选择性终止复制能测定DNA序列 DNA序列测定技术也极大地促进了DNA结构和功能的研究。DNA序列测定的关键是 产生一组DNA片段，其长度取决于DNA序列最后一个核苷酸。Frederick Sanger及其同事 建立了Sanger双脱氧方法（即选择性终止复制）测定DNA序列的技术。与其他技术相比， Sanger双脱氧法简便，能够同时进行四种终止反应。在这些混合物中，DNA聚合酶用来制 造DNA单链模板的互补DNA序列。合成引物是化学合成的DNA片段，与模板分子的序列 已知区互补。除了四种脱氧核苷三磷酸（同位素标记）外，每个反应混合物都含有少量的一 种2,3双脱氧核苷三磷酸类似物，各个混合物所含的类似物不同。 DNA to be sequenced 3'—GAATTCGCTAATGG- 5'—CTTAA Primer DNA polymerase I Labeled dATP TTP dCTP,dGTP Dideoxy analog of dATP 3-GAATTCGCTAATGC 5-CTTAAGCGATTA + 3-GAATTCGCTAATGG 5'—CTTAAGCGA New DNA strands are separated and subjected to electrophoresis Figure 5-4 2',3'-Dideoxy analog 图5.4链终止法测定DNA序列的策略。一种2'3'-双脱氧核苷三磷酸加入DNA聚合酶促反 应混合物产生一组DNA片段，其3末端就是这种2'3-双脱氧核苷三磷酸。例如ddATP(红 色)产生的DNA片段，其末端都是ddA。由于缺乏3'OH,这种链不能继续延伸。 由于核苷类似物3'末端缺乏OH,这种类似物的参入能够阻止生长链进一步延长。双脱 氧类似物浓度要足够低，使生长链偶尔参入一个双脱氧核苷酸导致DNA合成终止。DNA 聚合酶有时参入正常的核苷酸，有时参入双脱氧核苷酸导致反应终止。例如，反应混合物含 有ddATP产生的合成DNA链长度不同，但是3'-端都是ddA(图5.4)。ddA参与的位点就是 待测核酸链的T。因此根据合成核酸链长度就能确定待测核酸链T的位置。一套（四种终止 混合物)双脱氧终止反应后，上样到凝胶的四个孔中电泳分离，从放射性自显影图谱能读出 待测核酸序列。 荧光检测的灵敏度很高，能够替代放射性同位素。每个双脱氧核苷酸连接一个荧光标签， 这样每种链终止反应就带有一种特异的荧光标签（例如蓝色荧光表示ddA,红色荧光表示 dC)。此时能够将四种终止反应混合物混在一起，进行聚合酶链终止反应。产物在一个上样 孔中进行凝胶电泳分离。条带泳动的先后次序表示DNA链的长度，条带的荧光颜色表示 DNA链的终止核苷酸，由此测定DNA链的核酸序列（图5.5)。这种方式能够测定长度达 到550核苷酸的DNA序列。荧光检测更好，这种方法不用放射性同位素，易于自动化检测。 实际上，现代DNA测序仪器采用这种方法每天能够测定的DNA序列超过1O0万碱基。选择性终止复制能测定 DNA 序列 DNA 序列测定技术也极大地促进了 DNA 结构和功能的研究。DNA 序列测定的关键是 产生一组 DNA 片段，其长度取决于 DNA 序列最后一个核苷酸。Frederick Sanger 及其同事 建立了 Sanger 双脱氧方法（即选择性终止复制）测定 DNA 序列的技术。与其他技术相比， Sanger 双脱氧法简便，能够同时进行四种终止反应。在这些混合物中，DNA 聚合酶用来制 造 DNA 单链模板的互补 DNA 序列。合成引物是化学合成的 DNA 片段，与模板分子的序列 已知区互补。除了四种脱氧核苷三磷酸（同位素标记）外，每个反应混合物都含有少量的一 种 2', 3'-双脱氧核苷三磷酸类似物，各个混合物所含的类似物不同。 图 5.4 链终止法测定 DNA 序列的策略。一种 2'3'-双脱氧核苷三磷酸加入 DNA 聚合酶促反 应混合物产生一组 DNA 片段，其 3'-末端就是这种 2'3'-双脱氧核苷三磷酸。例如 ddATP(红 色）产生的 DNA 片段，其末端都是 ddA。由于缺乏 3'-OH，这种链不能继续延伸。 由于核苷类似物 3'-末端缺乏 OH，这种类似物的参入能够阻止生长链进一步延长。双脱 氧类似物浓度要足够低，使生长链偶尔参入一个双脱氧核苷酸导致 DNA 合成终止。DNA 聚合酶有时参入正常的核苷酸，有时参入双脱氧核苷酸导致反应终止。例如，反应混合物含 有 ddATP 产生的合成 DNA 链长度不同，但是 3'-端都是 ddA(图 5.4）。ddA 参与的位点就是 待测核酸链的 T。因此根据合成核酸链长度就能确定待测核酸链 T 的位置。一套（四种终止 混合物）双脱氧终止反应后，上样到凝胶的四个孔中电泳分离，从放射性自显影图谱能读出 待测核酸序列。 荧光检测的灵敏度很高，能够替代放射性同位素。每个双脱氧核苷酸连接一个荧光标签， 这样每种链终止反应就带有一种特异的荧光标签（例如蓝色荧光表示 ddA, 红色荧光表示 ddC)。此时能够将四种终止反应混合物混在一起，进行聚合酶链终止反应。产物在一个上样 孔中进行凝胶电泳分离。条带泳动的先后次序表示 DNA 链的长度，条带的荧光颜色表示 DNA 链的终止核苷酸，由此测定 DNA 链的核酸序列（图 5.5）。这种方式能够测定长度达 到 550 核苷酸的 DNA 序列。荧光检测更好，这种方法不用放射性同位素，易于自动化检测。 实际上，现代 DNA 测序仪器采用这种方法每天能够测定的 DNA 序列超过 100 万碱基