精子染色质结构分析 董语可15301050194 1980年,精子染色质结构分析 (Sperm Chromatin Structure Assay SCTENCT SCSA)首次在 Science(240:1131)上提 出,精子染色后呈现红色或绿色荧光 的显微照片被用作这一期杂志封面 这一项生物技术发展至今,已被广泛 应用于检测精子亚临床损伤、评估男 性生育力和预测体外受精胚胎移植的 成功率。 、技术原理 精子染色质分析利用吖啶橙的异 染性与专用软件计算机界面的流式细 胞仪相结合,快速识别带有不正常染 色质结构的精子。6 哺乳动物精子DNA是遗传信息的 载体,对繁衍后代具有重要意义。这 Science封面:精子染色后的荧光显微照片v240, 一特殊使命要求精子的染色质具有特 p1131,1980 殊结构。与其他细胞不同,精子的染 色质形成经过了加倍浓缩与组装。 在精子发生过程中, 与DNA结合的核蛋白发 生了从组蛋白→过渡蛋 PROTAMINES 白→精核蛋白的组型转 换。早期精子形成阶段, 圆形精子细胞伸长,合成 P2 的过渡蛋白取代了染色 Disulfide Bonds 质内的组蛋白;晚期精子 P2 Precursor 形成阶段,过渡蛋白又被 精核蛋白取代,精子头部 凝缩,精子核外形形成。 精核蛋白的体积仅有组 蛋白的一半。精子双链 DNA围绕这些体积较小 的精核蛋白形成染色质 基本结构,而后通过精核 蛋白分子内外的二硫键 精子染色体形成过程(图片来源 交联进一步浓缩,从而使htp//www.briarpatchbiocom/rtue/woocommerce/mammal 染色体更为稳定。在前列 an-protamines/ 腺液Zn作用下,余下的
精子染色质结构分析 董语可 15301050194 1980 年，精子染色质结构分析 (Sperm Chromatin Structure Assay, SCSA)首次在 Science (240:1131)上提 出，精子染色后呈现红色或绿色荧光 的显微照片被用作这一期杂志封面。 这一项生物技术发展至今，已被广泛 应用于检测精子亚临床损伤、评估男 性生育力和预测体外受精胚胎移植的 成功率。 一、技术原理 精子染色质分析利用吖啶橙的异 染性与专用软件计算机界面的流式细 胞仪相结合，快速识别带有不正常染 色质结构的精子。[6] 哺乳动物精子 DNA 是遗传信息的 载体，对繁衍后代具有重要意义。这 一特殊使命要求精子的染色质具有特 殊结构。与其他细胞不同，精子的染 色质形成经过了加倍浓缩与组装。 在精子发生过程中， 与 DNA 结合的核蛋白发 生了从组蛋白→过渡蛋 白→精核蛋白的组型转 换。早期精子形成阶段， 圆形精子细胞伸长，合成 的过渡蛋白取代了染色 质内的组蛋白；晚期精子 形成阶段，过渡蛋白又被 精核蛋白取代，精子头部 凝缩，精子核外形形成。 精核蛋白的体积仅有组 蛋白的一半。精子双链 DNA 围绕这些体积较小 的精核蛋白形成染色质 基本结构，而后通过精核 蛋白分子内外的二硫键 交联进一步浓缩，从而使 染色体更为稳定。在前列 腺液 Zn +作用下，余下的 精子染色体形成过程（图片来源： http://www.briarpatchbio.com/virtue/woocommerce/mammali an-protamines/） Science 封面：精子染色后的荧光显微照片(v. 240, p.1131, 1980)
游离巯基间形成共价键,精子核成熟。这样的成熟精子遇酸能维持双链结构的稳 定。而对于受到损伤的不成熟精子,其精核蛋白中不具备二硫键,形成松散结构 的染色质,DNA在酸的作用下则会变性成单链 吖啶橙( Acridine orange, AO)可与双链DNA结合呈单 SCSAB-Acridine 体形式发出绿色荧光,与单 Orange Stained DNA 链DNA结合呈聚合物形式发 出红色荧光。 红荧光在总荧光中所占 至苏≤z 的比例反映了精子染色质结 构的缩合水平,可通过各计算 机界面流式细胞仪来评价。流 式细胞仪能准确测量每一个 精子发出的荧光信号传送给 Fragmented DNA(red fluorescence) 10 计算机,专用的软件对这些数 据进行处理得出SCSA参数。 