ATOGTGTCACCTAOAT AGCTTGGCG TAATCATGGTCATAGCT 00 110 120 困5.5荧光检测双脱氧法产生的寡核酸片段。四个链终止双脱氧核苷酸用不同颜色的荧光 标签标记（如红色标记T)。色谱图中一种颜色表示一种核苷酸。 固相自动法能合成DNA探针 如同多肽，依次添加活化单体至不溶性载体交联的生长链能够合成DNA链。活化单体 是质子化的脱氧核苷3-亚磷酰胺。第1步，加入的脱氧核苷3'-亚磷酰胺的3”磷原子与生长 链的5-0原子连接，形成亚磷酸三酯（图5.6)。加入的脱氧核苷3-亚磷酰胺5'OH被二甲 氧三苯甲基(DMT)保护，不参与这个连接反应。3”磷酰基与B-氛乙基(B-CE)结合，没有 反应活性。类似地，嘌呤和嘧啶碱基环上的氨基也需要保护。 Dimethoxytrityl DMT]group base(protected) CH B-Cyanoethyl Hz (BCE)group 一C CH NC一2 Aaoreneminu ” 在无水条件下进行缩合反应（因为水能够与亚磷酰胺发生反应）。第二步，用碘氧化亚 磷酸三酯，生成磷酸三酯(（五价磷)。第三步，二氯乙酸脱去生长链5OH的保护基团DMT, 但不影响其它保护基团。现在DNA合成已经完成一个核苷酸延长，可以进行下一轮操作。 每延长一个核苷酸耗时10分钟，延伸效率超过99%。 basen-1 basen basen-1 Activated monomer Growing chain hosphite triester intermediate by lz basen-1 ③ Deprotection cetic acid Elongated chain Phosphotriester intermediate 总 图5.6亚磷酸三酯法固相合成DNA链。加成到生长链的活化单体是脱氧核苷3'-亚磷酰胺， 其5-OH用DMT保护，3'磷氧原子用B-CE保护，还有一个保护基团保护碱基环上的胺基。图 5.5 荧光检测双脱氧法产生的寡核酸片段。四个链终止双脱氧核苷酸用不同颜色的荧光 标签标记（如红色标记 T）。色谱图中一种颜色表示一种核苷酸。 固相自动法能合成 DNA 探针 如同多肽，依次添加活化单体至不溶性载体交联的生长链能够合成 DNA 链。活化单体 是质子化的脱氧核苷 3'-亚磷酰胺。第 1 步，加入的脱氧核苷 3'-亚磷酰胺的 3'-磷原子与生长 链的 5'-O 原子连接，形成亚磷酸三酯（图 5.6）。加入的脱氧核苷 3'-亚磷酰胺 5'-OH 被二甲 氧三苯甲基（DMT）保护，不参与这个连接反应。3'-磷酰基与氰乙基（CE)结合，没有 反应活性。类似地，嘌呤和嘧啶碱基环上的氨基也需要保护。 在无水条件下进行缩合反应（因为水能够与亚磷酰胺发生反应）。第二步，用碘氧化亚 磷酸三酯，生成磷酸三酯（五价磷）。第三步，二氯乙酸脱去生长链 5'-OH 的保护基团 DMT， 但不影响其它保护基团。现在 DNA 合成已经完成一个核苷酸延长，可以进行下一轮操作。 每延长一个核苷酸耗时 10 分钟，延伸效率超过 99%。 图 5.6 亚磷酸三酯法固相合成 DNA 链。加成到生长链的活化单体是脱氧核苷 3'-亚磷酰胺， 其 5'-OH 用 DMT 保护，3'-磷氧原子用CE 保护，还有一个保护基团保护碱基环上的胺基