利用无任何Y染色体基因的雄性生殖细胞辅助生殖生成活 体小鼠后代 陶琛琛+17301050235 、技术背景 哺乳动物的Y染色体被认为是雄性的象征,因为它只存在于雄性体内并编码了驱动雄 性性别决定的基因以及其他重要的雄性生殖基因。 然而夏威夷大学 Monika a.Ward教授领导的研究小组早在2013年的小鼠实验中就已 证明,将雄性生殖所需的Y染色体基因缩到两个(只留下Sry和Ef2s3y两个Y染色体基 因)的雄性小鼠,也能够产生圆形精细胞,并在辅助生殖技术的帮助下能产生正常后代 这证实了Y染色体只有两个基因是雄性小鼠借助辅助受精生育后代所必需的,即睾丸决定 因子Sy(负责使胎儿发育成雄性)和精原干细胞扩增因子Eif2s3y(与精子发生相关)。 现在,这一研究小组与来自法国的研究人员合作,生成了完全缺乏整条Y染色体的雄 性小鼠,并在辅助生殖技术的帮助下产生正常后代。 ( Monika a ward教授(右一)和她的研究团队 二、技术原理 )Sox9替代Sry 研究人员首先用同源物,编码在11号染色体上的直接靶基因So×9替代了Y染色体基 因Sry。在正常的情况下,Sy激活Sox9,使它启动一连串的分子事件将“让胚胎发育成雄 性”的信号传达下去,最终使得具有XY染色体的胚胎发育为雄性。研究人员利用转基因 技术在缺乏Sy的情况下激活了Sox9。 (二)Ei2s3×替代E2s3y 用编码在Ⅹ染色体上的同源物Ei2s3×替代了第二个必需的Y染色体基因Ei2s3y。 Eif2s3y和Eif2s3x属于同一基因家族,在序列上非常相似。然而用一个拷贝的E2s3去代 替Ei2s3y,能启动精子发生过程,却无法完成减数分裂。研究人员推测这两个基因有可能 发挥了相似的作用,两者的总剂量至关重要(事实上E2s3y的效率比Ei2s3x更高)。他
利用无任何 Y 染色体基因的雄性生殖细胞辅助生殖生成活 体小鼠后代 陶琛琛+17301050235 一、技术背景 哺乳动物的 Y 染色体被认为是雄性的象征，因为它只存在于雄性体内并编码了驱动雄 性性别决定的基因以及其他重要的雄性生殖基因。 然而夏威夷大学 Monika A. Ward 教授领导的研究小组早在 2013 年的小鼠实验中就已 证明，将雄性生殖所需的 Y 染色体基因缩到两个（只留下 Sry 和 Eif2s3y 两个 Y 染色体基 因）的雄性小鼠，也能够产生圆形精细胞，并在辅助生殖技术的帮助下能产生正常后代。 这证实了 Y 染色体只有两个基因是雄性小鼠借助辅助受精生育后代所必需的，即睾丸决定 因子 Sry（负责使胎儿发育成雄性）和精原干细胞扩增因子 Eif2s3y（与精子发生相关）。 现在，这一研究小组与来自法国的研究人员合作，生成了完全缺乏整条 Y 染色体的雄 性小鼠，并在辅助生殖技术的帮助下产生正常后代。 （Monika A. Ward 教授（右一）和她的研究团队） 二、技术原理 （一）Sox9 替代 Sry 研究人员首先用同源物，编码在 11 号染色体上的直接靶基因 Sox9 替代了 Y 染色体基 因 Sry。在正常的情况下，Sry 激活 Sox9，使它启动一连串的分子事件将“让胚胎发育成雄 性”的信号传达下去，最终使得具有 XY 染色体的胚胎发育为雄性。研究人员利用转基因 技术在缺乏 Sry 的情况下激活了 Sox9。 （二）Eif2s3x 替代 Eif2s3y 用编码在 X 染色体上的同源物 Eif2s3x 替代了第二个必需的 Y 染色体基因 Eif2s3y。 Eif2s3y 和 Eif2s3x 属于同一基因家族，在序列上非常相似。然而用一个拷贝的 Eif2s3x 去代 替 Eif2s3y，能启动精子发生过程，却无法完成减数分裂。研究人员推测这两个基因有可能 发挥了相似的作用，两者的总剂量至关重要（事实上 Eif2s3y 的效率比 Eif2s3x 更高）。他
