(3)DNA的构象一般条件下超螺旋DNA的迁移率最快，线形DNA其次，开环形 最慢。但在胶中加入过多的啡啶溴红时，上述分布次序会发生改变： (4)电流一般不大于5Vm。有适当的电压差时，迁移率与电流大小成正比： (5)碱基组成有一定影响，但影响不大： (6)温度4~30℃都可，常为室温。 琼脂糖凝胶电泳常用于分析DNA。由于琼脂糖制品中往往带有核糖核酸酶杂质，因此 用于分析RNA时，必须加入蛋白质变性剂，如甲醛等。图4I0为分离后DNA与各种杂 质的分布 电泳完毕后，将胶在荧光染料啡啶溴红的水溶液中染色 (0.5μg/ml)。啡啶溴红为一扁平分子，很易插入DNA的 23130 碱基对之间。DNA与啡啶溴红结合后，经紫外光照射，可发 9419 射出红一橙色可见荧光。O.1μgDNA即可用此法检出，所以 6557 此法十分灵敏。根据荧光强度可以大体判断DNA样品的浓 4371 度。若在同一胶上加一已知其浓度的DNA作参考，则所测 得的样品浓度更为准确。可以用灵敏度很高的负片将凝胶上 所呈现的电泳图谱在紫外光照射下拍摄下来，作进一步分析 二8 与长期保留之用。 应用凝胶电泳可以正确地测定DNA片段的分子大小。 图4-11ADNA/HindlII片段 实用的方法是在同一胶上加一已知相对分子质量的样品（如 琼胎镇凝胶申泳图 图4-11中的入DNA/HindIII的片段)。电泳完毕后，经啡啶 溴红染色、照相，从照片上比较待测样品中的DNA片段与标准作品中的哪一条带最接近， 即可推算出未知样品中各片段的大小。最常用的方法是将胶上某一区带在紫外光照射下切 割下来，将切下的胶条放在透析袋中，装上电泳液，在水平电泳槽中进行电泳，让胶上的 DNA释放出来并进一步粘在透析袋内壁上，电泳3~4h后，将电极倒转，再通电30~60s, 粘在壁上的DNA重又释放到缓冲液中。取出透析袋内的缓冲液（丢弃胶条），用苯酚抽提 1~2次，水相用乙醇沉淀。这样回收的DNA纯度很高，可供进一步进行限制酶分析、序 列分析或作末端标记。回收率在50%以上。 2,聚丙烯酸胺疑胶电泳 以聚丙烯酰胺作支持物。单体丙烯酰胺在加入交联剂后就成了聚丙烯酰胺。由于这利 凝胶的孔径比琼脂糖胶的要小，所以可用于分析小于1OO0p的DNA片段。聚丙烯酰胺中 般不含有RNase, 所以可用于RNA的分析 聚丙烯酰胺凝胶上的核酸样品，经非定限红染色，在紫外光照射下，发出的荧光很弱， 所以浓度很低的核酸样品用此法检测不出来。 三、核酸的紫外吸收 嘌吟碱与嘧啶碱具有共轭双健，使碱基、核苷、核苷酸和核酸在240~290m的紫外 波段有一强烈的吸收峰，最大吸收值在260m附近。不同核苷酸有不同的吸收特性。所 以可以用紫外分光光度计加以定量及定性测定。 实验室中最常用的是定量测定少量的DNA或RNA。检验待测样品是否纯品可用紫外 -91－91－ （3）DNA 的构象 一般条件下超螺旋 DNA 的迁移率最快，线形 DNA 其次，开环形 最慢。但在胶中加入过多的啡啶溴红时，上述分布次序会发生改变； （4）电流 一般不大于 5V/cm。有适当的电压差时，迁移率与电流大小成正比； （5）碱基组成 有一定影响，但影响不大； （6）温度 4～30℃都可，常为室温。 琼脂糖凝胶电泳常用于分析 DNA。由于琼脂糖制品中往往带有核糖核酸酶杂质，因此 用于分析 RNA 时，必须加入蛋白质变性剂，如甲醛等。图 4-10 为分离后 DNA 与各种杂 质的分布。 电泳完毕后，将胶在荧光染料啡啶溴红的水溶液中染色 （0.5μg／ml）。啡啶溴红为一扁平分子，很易插入 DNA 的 碱基对之间。DNA 与啡啶溴红结合后，经紫外光照射，可发 射出红—橙色可见荧光。0.1μgDNA 即可用此法检出，所以 此法十分灵敏。根据荧光强度可以大体判断 DNA 样品的浓 度。若在同一胶上加一已知其浓度的 DNA 作参考，则所测 得的样品浓度更为准确。可以用灵敏度很高的负片将凝胶上 所呈现的电泳图谱在紫外光照射下拍摄下来，作进一步分析 与长期保留之用。 应用凝胶电泳可以正确地测定 DNA 片段的分子大小。 实用的方法是在同一胶上加一已知相对分子质量的样品（如 图 4-11 中的λDNA／HindIII 的片段）。电泳完毕后，经啡啶 溴红染色、照相，从照片上比较待测样品中的 DNA 片段与标准作品中的哪一条带最接近， 即可推算出未知样品中各片段的大小。最常用的方法是将胶上某一区带在紫外光照射下切 割下来，将切下的胶条放在透析袋中，装上电泳液，在水平电泳槽中进行电泳，让胶上的 DNA 释放出来并进一步粘在透析袋内壁上，电泳 3～4h 后，将电极倒转，再通电 30～60s， 粘在壁上的 DNA 重又释放到缓冲液中。取出透析袋内的缓冲液（丢弃胶条），用苯酚抽提 1～2 次，水相用乙醇沉淀。这样回收的 DNA 纯度很高，可供进一步进行限制酶分析、序 列分析或作末端标记。回收率在50％以上。 2．聚丙烯酸胺凝胶电泳 以聚丙烯酰胺作支持物。单体丙烯酰胺在加入交联剂后就成了聚丙烯酰胺。由于这种 凝胶的孔径比琼脂糖胶的要小，所以可用于分析小于 1000bp 的 DNA 片段。聚丙烯酰胺中 一般不含有 RNase，所以可用于 RNA 的分析。 聚丙烯酰胺凝胶上的核酸样品，经啡啶溴红染色，在紫外光照射下，发出的荧光很弱， 所以浓度很低的核酸样品用此法检测不出来。 三、核酸的紫外吸收 嘌呤碱与嘧啶碱具有共轭双键，使碱基、核苷、核苷酸和核酸在 240～290 nm的紫外 波段有一强烈的吸收峰，最大吸收值在 260 nm 附近。不同核苷酸有不同的吸收特性。所 以可以用紫外分光光度计加以定量及定性测定。 实验室中最常用的是定量测定少量的 DNA 或 RNA。检验待测样品是否纯品可用紫外 图 4-11 λDNA／HindIII 片段 琼脂糖凝胶电泳图