由于所需产物连接在不溶性支持物上，只是在延伸结束后才从支持物释放出来，因此固 相方法是化学合成DNA、多肽的理想途径。所有反应都在一个反应器中进行，可以加入过 量试剂驱使化学反应彻底进行。每步反应之后，可以洗去溶剂和副产物。反应结束后，用氨 水处理能够释放合成的寡核苷酸，并除去所有的保护基团。由于延伸反应不能超过100%， 合成链的长度不一致。最长的寡核苷酸分子就是我们需要的合成产物。合成产物可以用 HPLC或聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化。用固相方法曾经合成了长度达到100核苷酸的DNA链。 能够迅速合成各种序列的DNA链使我们能够开展很多研究。例如合成寡核苷酸的末端 用P或荧光基团标记可以用来搜寻很长DNA分子或含有很多染色体的基因组中某段互补 的DNA序列，用标记寡核苷酸作为探针使用很有效，也很普及。例如，能够与人色体上某 段序列互补的DNA探针可以用来探讨染色体上相邻DNA。用该探针作为引物进行PCR扩 增能获得相邻的DNA片段。DNA化学合成技术能够制造新基因。已经有很多实例利用合 成基因表达生产具有新特性的蛋白质。 聚合酶链式反应(PCR)能选择性扩增DNA序列 I984年Kary Mullis设计了聚合酶链式反应(PCR)扩增特意的DNA序列。DNA分子 是连续的DNA双链。我们所要扩增的DNA序列（即目标序列）两侧有非目标DNA序列。 如果目标序列两侧的DNA序列已知就能用PCR扩增制造大量的目标序列。在含有目标序 列的溶液中加入：(1)能够与两侧序列杂交的一对引物，(2)四种脱氧核苷三磷酸，和(3) 热稳定的DNA聚合酶。一轮PCR反应含有三个步骤（图5.7）。 1.链分离。将DNA溶液在95℃加热15S,亲本DNA分子双链分开，成为单链DNA。 2.引物杂交。将DNA溶液迅速冷却至54℃，使引物与DNA链杂交。一种引物与其中一 条DNA链目标序列的3'-端结合，另一种引物与另一条DNA链的3'-末端结合。由于引 物量比亲本DNA多很多，因此不会形成亲本DNA双链。 3.DNA合成。溶液加热至Taq DNA聚合酶最适温度，即72℃。Taq DNA polymerase是从 温泉生长微生物thumus aquaticus分离的。两条引物发生延伸（方向是5'-3")。两条引 物的延伸会超出目标序列。 Flanking sequence Target sequence Add excess primers Heat to separate strands 图5.7第一轮PCR扩增反应。一轮PCR反应含有三个步骤：链分离，引物杂交，和引物延 伸(DNA合成)。 这三个步骤一链分离、引物杂交、和链延伸一构成一轮PC℉扩增。改变混合物的温度 恩能够重复上述操作。DNA聚合酶的热稳定性是PCR反应在一支密闭试管内执行PCR操 作，每轮反应后不必添加试剂。第一轮扩增反应完成后，加热启动第二轮扩增，产生4个双 链。接着启动第三轮扩增（图5.8）。第三轮扩增的产物有两个短链（只含有目标序列和两侧由于所需产物连接在不溶性支持物上，只是在延伸结束后才从支持物释放出来，因此固 相方法是化学合成 DNA、多肽的理想途径。所有反应都在一个反应器中进行，可以加入过 量试剂驱使化学反应彻底进行。每步反应之后，可以洗去溶剂和副产物。反应结束后，用氨 水处理能够释放合成的寡核苷酸，并除去所有的保护基团。由于延伸反应不能超过 100%， 合成链的长度不一致。最长的寡核苷酸分子就是我们需要的合成产物。合成产物可以用 HPLC 或聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化。用固相方法曾经合成了长度达到 100 核苷酸的 DNA 链。 能够迅速合成各种序列的 DNA 链使我们能够开展很多研究。例如合成寡核苷酸的末端 用 32P 或荧光基团标记可以用来搜寻很长 DNA 分子或含有很多染色体的基因组中某段互补 的 DNA 序列，用标记寡核苷酸作为探针使用很有效，也很普及。例如，能够与人色体上某 段序列互补的 DNA 探针可以用来探讨染色体上相邻 DNA。用该探针作为引物进行 PCR 扩 增能获得相邻的 DNA 片段。DNA 化学合成技术能够制造新基因。已经有很多实例利用合 成基因表达生产具有新特性的蛋白质。 聚合酶链式反应（PCR）能选择性扩增 DNA 序列 1984 年 Kary Mullis 设计了聚合酶链式反应（PCR）扩增特意的 DNA 序列。DNA 分子 是连续的 DNA 双链。我们所要扩增的 DNA 序列（即目标序列）两侧有非目标 DNA 序列。 如果目标序列两侧的 DNA 序列已知就能用 PCR 扩增制造大量的目标序列。在含有目标序 列的溶液中加入：（1）能够与两侧序列杂交的一对引物，（2）四种脱氧核苷三磷酸，和（3） 热稳定的 DNA 聚合酶。一轮 PCR 反应含有三个步骤（图 5.7）。 1. 链分离。将 DNA 溶液在 95℃加热 15s，亲本 DNA 分子双链分开，成为单链 DNA。 2. 引物杂交。将 DNA 溶液迅速冷却至 54℃，使引物与 DNA 链杂交。一种引物与其中一 条 DNA 链目标序列的 3'-端结合，另一种引物与另一条 DNA 链的 3'-末端结合。由于引 物量比亲本 DNA 多很多，因此不会形成亲本 DNA 双链。 3. DNA 合成。溶液加热至 Taq DNA 聚合酶最适温度，即 72℃。Taq DNA polymerase 是从 温泉生长微生物 thumus aquaticus 分离的。两条引物发生延伸（方向是 5' - 3')。两条引 物的延伸会超出目标序列。 图 5.7 第一轮 PCR 扩增反应。一轮 PCR 反应含有三个步骤：链分离，引物杂交，和引物延 伸（DNA 合成）。 这三个步骤—链分离、引物杂交、和链延伸—构成一轮 PCR 扩增。改变混合物的温度 恩能够重复上述操作。DNA 聚合酶的热稳定性是 PCR 反应在一支密闭试管内执行 PCR 操 作，每轮反应后不必添加试剂。第一轮扩增反应完成后，加热启动第二轮扩增，产生 4 个双 链。接着启动第三轮扩增（图 5.8）。第三轮扩增的产物有两个短链（只含有目标序列和两侧