冷冻卵子技术 毛家齐17301050232 技术简介 冷冻卵子,又称雪藏卵子,即取母体健康时的卵子冷冻,防止卵子随人体衰老, 待想生育时取出冷冻卵子复苏使用即 可。近年来,随着冷冻技术及复苏技 會9学 术的改进,冷冻卵子技术已逐渐趋向 成熟,并被越来越多的学者视为辅助 生殖技术(ART)中一项重要的组成部 分。冷冻卵子技术分为慢速冷冻/快 速解冻(冷冻速率为0.3~2℃/min)和 快速冷冻/解冻法或称玻璃化冷冻法 (降温速率超过20000℃/min)。 二、技术原理 1、慢速冷冻/快速解冻 冷冻导致水结晶成冰,从而破坏卵 细胞内的细微结构。冷冻过程中, 细胞内冰晶形成和高浓度溶液是 导致卵子或者胚胎死亡的重要因 冷冻保护 置换 素。因此慢速冷冻的目的在于面临 冰晶形成、渗透性损伤或低温损伤 仍能维持其复杂的卵子结构。诱导 剂溶液 冰晶形成的过程称为植冰 ( seeding)。它在细胞冷冻过程中 是一个非常重要的步骤。因为保护液的冰点一般在-3~-4℃,当温度降到冰点 时,溶液并不结冰,而往往要在一10℃或 更低温度才能结冰。到达冰点以下温度而 不结冰称作“过冷现象”。但是,一旦溶 液开始结冰,就要释放潜热,使温度回升 到冰点,接着又急剧下降,细胞往往就在 温度剧烈变化中死亡。同时,由于在深度 过冷状态下,分子运动速度减慢,在结冰 时,可以生成大的冰晶伤害细胞。为了防 止深度过冷现象的产生,一般都在稍低于冰点几度时,进行植冰。植冰后,冷冻 速率降至0.3~0.5℃/min,直到达到一定程度的低温(通常为-30℃ 150℃),然后卵细胞被储存于液氮中。解冻是个快速温度变化的过程,复温速率 超过360℃/min,这个过程预防了冰晶的再形成 2、玻璃化冷冻法 玻璃化冷冻法的原理是用髙浓度的渗透性冷冻保护溶液(如乙二醇(EG)、二甲 基亚砜(DMS0)、聚乙二醇等)和非渗透性保护剂蔗糖将细胞内水分置换出来, 经急速降温由液态转化为外形似玻璃状的非晶体化固体状态,在-196℃的低温环
冷冻卵子技术 毛家齐 17301050232 一、 技术简介 冷冻卵子，又称雪藏卵子，即取母体健康时的卵子冷冻，防止卵子随人体衰老， 待想生育时取出冷冻卵子复苏使用即 可。近年来，随着冷冻技术及复苏技 术的改进，冷冻卵子技术已逐渐趋向 成熟，并被越来越多的学者视为辅助 生殖技术（ART）中一项重要的组成部 分。冷冻卵子技术分为慢速冷冻／快 速解冻（冷冻速率为 0.3～2℃/min）和 快速冷冻/解冻法或称玻璃化冷冻法 （降温速率超过 20000℃/min）。 二、 技术原理 1、 慢速冷冻／快速解冻 冷冻导致水结晶成冰，从而破坏卵 细胞内的细微结构。冷冻过程中， 细胞内冰晶形成和高浓度溶液是 导致卵子或者胚胎死亡的重要因 素。因此慢速冷冻的目的在于面临 冰晶形成、渗透性损伤或低温损伤 仍能维持其复杂的卵子结构。诱导 冰晶形成的过程称为植冰 （seeding）。它在细胞冷冻过程中 是一个非常重要的步骤。因为保护液的冰点一般在－3～－4℃，当温度降到冰点 时，溶液并不结冰，而往往要在－10℃或 更低温度才能结冰。到达冰点以下温度而 不结冰称作“过冷现象”。但是，一旦溶 液开始结冰，就要释放潜热，使温度回升 到冰点，接着又急剧下降，细胞往往就在 温度剧烈变化中死亡。同时，由于在深度 过冷状态下，分子运动速度减慢，在结冰 时，可以生成大的冰晶伤害细胞。为了防 止深度过冷现象的产生，一般都在稍低于冰点几度时，进行植冰。