅧ/BⅧ、SMA致病基因拷贝数进行相对定量, 检出遗传缺陷携带者和提高患者诊断率。 四、MLPA的优缺点 MLPA结合了DNA探针杂交和PCR技术,具有以下优点 l.MLPA技术能用于检测许多不同的疾病,差别只是探针不同而已。 2MLPA是多重反应,一个反应提供了将近50个靶位点 3.MLPA反应费用较低 4.MLPA重复性好,简单易操作,可以同时检测多个样本。 5.MLPA敏感性高,仅需20ng人DNA,结果不受样品DNA量的影响。 6.MLPA能区分单个碱基的差异,能检测少量的拷贝数改变,如2个,3个拷贝数 改变。 7.MLPA可以检测单一外显子的缺失和插入突变。 8.所需仪器易得到。 MLPA虽然具有很大优点,但也有其局限性 1、需要精确测量DNA的浓度,样本容易被污染 2、不能用于单个细胞的检测。 3、MPA用于检测基因的缺失或重复,不适合检测未知的点突变类型 4、不能检测染色体的平衡易位。 总之,作为一种新的技术,随着医学与生物学的发展,MPA会日益完善,其应 用领域也会日益广泛
背 景 假 肥 大 型 进 行 性 肌 营 养 不 良 症 (Duchenne and Becker muscular dystrophy, DMD/BMD)、脊髓性肌肉萎缩症(Spinal muscular atrophy, SMA)都 是常见的的致死性单基因遗传病,目前暂无有效的治疗手段,所以检测患者致病 基因,开展携带者筛查和产前诊断以避免患儿的出生显得尤为重要。传统的 SMA 基因诊断方法为 PCR-酶切法,仅限于检测 SMN1 基因 7 号外显子纯合缺失,未能检 出携带者。基于上述方法的缺陷和临床需要,我们急需建立高效、准确、灵敏并 适用于临床大样本检测、不依赖患者信息的携带者筛查平台,完善 DMD/BMD、SMA 基因诊断体系。 目的建立单基因遗传病 DMD/BMD 与 SMA 的多重连接依赖性探针 扩增技术(MLPA)检测平台,提高患者诊断率和携带者检出率,并指导再生育。MLPA 的应用不依赖患者信息,可有效对 DMD/BMD、SMA 致病基因拷贝数进行相对定量, 检出遗传缺陷携带者和提高患者诊断率。 四、MLPA 的优缺点 MLPA 结合了 DNA 探针杂交和 PCR 技术，具有以下优点 1.MLPA 技术能用于检测许多不同的疾病，差别只是探针不同而已。 2.MLPA 是多重反应，一个反应提供了将近 50 个靶位点。 3.MLPA 反应费用较低。 4.MLPA 重复性好，简单易操作，可以同时检测多个样本。 5.MLPA 敏感性高，仅需 20 ng 人 DNA，结果不受样品 DNA 量的影响。 6.MLPA 能区分单个碱基的差异，能检测少量的拷贝数改变，如 2 个，3 个拷贝数 改变。 7.MLPA 可以检测单一外显子的缺失和插入突变。 8.所需仪器易得到。 MLPA 虽然具有很大优点，但也有其局限性 1、需要精确测量 DNA 的浓度，样本容易被污染。 2、不能用于单个细胞的检测。 3、MLPA 用于检测基因的缺失或重复，不适合检测未知的点突变类型。 4、不能检测染色体的平衡易位。 总之，作为一种新的技术，随着医学与生物学的发展，MLPA 会日益完善，其应 用领域也会日益广泛