荧光染色变化原理图:正常DNA(绿)至受损DNA (红)( Evenson.2016) red fluorescence 前,常用的SCSA 参数包括:精子DNA total (red+green)fluorescence I碎片指数DF|DNA fragment index),主群 XDF|= mean of DFI population(11024unts)细胞外细胞指数COMP SD DFI standard deviation of DFI population at(cells outside main %DF=% cells outside main sperm population population)或表示 Moderate DFI and High DFI 为%DF,和高可染性精 %HDS =% cells with High DNA Stainability 子指数%HDs(high (5,000 SPERM/ SAMPLE X DUPLICATE MEASUREMENTS) DNA stainability)等。DF SCSA X DFI=DNA Fragmentation Index(Evenson et al. 1985) 指DNA受损的精子占 总精子的百分数,反映 DNA受损的精子情况; COMP a SCSA Protocol (或%DF1)是指主群以外的精子占 Frozen raw semen, thawed in a37 oC water 总精子的百分数,反映精子DNA受 bath and diluted with tne buffer 损情况;HDS指髙可染性的精子占 总精子的百分数,反映核未完全缩 合的不成熟精子的情况。高可染性 Acid(pH 1.20)denaturation 精子核未完全缩合,蛋白组型转换 of dNa at sites of strand breaks 存在异常,使染料的插入力增强, DNA可染性增加。 AO staining of ss(red) SCSA检测仅有一种操作流程 ds(green)DNA 在国际上已被广泛承认。检测中出 现任何偏离如右图所示SCSA流程 的操作,都不是SCSA检测 Measure 5,000 sperm by flow cytometry SCSA检测流程( Evenson et al,2002)
游离巯基间形成共价键，精子核成熟。这样的成熟精子遇酸能维持双链结构的稳 定。而对于受到损伤的不成熟精子，其精核蛋白中不具备二硫键，形成松散结构 的染色质，DNA 在酸的作用下则会变性成单链。 吖啶橙(Scridine Orange, AO)可与双链 DN A 结合呈单 体形式发出绿色荧光 , 与单 链 DNA 结合呈聚合物形式发 出红色荧光。 红荧光在总荧光中所占 的比例反映了精子染色质结 构的缩合水平,可通过各计算 机界面流式细胞仪来评价。流 式细胞仪能准确测量每一个 精子发出的荧光信号传送给 计算机，专用的软件对这些数 据进行处理得出 SCSA 参数。 目前，常用的SCSA 参数包括：：精子 DNA 碎片指数 DFI(DNA fragment index)，主群 细胞外细胞指数COMP αt (cells outside main population）或表示 为%DFI，和高可染性精 子指数%HDS (high DNA stainability)等。DFI 指 DNA 受损的精子占 总精子的百分数，反映 DNA 受损的精子情况；COMPαt （或%DFI）是指主群以外的精子占 总精子的百分数，反映精子 DNA 受 损情况；HDS 指高可染性的精子占 总精子的百分数，反映核未完全缩 合的不成熟精子的情况。高可染性 精子核未完全缩合，蛋白组型转换 存在异常，使染料的插入力增强， DNA 可染性增加。 SCSA 检测仅有一种操作流程， 在国际上已被广泛承认。检测中出 现任何偏离如右图所示 SCSA 流程 的操作，都不是 SCSA 检测。 SCSA 检测流程 (Evenson et al., 2002) SCSA 参数 DFI= DNA Fragmentation Index(Evenson et al., 1985) 荧光染色变化原理图：正常 DNA（绿）至受损 DNA （红） (Evenson. 2016)
二、技术应用 1、SCSA用于男子生育力的评估和预测亚临床不孕 人精子DNA完整性对父方基因遗传给正常子代是非常重要的。精子DNA的 完整性直接影响了精子受精能力和受精后原核的形成、胚胎着床及子代的身体健 康。研究显示,随DF升高,男性生育力有降低趋势,但并不表示高水平DF完 全无生育可能。 Erenpreiss等用SCSA检测350份不育男性的精液发现,活力低下和形态不 正常精子的DF明显高于活力和形态正常的精子。杨建华8等用SCSA检测22例 不明原因流产和36例不明原因不孕妇女配偶精子,以及20例正常对照者精子 结果表明对照组与不明原因流产以及不孕组之间精子DNA完整性存在差异 (P30%组生化妊娠率、临床妊娠率、分娩率明显低于DF|<30%组,并认为DF可 作为U结局的独立预测指标,建议所有U患者行SCSA检测精子染色质完整性 3、SCSA评估癌症对精子染色质结构的影响 睾丸癌,何金氏病以及白血病是困扰处于生育年龄男性的常见恶性肿瘤。虽 然治疗前冷冻精液可以延续癌症患者的生育力,但这些疾病会精液内的精子数量 和运动性。SCSA可用于癌症本身对精子染色质完整性的影响。 Kobayashi12等用 sCsA分析了12例健康、有生育力男性和37例癌症患者(其中睾丸癌20例, 何金氏病11例,非何金氏病4例,其它肿瘤2例)精子DNA损伤,结果与对照 组相比所有癌症患者具有高DNA损伤,SCSA参数值差异显著,睾丸癌损伤尤为 严重。有8例患者HDS≥15%