们通过转基因技术过表达了E2s3X,将这一Ⅹ染色体基因提高至超过Ⅹ和Y染色体正常提 供的剂量(为了完成减数分裂,需要五倍表达量的E2s3x)。在这样的条件下,Ef2s3X接 管了Ei2s3y的功能启动了精子发生。 (三)同时替换Sy和Ei2s3y 同时替换Sy和Ei2s3y,构建出没有任何Y染色体DNA的 XOSox9Ei2s3x雄性小鼠 并成功地将Sy和E2s3×在xO小鼠体内表达。缺乏全部Y染色体基因的小鼠形成了睾 丸,其中充满了雄性生殖细胞。收集圆形精子细胞并利用圆形精子细胞注射(ROS技术成 功让卵母细胞受精。将发育胚胎移植到雌雄小鼠代孕母亲体内,生成活体小鼠后代。虽然 多数Sox9及Eif2s3x转基因ⅪO小鼠存在睾丸缺陷和缺乏生殖细胞,但27%的小鼠可形成 圆形精子。这些细胞虽不能成熟发展具鞭毛的精子,但当注入到卵子中,却能成功进行受 精并形成胚胎。 (四)“无Y染色体”雄性小鼠的后代情况 无Y染色体”雄性小鼠的后代健康且拥有正常的寿命。“无Y染色体”雄性小鼠的 女儿和外孙都具有生育能力,无需进一步的技术干预自身具有生殖能力。Ward研究小组 利用ROS生成了连续三代的“无Y染色体”雄性小鼠,证实无Y染色体基因的雄性小鼠 在技术辅助下能够多次繁殖。 (研究者利用ROS技术将圆形精细胞注射到卵母细胞当中)
们通过转基因技术过表达了 Eif2s3x，将这一 X 染色体基因提高至超过 X 和 Y 染色体正常提 供的剂量（为了完成减数分裂，需要五倍表达量的 Eif2s3x）。在这样的条件下，Eif2s3x 接 管了 Eif2s3y 的功能启动了精子发生。 （三）同时替换 Sry 和 Eif2s3y 同时替换 Sry 和 Eif2s3y，构建出没有任何 Y 染色体 DNA 的 XOSox9,Eif2s3x 雄性小鼠 并成功地将 Sry 和 Eif2s3x 在 XO 小鼠体内表达。缺乏全部 Y 染色体基因的小鼠形成了睾 丸，其中充满了雄性生殖细胞。收集圆形精子细胞并利用圆形精子细胞注射(ROSI)技术成 功让卵母细胞受精。将发育胚胎移植到雌雄小鼠代孕母亲体内，生成活体小鼠后代。虽然 多数 Sox9 及 Eif2s3x 转基因 XO 小鼠存在睾丸缺陷和缺乏生殖细胞，但 27%的小鼠可形成 圆形精子。这些细胞虽不能成熟发展具鞭毛的精子，但当注入到卵子中，却能成功进行受 精并形成胚胎。 （四）“无 Y 染色体”雄性小鼠的后代情况 “无 Y 染色体”雄性小鼠的后代健康且拥有正常的寿命。“无 Y 染色体”雄性小鼠的 女儿和外孙都具有生育能力，无需进一步的技术干预自身具有生殖能力。Ward 研究小组 利用 ROSI 生成了连续三代的“无 Y 染色体”雄性小鼠，证实无 Y 染色体基因的雄性小鼠 在技术辅助下能够多次繁殖。 （研究者利用 ROSI 技术将圆形精细胞注射到卵母细胞当中）
XY.ep XYSox9 xX xY/omt xY a XX Sox9 xYSorg mesor XEx xEXSorg XEYamtsorg xEx x-o x Yam xl x x sorg Ix sorg x"Yaym sox9 4ae'esos B 「 CEsar xY'ey=sy Xx XXEd2s3x XY oy XYEi2s3x XX Sry XXSry E 2s3r xY Sry x'x x"Yom xxE2s3 x" E/2s XOSy +mm osy- XORg, E2s3 -mateer ERa (为了获得目标基因型的雄性小鼠而进行的复杂繁育工作。图A:Y染色体基因只保留 Eif2s3y的雄性小鼠培育流程;图B:Y染色体基因只保留Sy的雄性小鼠培育流程。蓝色 为雄性表型的小鼠;粉色为雌性表型的小鼠;黄色为目标基因型。) (三只完全不含Y染色体基因的雄性小鼠。左一和右一的小鼠为2岁1个月大,中间的小 鼠则1岁10个月大)
（为了获得目标基因型的雄性小鼠而进行的复杂繁育工作。图 A：Y 染色体基因只保留 Eif2s3y 的雄性小鼠培育流程；图 B：Y 染色体基因只保留 Sry 的雄性小鼠培育流程。蓝色 为雄性表型的小鼠；粉色为雌性表型的小鼠；黄色为目标基因型。） （三只完全不含 Y 染色体基因的雄性小鼠。左一和右一的小鼠为 2 岁 1 个月大，中间的小 鼠则 1 岁 10 个月大）