植冰后，冷冻 速率降至 0.3～0.5℃/min，直到达到一定程度的低温（通常为－30℃～－ 150℃），然后卵细胞被储存于液氮中。解冻是个快速温度变化的过程，复温速率 超过 360℃/min，这个过程预防了冰晶的再形成。 2、 玻璃化冷冻法 玻璃化冷冻法的原理是用高浓度的渗透性冷冻保护溶液（如乙二醇（EG）、二甲 基亚砜（DMSO）、聚乙二醇等）和非渗透性保护剂蔗糖将细胞内水分置换出来， 经急速降温由液态转化为外形似玻璃状的非晶体化固体状态，在-196℃的低温环
境中将细胞或组织固定在玻璃化状态。它与慢速冷冻法的主要区别为玻璃化过程 中卵子及其周围环境为类似玻璃态的结构而非冰晶状态 髙浓度的冷冻保护剂可以避免仍需要预防冰晶形成。因此该技术需要达到一定的 降温速率(>20000℃/min),使之避免广泛的去玻璃化和再结晶,快速渡过玻璃 化的冰点,避免细胞内外冰晶形成,减少对细胞的损害,提高冷冻复苏率, 技术应用 1、卵子冷冻的应用范围 有效的卵子冷冻系统的建立对辅助生殖的临床工作起到了很重要的作用。参考2 013年美国生育年会颁布的指导原则,其主要应用如下:将要接受肿瘤、化疗而 损伤卵巢功能患者,术前冷冻卵子,可为今后保留生育机会;遗传性疾病需要预 防性切除输卵管卵巢(如BRCA突变)、卵巢早衰:体外受精取卵日取精失败: 因某些原因不能冻存胚胎;希望延迟生育年龄;建立卵子库;调配供卵与受孕之 间的时间,提供给受卵者各种生理状况调至适于受孕的最佳时机以充分的准备时 间 2、慢速冷冻卵子技术的应用 慢速冷冻是早期冷冻卵子的方法,需要自动化程序降温仪,成本较高。目前慢速 冷冻常用的冷冻保护剂是丙二醇(PROH)和蔗糖,复苏率约50%~90%。目前研 究表明,慢速冷冻的致命弊端是再结晶过程中细胞内小冰晶的再次形成。为了减 少细胞内冰晶形成对卵子可能造成的损伤,在冷冻液和解冻液中增加蔗糖浓度(0. 1~0.3mol/L),可提高卵子的冻融存活率和受精率。此外,延长卵子在平衡液 中的存留时间(10-20min)可以使卵子充分脱水,在冷冻液中用胆碱取代钠可以 oocyte/∈ mbryo 3时 增加细胞膜的稳定,实现更好的冷冻复苏效果。 3、玻璃化冷冻的临床应用 玻璃化冷冻的卵母细胞复苏率在80%~90%,其临床应用价值已被众多文献证实。 有研究表明,不同浓度(30%~40%)的细胞内冷冻保护剂如EG、DMSO、PROH单 独或组合,联合细胞外保护剂蔗糖冷冻卵子均可获得较满意的冷冻复苏率。不同 的冷冻载体 CroLeafs、 CryoTops、 CryLoops、 Cryotips等均可承载包含卵子的
境中将细胞或组织固定在玻璃化状态。它与慢速冷冻法的主要区别为玻璃化过程 中卵子及其周围环境为类似玻璃态的结构而非冰晶状态。 高浓度的冷冻保护剂可以避免仍需要预防冰晶形成。因此该技术需要达到一定的 降温速率（>20000℃/min），使之避免广泛的去玻璃化和再结晶，快速渡过玻璃 化的冰点，避免细胞内外冰晶形成，减少对细胞的损害，提高冷冻复苏率。 三、 技术应用 1、 卵子冷冻的应用范围 有效的卵子冷冻系统的建立对辅助生殖的临床工作起到了很重要的作用。