二、技术应用 1、SCSA 用于男子生育力的评估和预测亚临床不孕 人精子 DNA 完整性对父方基因遗传给正常子代是非常重要的。精子 DNA 的 完整性直接影响了精子受精能力和受精后原核的形成、胚胎着床及子代的身体健 康。研究显示，随 DFI 升高，男性生育力有降低趋势，但并不表示高水平 DFI 完 全无生育可能。 Erenpreiss [9]等用 SCSA 检测 350 份不育男性的精液发现，活力低下和形态不 正常精子的 DFI 明显高于活力和形态正常的精子。杨建华[8]等用 SCSA 检测 22 例 不明原因流产和 36 例不明原因不孕妇女配偶精子，以及 20 例正常对照者精子， 结果表明对照组与不明原因流产以及不孕组之间精子 DNA 完整性存在差异 （P<0.05），不明原因流产以及不孕组精子 DNA 完整性较差。Evenson 近年来对 SCSA 用于男子生育力的评估和预测亚临床不孕就进行了大量研究，得出评估人 生育潜能的阈值：COMPαt ≈0-15%具有高生育潜能；≈16%-29%具有中生育潜 能；≥30%具有低生育潜能；≈80-90%无生育能力，这些阈值又称为亚不孕的预 测值。同时，Evenson 指出环境、高烧、药物、疾病、精神和身体应激状态都能 够影响精子染色质质量。因此在生育力评估时必须已知上述条件，而且受这些条 件影响的患者应在不同生精周期进行 SCSA 分析。[6] 2、SCSA 用于预测辅助生殖技术的成败 SCSA 可以帮助医生识别哪些男性患者在试管婴儿技术中不会有妊娠结局，从 而可以减少患者的痛苦和经济负担。 许多研究证明，在卵胞浆内单精子显微注射技术(Intracytoplasmic Sperm Injection, ICSI)，即第二代试管婴儿技术中精子质量损伤会影响从胚泡获得胚胎的 数量、胚泡的质量，并可导致高的流产率。Larson [11]等研究了 24 例进行 IVF(In Vitro Fertilization, 体外受精)或 ICSI 患者受精前 SCSA 结果，发现 7 例初次受精就可使 女方妊娠的男性精子 COMPαt为 15.4%±4.6%，14 例初次未使女方妊娠者精子 COMPαt为 31.1%±3.2%，二者差异显著（P=0.01）。他认为如果精子的 COMPα t≥27%，说明有 DNA 损伤，不会有妊娠发生。这与 1999 年 Evenson 等报道的 3 0 % 的阈值类似。[6] 此外，大量研究报道，精子染色质完整性影响宫腔内人工授精(Intrauterine Insemination, IUI)结局。Bungum[10]等用 SCSA 评估行 IUI 夫妇精子发现，精子 DFI ＞30%组生化妊娠率、临床妊娠率、分娩率明显低于 DFI＜30%组，并认为 DFI 可 作为 IUI 结局的独立预测指标，建议所有 IUI 患者行 SCSA 检测精子染色质完整性。 [1] 3、SCSA 评估癌症对精子染色质结构的影响 睾丸癌，何金氏病以及白血病是困扰处于生育年龄男性的常见恶性肿瘤。虽 然治疗前冷冻精液可以延续癌症患者的生育力，但这些疾病会精液内的精子数量 和运动性。SCSA 可用于癌症本身对精子染色质完整性的影响。Kobayashi [12]等用 SCSA 分析了 12 例健康、有生育力男性和 37 例癌症患者（其中睾丸癌 20 例， 何金氏病 11 例，非何金氏病 4 例，其它肿瘤 2 例）精子 DNA 损伤，结果与对照 组相比所有癌症患者具有高 DNA 损伤，SCSA 参数值差异显著，睾丸癌损伤尤为 严重。有 8 例患者 HDS≥15%