XOSox9. Eif2s 3x F2 ROSI F3 ROSI (没有任何Y染色体基因的雄性小鼠“四代同堂”。左一的白色小鼠是最初通过杂交 繁育得到的无Y染色体基因雄鼠。它在ROS|技术的帮助下成功繁殖,上排中间的小鼠 (F1RoS)是它的儿子,同样完全没有Y染色体基因。F2ROSl、F3ROS则依次是白 色小鼠的孙辈和曾孙辈。) 三、技术应用前景与其他 1.物种保护:将转基因方法进一步扩展,并与千细胞领域的突破结合起来,可能实现只 用雌性产生后代。这可能应用于物种保护工作,例如若有一天发现某个物种仅剩下 只雌性,从单一个体中同时建立雄性与雌性配子的技术也许将帮助它们免于灭绝 2.治疗男性不育症:在小鼠和人类中,大多数的小鼠Y染色体基因是成熟精子发育和正 常受精的必要条件。但在辅助生殖中,现在证实小鼠中Y染色体的贡献并不是必需 的。未来该技术成熟后将可能应用于男性不育治疗 3.启发研究精子形成过程中XY染色体的相互作用:此前有观点认为,Y染色体基因的 功能在演化中逐渐缺损,而Ⅹ染色体上基因对此予以补偿。然而发现在Ei2s3-Eif2s3y 这对基因中,Ef2s3y在精子形成中的作用更强,这与目前的观点不符。这启发了研究 重要的Y染色体基因在生殖中作用的分子机制,尤其是Ei23×-E2s3y之间的关系
（没有任何 Y 染色体基因的雄性小鼠“四代同堂”。左一的白色小鼠是最初通过杂交 繁育得到的无 Y 染色体基因雄鼠。它在 ROSI 技术的帮助下成功繁殖，上排中间的小鼠 （F1 ROSI）是它的儿子，同样完全没有 Y 染色体基因。F2 ROSI、F3 ROSI 则依次是白 色小鼠的孙辈和曾孙辈。） 三、技术应用前景与其他 1. 物种保护：将转基因方法进一步扩展，并与干细胞领域的突破结合起来，可能实现只 用雌性产生后代。这可能应用于物种保护工作，例如若有一天发现某个物种仅剩下一 只雌性，从单一个体中同时建立雄性与雌性配子的技术也许将帮助它们免于灭绝。 2. 治疗男性不育症：在小鼠和人类中，大多数的小鼠 Y 染色体基因是成熟精子发育和正 常受精的必要条件。但在辅助生殖中，现在证实小鼠中 Y 染色体的贡献并不是必需 的。未来该技术成熟后将可能应用于男性不育治疗。 3. 启发研究精子形成过程中 X-Y 染色体的相互作用：此前有观点认为，Y 染色体基因的 功能在演化中逐渐缺损，而 X 染色体上基因对此予以补偿。然而发现在 Eif2s3x-Eif2s3y 这对基因中，Eif2s3y 在精子形成中的作用更强，这与目前的观点不符。这启发了研究 重要的 Y 染色体基因在生殖中作用的分子机制，尤其是 Eif2s3x-Eif2s3y 之间的关系
4.对于Y染色体基因功能及进化的研究:支持了Y染色体基因与其他染色体上编码的同 源基因之间存在功能冗余这一观点。表明了基因组中有一些后备策略,在正常情况下 沉默的这些策略在某些情况下能够接管对应功能 四、技术优缺点 优点:能够产生无任何Y染色体基因的雄性生殖细胞,利用不能游动的、无活性或不成熟 的生殖细胞,绕过各种正常的受精步骤,可能成为未来攻克雄性不育的一种治疗方案。 缺点:该技术还处于实验阶段,目前只能用于实验室研究。由于注射不成熟的生殖细胞的 安全性及其他的技术困难,还不能直接应用于男性不育治疗。 五、总结 通过使用Sox9和Ei2s3×分别替代Sy和Ei2s3y,可以产生无任何Y染色体基因的雄 性生殖细胞。利用ROS|技术这些细胞可以产生健康后代且其后代具有生育能力。这项技 术目前尚处于试验阶段,但具有强大的应用前景,如物种保护、男性不育治疗等。同时 由这项研究启发了对精子形成过程中ⅩY染色体的相互作用的研究,并推进了Y染色体基 因功能及进化的研究。相信随着该项技术的成熟,将会造福全人类与自然
4. 对于 Y 染色体基因功能及进化的研究：支持了 Y 染色体基因与其他染色体上编码的同 源基因之间存在功能冗余这一观点。表明了基因组中有一些后备策略，在正常情况下 沉默的这些策略在某些情况下能够接管对应功能。 四、技术优缺点 优点：能够产生无任何 Y 染色体基因的雄性生殖细胞，利用不能游动的、无活性或不成熟 的生殖细胞，绕过各种正常的受精步骤，可能成为未来攻克雄性不育的一种治疗方案。 缺点：该技术还处于实验阶段，目前只能用于实验室研究。由于注射不成熟的生殖细胞的 安全性及其他的技术困难，还不能直接应用于男性不育治疗。 五、总结 通过使用 Sox9 和 Eif2s3x 分别替代 Sry 和 Eif2s3y，可以产生无任何 Y 染色体基因的雄 性生殖细胞。利用 ROSI 技术这些细胞可以产生健康后代且其后代具有生育能力。这项技 术目前尚处于试验阶段，但具有强大的应用前景，如物种保护、男性不育治疗等。同时， 由这项研究启发了对精子形成过程中 X-Y 染色体的相互作用的研究，并推进了 Y 染色体基 因功能及进化的研究。相信随着该项技术的成熟，将会造福全人类与自然