参考 2 013 年美国生育年会颁布的指导原则，其主要应用如下：将要接受肿瘤、化疗而 损伤卵巢功能患者，术前冷冻卵子，可为今后保留生育机会；遗传性疾病需要预 防性切除输卵管卵巢（如 BRCA 突变）、卵巢早衰；体外受精取卵日取精失败； 因某些原因不能冻存胚胎；希望延迟生育年龄；建立卵子库；调配供卵与受孕之 间的时间，提供给受卵者各种生理状况调至适于受孕的最佳时机以充分的准备时 间。 2、 慢速冷冻卵子技术的应用 慢速冷冻是早期冷冻卵子的方法，需要自动化程序降温仪，成本较高。目前慢速 冷冻常用的冷冻保护剂是丙二醇（PROH）和蔗糖，复苏率约 50%～90%。 目前研 究表明，慢速冷冻的致命弊端是再结晶过程中细胞内小冰晶的再次形成。为了减 少细胞内冰晶形成对卵子可能造成的损伤，在冷冻液和解冻液中增加蔗糖浓度（0. 1～0.3mol/L），可提高卵子的冻融存活率和受精率。此外，延长卵子在平衡液 中的存留时间（10-20min）可以使卵子充分脱水，在冷冻液中用胆碱取代钠可以 增加细胞膜的稳定，实现更好的冷冻复苏效果。 3、 玻璃化冷冻的临床应用 玻璃化冷冻的卵母细胞复苏率在 80%～90%，其临床应用价值已被众多文献证实。 有研究表明，不同浓度（30%～40%）的细胞内冷冻保护剂如 EG、DMSO、PROH 单 独或组合，联合细胞外保护剂蔗糖冷冻卵子均可获得较满意的冷冻复苏率。不同 的冷冻载体 CroLeafs、CryoTops、CryLoops、Cryotips 等均可承载包含卵子的
微小溶液,最大限度地提髙冷冻和解冻过程中的温度传导,获得较髙的冷冻复苏 率,并且是安全可靠的 另有一众研究证实,玻璃化冷冻较慢速冷冻能获得更高的卵母细胞存活率、受精 率及胚胎发育潜能。 4、冷冻技术应用于未成熟卵子的研究 早期人们用慢速冷冻法冷冻未成熟GV期卵子。理论上,未成熟GV期卵子相较于 成熟的MII卵子来说对慢速冷冻的耐受更好。因为GV期的卵子染色质在双线期 的前期分散继而由核膜将其包绕,从而可以预防纺锤体解聚,因此GV卵子冷冻 后造成的多倍体和非整倍体是可以避免的。然而GV期卵子冷冻解冻后体外成熟 仍有很大困难,体外成熟率和受精率仍然是瓶颈。随着冷冻技术提高,GV期卵 子和成熟的MII卵子的玻璃化冷冻之后的成熟率无明显差异。有研究建议GV期 卵子最好在体外成熟至MI阶段再行玻璃化冷冻。但至今GV卵子冷冻活产仅有 个案报道 四、技术优缺点 1、优点 冷冻技术的进展表明卵子冷冻后的复苏率、妊娠及出生率均有明显提高。卵子冷 冻已逐渐被作为女性生育力保存的成熟手段之一,且能够避免因胚胎冷冻产生的 伦理及立法限制。有效的卵子冷冻方案的确立能增加卵子库建立的可能性,使共 享卵子成为可能。另外,卵子冷冻可以给予供卵者短暂的时间以观察其是否存在 传播性疾病 2、缺点 卵子冷冻造成的损害包括:细胞骨架的破坏,不同冷冻保护剂的类型、浓度和接 触时间均可不同程度地影响细胞骨架成分的组装和改变;纺锤体损伤,染色体及 DNA重组错误:细胞膜细胞质损伤;透明带变硬;ATP水平降低,线粒体损伤可 能。目前,卵子冷冻临床安全性的问题不能被准确评估,因为缺乏很好的控制性 临床试验。 参考文献 [1]高明,章志国,曹云霞.人类卵子冷冻技术的进展[J].国际生殖健康/计划生育杂 志,2013,32(06):475-477+489.[2017-10-02] [2]邓朝晖,高士友,阳翎,唐慧珍,柳朝华,陈辉莲,李燕,汤倩倩.慢速冷冻法冷冻人类卵子 技术初步研究[J].医学临床研究,2006,(12):1919-1921.[2017-10-02] [3]王瑶,狄文.卵子冷冻技术的应用进展[J].