4、SCSA用于评估各种精子处理方法对其DNA完整性的影响 在辅助生殖技术中,精子洗涤、上游、梯度离心、玻璃毛过滤及冷冻保存是 个常规操作。SCSA可用于检测这些处理技术对DNA完整性的影响。Zinp1等 取了22个连续少精和不育患者的精液样品。每个样品分成3分(未处理精液 梯度离心精液和上游精液),用于SCSA分析。结果,用上游法处理后CoMPαt 与未处理精液相比明显减少,而用两层密度梯度离心处理的精液无显著性差异 (48%±12%和136%士36%与101%±23%相比,前者P<0.0001)。 Spano14 等也用SCSA评估了上游和冷冻处理后精子染色质的变异。他们的实验结果显示 处理后的精子代表一个亚群,形态上和动力学参数得到改善而且头不正常精子的 百分数减少,绿头精子的百分数增加。这个亚群染色质结构的特性得到改善 精子细胞具有最好的结构和功能并显示最佳的受精能力。但是常用方法冷冻保 存后整个精子质量恶化,只有在经过一次上游法处理后染色质质量才会得到改善 arson等还用SCSA比较了玻璃毛过滤和密度梯度离心对精子染色质结构的影 响,发现玻璃毛过滤能使染色质的完整性(SDDF)和活力得到改善而密度梯度 离心只是在精子的运动性形态学方面优于玻璃毛过滤。这些数据提示我们重新检 查精子处理方法,选择最佳的组合。l6 三、技术优缺点 1、SCSA的优点 sCSA快速简便,费用低。在精液样本解冻后,SCSA分析可在五分钟内完成, 比现有的其他精子DNA完整性检测流程要快很多。 SCSA的结果稳定可靠,具有可重复性,可应用于临床。在下图的SCSA检测 报告中,可以看到%DF|参数的标准方差极低(SD=0.0),表明SCSA具有很好的 精确度以及可重复性。对5000个精子进行重复的独立实验,任何其他的男科检 测都无法做到这样的精确度。 High DNA ability Non-detectable 5587s188 ed DNA DNA Fragm DNA Fragmentation Index Patient DateMeasurement DFI SD DFI%DFI%HDS 7272113#排 5637307 49 64 6.4 561.4 304.8 64972 Mean56263059649 6.8 1.2 人精液样本的SCSA检测报告( lEvenson et a!.2002) 此外,SCSA参数作为独立于常规精液参数以外的特殊检测参数,它和精液 常规一起检查可以更全面的了解男子的生育能力,预判胚胎的发育。杨建华8 等的研究中,一位患者结婚3年,女方流产2次,第1次为人工流产,第二次原 因不明。主诉平时工作压力很大,女方第二次流产后思想负担加重,害怕再流 产,甚至出现恐惧心理,不敢再怀孕。精液常规及精子形态学检查均未发现特别
4、SCSA 用于评估各种精子处理方法对其 DNA 完整性的影响 在辅助生殖技术中，精子洗涤、上游、梯度离心、玻璃毛过滤及冷冻保存是 一个常规操作。SCSA 可用于检测这些处理技术对 DNA 完整性的影响。Zinp [13]等 取了 22 个连续少精和不育患者的精液样品。每个样品分成 3 分（未处理精液、 梯度离心精液和上游精液），用于 SCSA 分析。结果，用上游法处理后 COMPαt 与未处理精液相比明显减少，而用两层密度梯度离心处理的精液无显著性差异 （4.8%±1.2%和 13.6%±3.6%与 10.1%±2.3%相比，前者 P＜0.0001）。Spano [14] 等也用 SCSA 评估了上游和冷冻处理后精子染色质的变异。他们的实验结果显示 处理后的精子代表一个亚群，形态上和动力学参数得到改善而且头不正常精子的 百分数减少， 绿头精子的百分数增加。这个亚群染色质结构的特性得到改善， 精子细胞具有最 好的结构和功能并显示最佳的受精能力。但是常用方法冷冻保 存后整个精子质量恶化，只有在经过一次上游法处理后染色质质量才会得到改善。 Larson [15]等还用 SCSA 比较了玻璃毛过滤和密度梯度离心对精子染色质结构的影 响，发现玻璃毛过滤能使染色质的完整性（SD DFI）和活力得到改善而密度梯度 离心只是在精子的运动性形态学方面优于玻璃毛过滤。这些数据提示我们重新检 查精子处理方法，选择最佳的组合。[6] 三、技术优缺点 1、SCSA 的优点 SCSA 快速简便，费用低。在精液样本解冻后，SCSA 分析可在五分钟内完成， 比现有的其他精子 DNA 完整性检测流程要快很多。 SCSA 的结果稳定可靠，具有可重复性，可应用于临床。在下图的 SCSA 检测 报告中，可以看到%DFI 参数的标准方差极低（SD=0.0），表明 SCSA 具有很好的 精确度以及可重复性。对 5000 个精子进行重复的独立实验，任何其他的男科检 测都无法做到这样的精确度。 此外，SCSA 参数作为独立于常规精液参数以外的特殊检测参数，它和精液 常规一起检查可以更全面的了解男子的生育能力，预判胚胎的发育。杨建华[8] 等的研究中，一位患者结婚 3 年，女方流产 2 次，第 1 次为人工流产，第二次原 因不明。主诉平时工作压力很大，女方第二次流产后思想负担加重 , 害怕再流 产，甚至出现恐惧心理，不敢再怀孕。精液常规及精子形态学检查均未发现特别 人精液样本的 SCSA 检测报告 (Evenson et al. 2002)
的异常,然而SCSA检测发现其DNA不稳定精子数达到67%。精液常规结果的好 坏并不能反映DNA的完整性,将SCSA应用于对男子精子状态当中,是十分必要 的 2、SCSA的缺点 sCsA作为检测精子DNA完整性的有力标准,在国外已被广泛应用。Mona16 等对SCSA在不孕症的诊断与治疗中的应用可能做出了流程图。本人所浏览的文 献中,都未提出SCSA的主要缺点,但我相信SCSA作为一项至今仅有36年发展 历史的生物技术,仍具有很大的进步空间,值得我们去进一步探讨与研究。 All norma OFIs10 DF1020% DF20~30% DF30% 流程图:SCSA在不孕症诊断与治疗中的应用可能( Mona et a.2011) 参考文献 [1]蒋欢欢.精子染色质完整性检测与辅助生殖技术[.国际生殖健康/计划生育 杂志,2001,30(1):58-64 [2]王洪亮,王瑞雪,等.精子核成熟度与精子形态的关系.中国妇幼保健, 2008,23(30):43054307 3] Evenson, D.P., Larson, K, Jost, L K The sperm chromatin structure assay(SCSa) clinical use for detecting sperm dNa fragmentation related to male infertility and comparisons with other techniques []. Journal of Andrology, 2002, 23 (1 ): 25-43 [4] Evenson, D.P. The Sperm Chromatin Structure Assay(sCSa)and other sperm DNa fragmentation tests for evaluation of sperm nuclear dNa integrity as related to fertility []. Animal Reproduction Science, 2016, 169: 56-75 [5]张宁,张黎,等.流式细胞术在精子染色质结构分析中的应用[.中华检验医
的异常，然而 SCSA 检测发现其 DNA 不稳定精子数达到 67%。精液常规结果的好 坏并不能反映 DNA 的完整性，将 SCSA 应用于对男子精子状态当中，是十分必要 的。 2、SCSA 的缺点 SCSA 作为检测精子 DNA 完整性的有力标准，在国外已被广泛应用。Mona [16] 等对 SCSA 在不孕症的诊断与治疗中的应用可能做出了流程图。本人所浏览的文 献中，都未提出 SCSA 的主要缺点，但我相信 SCSA 作为一项至今仅有 36 年发展 历史的生物技术，仍具有很大的进步空间，值得我们去进一步探讨与研究。 参考文献 [1] 蒋欢欢. 精子染色质完整性检测与辅助生殖技术[J]．国际生殖健康/计划生育 杂志, 2001, 30(1): 58-64. [2] 王洪亮, 王瑞雪, 等. 精子核成熟度与精子形态的关系[J]. 中国妇幼保健, 2008, 23(30): 4305-4307. [3] Evenson, D.P., Larson, K., Jost, L.K. The sperm chromatin structure assay (SCSA TM): clinical use for detecting sperm DNA fragmentation related to male infertility and comparisons with other techniques [J]. Journal of Andrology, 2002, 23(1): 25–43. [4] Evenson, D.P. The Sperm Chromatin Structure Assay (SCSA®) and other sperm DNA fragmentation tests for evaluation of sperm nuclear DNA integrity as related to fertility [J]. Animal Reproduction Science, 2016, 169: 56-75. [5] 张宁, 张黎, 等. 流式细胞术在精子染色质结构分析中的应用[J]. 中华检验医 流程图：SCSA 在不孕症诊断与治疗中的应用可能(Mona et al. 2011)
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