上海交通大学学报(医学 版),2013,33(08):1171-1175.[2017-10-02] [4]李娜,苗聪秀,关素萍,苗卉,李锐,杨红梅.玻璃化冷冻法在未成熟卵子冷冻技术中的应 用[J].中国计划生育学杂志,2012,20(10):690-692.[2017-10-02] [5]X技术网原文链接:htp://w.xjishu.com/zhuanli/34/87213455.html [6]百度百科原文链接htps://baike.baidu.com/item/冷冻卵子/3575808
微小溶液，最大限度地提高冷冻和解冻过程中的温度传导，获得较高的冷冻复苏 率，并且是安全可靠的。 另有一众研究证实，玻璃化冷冻较慢速冷冻能获得更高的卵母细胞存活率、受精 率及胚胎发育潜能。 4、 冷冻技术应用于未成熟卵子的研究 早期人们用慢速冷冻法冷冻未成熟 GV 期卵子。理论上，未成熟 GV 期卵子相较于 成熟的 MII 卵子来说对慢速冷冻的耐受更好。因为 GV 期的卵子染色质在双线期 的前期分散继而由核膜将其包绕，从而可以预防纺锤体解聚，因此 GV 卵子冷冻 后造成的多倍体和非整倍体是可以避免的。然而 GV 期卵子冷冻解冻后体外成熟 仍有很大困难，体外成熟率和受精率仍然是瓶颈。随着冷冻技术提高，GV 期卵 子和成熟的 MII 卵子的玻璃化冷冻之后的成熟率无明显差异。有研究建议 GV 期 卵子最好在体外成熟至 MII 阶段再行玻璃化冷冻。但至今 GV 卵子冷冻活产仅有 个案报道。 四、 技术优缺点 1、 优点 冷冻技术的进展表明卵子冷冻后的复苏率、妊娠及出生率均有明显提高。卵子冷 冻已逐渐被作为女性生育力保存的成熟手段之一，且能够避免因胚胎冷冻产生的 伦理及立法限制。有效的卵子冷冻方案的确立能增加卵子库建立的可能性，使共 享卵子成为可能。另外，卵子冷冻可以给予供卵者短暂的时间以观察其是否存在 传播性疾病。 2、 缺点 卵子冷冻造成的损害包括：细胞骨架的破坏，不同冷冻保护剂的类型、浓度和接 触时间均可不同程度地影响细胞骨架成分的组装和改变；纺锤体损伤，染色体及 DNA 重组错误；细胞膜细胞质损伤；透明带变硬；ATP 水平降低，线粒体损伤可 能。目前，卵子冷冻临床安全性的问题不能被准确评估，因为缺乏很好的控制性 临床试验。 参考文献 [1]高明,章志国,曹云霞. 人类卵子冷冻技术的进展[J]. 国际生殖健康/计划生育杂 志,2013,32(06):475-477+489. [2017-10-02]. [2]邓朝晖,高士友,阳翎,唐慧珍,柳朝华,陈辉莲,李燕,汤倩倩. 慢速冷冻法冷冻人类卵子 技术初步研究[J]. 医学临床研究,2006,(12):1919-1921. [2017-10-02]. [3]王瑶,狄文. 卵子冷冻技术的应用进展[J]. 上海交通大学学报(医学 版),2013,33(08):1171-1175. [2017-10-02]. [4]李娜,苗聪秀,关素萍,苗卉,李锐,杨红梅. 玻璃化冷冻法在未成熟卵子冷冻技术中的应 用[J]. 中国计划生育学杂志,2012,20(10):690-692. [2017-10-02]. [5]X技术网 原文链接:http://www.xjishu.com/zhuanli/34/87213455.html [6]百度百科 原文链接 https://baike.baidu.com/item/冷冻卵子/3575808